Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (иПСК) были впервые получены в 2007 г. [1]. иПСК схожи с эмбриональными стволовыми клетками и способны дифференцироваться в самые различные типы клеток. Поскольку иПСК могут быть получены из легкодоступных соматических клеток пациентов (например, фибробластов кожи или мононуклеарных клеток периферической крови), их использование решает важные методические и этические проблемы, например, доступности нейрональных клеток. иПСК представляют собой крайне интересную модель для фундаментальных исследований дифференцировки и де-дифференцировки клеток человека, а также имеют большой практический потенциал для медицины. Человеческие иПСК могут быть использованы для получения клеток разных типов и, потенциально, для их последующей трансплантации  пациентам [2]. Многие проблемы на пути к этому (например, неполная дифференцировка человеческих иПСК и образование тератом) пока не решены и требуют дальнейшего изучения. Не менее важным направлением использования иПСК является тестирование лекарственных средств на клетках человека, в том числе для подбора схемы лечения индивидуальных пациентов (персонализированная медицина) [3, 4]. Используя иПСК пациентов, полученные из соматических клеток, исследователи с помощью дифференцировки могут получить изогенные линии клеток, в которых воспроизводятся механизмы заболевания, и использовать их для скрининга лекарств. Так, иПСК пациентов после дифференцировки в нейроны или клетки глии используют в изучении нейродегенеративных заболеваний [5, 6].  

Дифференцировка иПСК в нейроны может быть достигнута за счет использования двух групп методов: 1) химической индукции; 2) генетически опосредованной индукции [7]. В первом случае для запуска дифференцировки обычно используют смесь низкомолекулярных ингибиторов и пептидов, подавляющих экспрессию пронейрональных факторов роста, а также молекулярные пути, которые индуцируют т. е. нейрональную индукцию. Хорошо известным примером этого является процедура двойного ингибирования SMAD [8]. Целью генетически опосредованной индукции является введение в клетку кДНК, кодирующей ген транскрипционного фактора, специфичного для программы нейронной дифференцировки (например, нейрогенин-2), или регуляторные последовательности, такие как промоторы и энхансеры [9]. Однако обе стратегии позволяют дифференцировать иПСК в нейроны не менее чем за две недели.

В 2021 г. была опубликована новаторская работа, авторы которой предложили новый метод направленной дифференцировки иПСК в нейроны с использованием гиперэкспрессии транскрипционного фактора ATOH1 [10]. Новый подход превосходит ранее используемые методы по скорости и простоте работы, и позволяет достигать дифференцировки (до 99%) в течение всего нескольких дней в стандартной среде.

Целью данной работы было получение линии иПСК, несущей ген транскрипционного фактора ATOH1 под контролем системы индукции экспрессии Tet-One и флуоресцентного белка TagBFP2 в качестве селективного маркера.  В задачи работы входило получение стабильной линии иПСК, в которой можно индуцировать процесс дифференцировки в нейронном направлении добавлением в ростовую среду доксициклина. Данная линия клеток может быть использована в ходе различных исследований, в том числе в анализе межклеточной гетерогенности иПСК, разработке генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров, а также тестировании новых лекарственных средств на клетках человека и подбора схемы лечения индивидуальных пациентов (разработка протоколов персонализированной медицины). 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование

Нуклеотидную последовательность транскрипционного фактора ATOH1 амплифицировали из плазмиды Addgene pTet-O-ATOH1-T2A-PuroR (Addgene #162342) с помощью праймеров ATOH1 for ATATGAAGACTTGATCATGTCCCGCCTGCTGCATGCAGAAGAG и ATOH1 rev ATATGAAGACAAACCTCTAGAACTTGCCTCATCCGAGTCACTGTAATGGGAATG. Далее ATOH1 был вставлен вместе с TagBFP2 в лентивирусный вектор pRRLSIN.cPPT.EF1 по BamH1 и EcoR1 (Thermo Scientific, Waltham, MA; USA) рестриктазным сайтам. Для амплификации TagBFP2 использовали следующие праймеры TagBFP2 for ATATG AAGACGGAGGTGTGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGC и TagBFP2 rev GCATGAAGACATTCGATCATCACTTGTGCCCCAGTTTGCTAGGGAGGTCGCAGTATCTGGCC. Фьюз ATOH1 и TagBFP2 был осуществлен с использованием расщепляемого пептида T2A GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP. Лентивирусный вектор pRRLSIN.cPPT.EF1 был любезно предоставлен доктором Д. Троно (Лозанна; Швейцария). Затем ДНК ATOH1-t2a-TagBFP2 была перенесена в вектор pLVX-TetOne-Puro (Clontech, #631847; США) по сайтам рестрикции BamH1 и Age1 (Thermo Scientific, Waltham, MA; США). Для лигирования «липких» концов использовали Т4 ДНК лигазу («Евроген»; Россия).

Работа с клеточными линиями

Клетки линии HEK293T культивировали при 37 °C (5% CO₂) в среде DMEM («ПанЭко»; Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (BioSera, Nuaille; Франция), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина («ПанЭко»; Россия).

Клеточная линия иПСК iPS-KYOU была приобретена в банке клеток ATCC (KYOU-DXR0109B, ATCC® ACS1023™). ИПСК культивировали в среде mTeSR (StemCell Technologies; США) при 37 °C (5% CO₂) с ежедневной сменой среды для оптимального роста и Matrigel (Corning; США) в качестве матрицы для поверхностного покрытия. Accutase (StemCell Technologies; США) использовали для открепления клеток от поверхности матраса.

Создание стабильной клеточной линии

Клеточную линию иПСК TetOne-ATOH1-t2a-TagBFP2 получали с помощью лентивирусной трансдукции. За 24 ч до трансфекции 1,5 × 10⁶ клеток HEK293T высевали в чашку для культивирования диаметром 60 мм. Всего для трансфекции использовали 2 мкг плазмиды pR8.91, 0,6 мкг плазмиды pMD.G и 6 мкг плазмиды TetOne-ATOH1-t2aTagBFP2. Для транзиентной трансфекции клеток HEK293T использовали реагент Трансфектин (ИБХ РАН; Москва, Россия) в соотношении 2,5 мкл реагента на 1 мкг плазмиды. Смесь ДНК и трансфектина инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем добавляли по каплям. Через 4 ч среду заменяли 2 мл свежей DMEM. На следующие сутки среду, содержащую собранные лентивирусы, фильтровали (фильтр с размером пор 0,45 мкм) и концентрировали ультрацентрифугированием при 100 000 g (Beckman; США) при 4 °С в течение 3 ч. Осадок ресуспендировали в 500 мкл mTeSR (StemCell Technologies; США) и использовали для трансдукции клеток иПСК. Для создания стабильных клеточных линий лентивирусные частицы добавляли к 1 × 10⁵ иПСК. Затем трансдуцированные клетки селективно отбирали с помощью добавления в ростовую среду антибиотика пуромицина (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; США) с финальной концентрацией 5 мкг/мл.

Иммуноокрашивание фиксированных клеток

Клетки были посажены и выращены, как описано выше, зафиксированы в 4% формальдегиде в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, промыты три раза в PBS, пермеабилизация была обеспечена в течение 20 мин в 0,1% Triton X-100 (Helicon; США) в PBS, и инкубированы в течение 1 ч с 1% BSA (Sigma; США) в PBS для блокировки. Инкубацию первичными антителами проводили 1 ч, инкубацию вторичными антителами проводили в течение часа при комнатной температуре. Клетки промывали PBS и изображали в среде для изображения с помощью микроскопа BZ-9000 (Keyence, Осака; Япония). Использовали следующие антитела: Rabbit anti-TUBB3 и Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 (ThermoFisher, Waltham, MA; США), в разведении 1 : 500 и 1 : 1000 соответственно.

Флуоресцентная микроскопия живых клеток

При проведении экспериментов по визуализации живых клеток клетки культивировали в конфокальных чашках со стеклянным дном (SPL Life Sciences; Корея). Непосредственно перед микроскопией среду mTESR заменяли на среду для визуализации MEM («ПанЭко»; Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (BioSera, Cholet; Франция) и 20 мМ HEPES (Corning, NY; США).

Для in vivo флуоресцентной микроскопии использовали флуоресцентный микроскоп Keyence Biorevo BZ-9000 (Keyence; Япония). Клетки снимали при увеличении ×60, используя объектив CFI Plan Apo ×60xH/NA1.40. Съемки вели в синем канале, используя фильтр-куб DAPI (возбуждение 360/40 нм, испускание 460/50 нм) для детекции флуоресценции TagBFP.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При создании наиболее эффективной модели для запуска дифференцировки иПСК в нейронные клетки мы использовали подход, опубликованный в 2021 г. группой Дж. Чёрча [10]. В данной работе был проведен масштабный скрининг трех линий иПСК человека и показано, что транскрипционный фактор ATOH1 является наиболее эффективным драйвером индукции нейронной дифференцировки. В отличие от других путей дифференцировки иПСК в нейроны, ATOH1индуцируемая дифференцировка не требует специальных сред и дополнительных факторов, а также данный процесс протекает в кратчайшие сроки (4 дня). Для создания наиболее биологически релевантной модели ATOH1-опосредованной нейрональной дифференцировки мы решили сконструировать стабильную линию иПСК, несущую ген ATOH1 под индуцируемым промотором TRE3Gs. Для этого мы создали лентивирусную плазмиду с индуцируемой экспрессией ATOH1 (рис. 1). Данная плазмида включает в себя три независимые экспрессионные кассеты:

TRE3G promoter-ATOH1-t2a-TagBFP2 — ген АТОН1 находится под тетрациклиновым промотором и в одной рамке считывания с маркером экспрессии (слит) с маркером экспрессии — флуоресцентным белком TagBFP2 посредством Т2А-пептида. Индукция экспрессии ATOH1-t2a-TagBFP2 осуществляется при добавлении в ростовую среду доксициклина;

hPGK promoter-TetOn3G — TetOn3G, ген активатора тетрациклинового промотора TetOn находится под контролем промотора hPGK;
SV40 promoter-PuroR — обеспечивает экспрессию пуромицина, необходимую для селективного отбора иПСК, несущих только целевую конструкцию.

Данную генетическую конструкцию, получившую название TetOne-ATOH1-t2a-TagBFP2, использовали для создания лентивирусных частиц и заражения клеточной линии iPS-KYOU (рис. 2А). Далее клетки подвергали селекции на среде с пуромицином, после чего добавляли доксициклин для активации тетрациклинового промотора. Спустя 24 ч после добавления доксициклина мы зафиксировали слабую флуоресценцию синего белка TagBFP2, что свидетельствует о начальной стадии экспрессии фактора ATOH1. На вторые сутки сигнал был сильным и хорошо детектируемым на флуоресцентном микроскопе, отмечено изменение морфологии клеток на нейроноподобную (рис. 2Б; вверху).

Эффективность дифференцировки оценивали с помощью иммунохимической окраски на наличие экспрессии маркера нейральных стволовых клеток — βIII-тубулина (TUBB3) (рис. 3А). Мы показали гетерогенность полученной при дифференцировке культуры клеток по экспрессии TUBB3: часть клеток с флуоресценцией TagBFP2 не экспрессировала TUBB3 и не имела морфологических признаков, специфичных для нейронного направления (рис. 3Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Созданная клеточная линия TetOne-ATOH1-t2aTagBFP2 демонстрировала успешную возможность индуцируемого запуска экспрессии на 1–2 сутки после начала эксперимента. Однако экспрессия синего белка, отражающая количество белка ATOH1 в клетке, была неоднородной (рис. 2Б, внизу; рис. 3Б). Возможно, данный феномен мы наблюдали ввиду гетерогенности исходной клеточной линии иПСК, а также ввиду отсутствия клональной селекции трансдуцированных клеток в данном эксперименте. Мы также предполагаем, что в клетках иПСК может происходить со временем метилирование тетрациклинового промотора и/или hPGK промотора, что ведет к снижению белка активатора тетрациклинового промотора, а суммарным эффектом данных процессов является снижение экспрессии ATOH1-t2a-TagBFP2. Действительно, после разморозки новой аликвоты линии TetOne-ATOH1-t2a-TagBFP2 и повтора эксперимента мы обнаружили, что количество клеток, экспрессирующих TagBFP2, снизилось (рис. 2В).

ВЫВОДЫ

Применение нового метода направленной дифференцировки иПСК в нейронном направлении позволяет быстро (за 4 дня) получать популяции обогащенных дифференцированными в нейронном направлении клетками. Созданная клеточная линия с экспрессией ATOH1 под контролем индуцируемого промотора        TRE3Gs пригодна к использованию в экспериментах, требующих быстрой дифференцировки иПСК, однако предполагается проведение непрерывного эксперимента (отсутствия циклов замораживания и выведения из заморозки клеток), что является ограничением данного метода при получении экспериментальных данных.