Ядрышко представляет собой внутриядерный компартмент, играющий ключевую роль в регуляции клеточного цикла, биогенезе рибосом, активности теломеразы, метаболизме р53 и процессинге малых РНК. Тем не менее, основная роль ядрышка — биогенез рибосом — один из наиболее энергоемких и жестко регулируемых процессов в клетке [1]. Подавление транскрипции рРНК гена связано с уменьшением размера ядрышек, и, как следствие, с уменьшением скорости синтеза белка и роста клеток [2, 3]. В опухолевых клетках морфология ядрышка меняется, а именно: происходит увеличение размеров и аномально стимулированных функций, изменение молекулярных путей таких супрессоров опухоли, как pRb, p53, c-Myc, циклин D1, NF-kB, ErbB3, BCL-2, RAD51 и BCL-2 [4–8]. Для терапии гематологических раковых заболеваний разрабатываются различные терапевтические стратегии [9-11], в основе которых лежит таргетное воздействие на ядрышко, включая использование селективных ингибиторов РНК Pol I, mTOR, AKT и т. д. [9] при немелкоклеточном раке легкого [12], раке почки, раке молочной железы, лимфоме [13] и др. Таким образом, мониторинг и визуализация ядрышка могут быть важны при разработке новых химиотерапевтических агентов, а также при изучении их потенциальных побочных эффектов.

Наиболее распространенным способом визуализации ядрышка является иммунофлуоресцентное окрашивание антителами, специфичными к ядрышковым белкам [14]. Основным недостатком данного метода является невозможность его использования для изучения динамических процессов в клетках. Удобным способом прижизненной визуализации ядрышек может быть флуоресцентная микроскопия из-за ее относительной простоты и возможности применения пространственновременного анализа флуоресцентных изображений [15]. Недавно был разработан флуоресцентный зонд для одновременной визуализации митохондрий и ядрышек, содержащий два эмиссионных металлокомплекса на основе пиразола, связанного трифенилфосфином, связанным с медью (C1 и C2) [16]. Другая группа создала аналогичный двойной флуоресцентный зонд, нацеленный на митохондрии и ядрышки. Синтезированная молекула основана на 9-(дициановинил)юлолидиновом (DCVJ) роторе и проявляла минимальную цитотоксичность [17].

Таким образом, все вышеперечисленные методы подходят для живой визуализации клетки, что важно для мониторинга клеточного ответа на различные стимулы. Ключевым недостатком таких методов является невозможность наблюдения за клетками в течение длительного времени, так как флуоресцентный краситель со временем разрушается и не передается дочерним клеткам. Для решения этой проблемы можно использовать генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, сочетающие в себе высокую гибкость, специфичность и подходящие для различных биологических систем. В большинстве случаев флуоресцентные биосенсоры малотоксичны и не мешают нормальным физиологическим процессам, что позволяет осуществлять мониторинг живых клеток в режиме реального времени. Еще одним преимуществом флуоресцентных анализов является то, что они требуют меньше времени, чем большинство анализов с фиксированными клетками [18]. Недавно для создания нового типа флуоресцентных сенсоров была разработана оптогенетическая система для светоиндуцированного белок-белкового взаимодействия под названием enhanced Magnets (eMags) [19]. Данная система фотодимеризующихся белковых доменов создана на основе фоторецептора Vivid (VVD) из Нейроспоры густой (Neurospora crassa). Под воздействием синего света мономер VVD претерпевает конформационные изменения, что приводит к формированию димера, и следовательно, делает возможной обратимую светозависимую димеризацию изучаемых белков.

В данной работе описана новая генетически кодируемая система флуоресцентных сенсоров (light-activated nucleolus sensors, LANS) для визуализации ядрышка в реальном времени. LANS использует преимущества светозависимой димеризации системы eMags, что позволяет использовать данный сенсор для светоиндуцируемого рекрутирования целевых белков. Сенсоры LANS могут быть полезны для проведения биомедицинских исследований, а именно тестирования препаратов, оказывающих влияние на ядрышки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование

Все плазмиды были созданы с использованием системы клонирования Голден Гейт (Golden Gate cloning system) [20] и набора векторов для клонирования MoClo Toolkit (AddGene Kit #1000000044). Последовательности eMagA и eMagB были взяты из статьи [19] и синтезированы фирмой «Клонинг Фасилити» (Москва, Россия) в векторе pAGM1301. Последовательность DPF3 была амплифицирована с использованием праймеров DPF3_CCAT_FOR gttaGAAGACatCCATgggaacagtcattcccaataactactgtgacttctgcttggggggctccaacatgaacaagaagagtgggcggcc и DPF3_AATG_REV gttaGAAGACatCATTGTGGCGACCGGTCCGGATCCGCCCCCGCCGCTtttgagcagttcccag, добавляющих в последовательность сайт рестрикции BpiI, далее была клонирована в вектор pAGM1276. Для сборки итоговых плазмид eMagB-mScarlet и DPF3-mNeonGreen-eMagA использовалась технология MoClo и вектор pICH47732 согласно протоколу, описанному в [20]. Для клонирования использовались рестриктазы BpiI (BbsI) и Eco31I (BsaI) (Thermo Scientific, Waltham, MA; USA), и лигаза фага T4 (Евроген; Россия).

Ведение и трансфекция клеточной культуры

Клетки линии HEK293T культивировали при 37 °C (5% CO₂) в среде DMEM («ПанЭко»; Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (BioSera; Франция), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина («ПанЭко»; Россия).

Для проведения трансфекции культуру клеток HEK293 растили в среде DMEM-full на 35 мм чашках Петри со стеклянным дном (SPL Life Sciences; Корея). Для трансфекции использовался реактив GenJect-39 («Молекта»; Россия) согласно инструкции производителя.

Флуоресцентная микроскопия живых клеток

При проведении экспериментов по визуализации живых клеток клетки культивировали в конфокальных чашках со стеклянным дном (SPL Life Sciences; Корея). Непосредственно перед микроскопией среда DMEM заменялась на среду для визуализации MEM («ПанЭко»; Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (BioSera; Франция) и 20 мМ HEPES (Corning; NY, USA).

Для in vivo флуоресцентной микроскопии использовали флуоресцентный микроскоп Keyence Biorevo BZ-9000 (Keyence; Япония). Клетки снимали при увеличении 60x, используя объектив CFI Plan Apo λ60xH/NA1.40. Съемки вели в двух каналах: зеленом (фильтр-куб GFP-B, возбуждение 480/30 нм) для облучения клеток синим светом на протяжении 200 мс и красном (фильтр-куб Texas Red, возбуждение 560/40 нм, испускание 630/75 нм) для детекции флуоресценции eMagB-mScarlet.

Анализ изображений

Для расчета отношения флуоресценции ядрышко/ цитоплазма во времени использовался инструмент «ROI Manager» программного обеспечения Fiji. Первый ROI устанавливался вручную в область ядрышка, второй ROI устанавливался в область цитоплазмы в той же клетке. Значения, соответствующие соотношению ядрышко/ цитоплазма (интенсивность флуоресценции, рисунок), были получены путем деления ROI 1 на ROI 2, а затем деления полученного значения на значение, соответствующее изображению ядра до облучения. График построен с помощью GraphPad Prism 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для визуализации ядрышка мы создали систему генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров (LANS), представляющую собой пару фотодимеризующейся зондов LANS1 и LANS2. LANS1 включает в себя последовательность PHD-домена белка DPF3, слитую с зеленым флуоресцентным белком mNeonGreen, сигналом ядерной локализации (NLS) и последовательностью фотодомена eMagA (рисунокА, верхняя панель). eMagA является частью светозависимой системы enhanced Magnets (eMags), созданной на основе фоторецептора Vivid (VVD) из Нейроспоры густой (Neurospora crassa) [19]. Парой к созданному сенсору LANS1 является плазмида LANS2, экспрессирующая фотодомен eMagB, красный флуоресцентный белок mScarlet (рисунокА, нижняя панель). В свою очередь, DPF3 представляет собой домен, афинный к модификации гистона H3K4me1 в его димерном состоянии, однако в нашей лаборатории было экспериментально показано, что продукт сенсора на основе DPF3 в мономерной форме может накапливаться в ядрышке (рисунокВ). Одновременное использование в эксперименте молекулярных конструкций с DPF3-mNeonGreen-eMagA и mScarlet-eMagB позволило осуществить обратимую светозависимую гетеродимеризацию целевых белков при кратковременном облучении синим светом (рисунокБ).

Чтобы доказать обратимость связывания LANS с ядрышком, мы сначала облучали клетки, экспрессирующие LANS, на протяжении 200 мс, а затем инкубировали клетки в темноте. Подсчет относительного изменения флуоресценции до и после облучения показал, что транслокация пробы из ядрышек в нуклеоплазму происходит примерно в течение 60 с (рисунокГ).

Таким образом, мы показали, что созданная система сенсоров LANS может быть использована для обратимой светозависимой визуализации ядрышкового компартмента клетки. Комбинация LANS1, имеющего сродство к белкам ядрышек, и LANS2, находящегося в цитоплазме, позволила рекрутировать LANS2 в ядрышковые области посредством облучения клетки короткими импульсами синего света. Сенсор LANS может быть использован для изучения динамики ядрышка и направленного транспорта целевой ДНК в ядрышко.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ядрышко представляет собой динамичный субъядерный компартмент, организованный посредством разделения фаз, участвующий в синтезе рибосомной РНК, процессинге и сборке рибонуклеопротеинов для биогенеза рибосом. Также изменения в структуре ядрышка могут быть связаны со старением и играть роль в развитии различных патологий человека, включая рак и нейродегенерацию [21]. На разработку систем доставки целевых белков в ядрышко с использованием оптогенетических технологий направлены усилия многочисленных лабораторий во всем мире [22]. Подобные системы основаны на использовании фоточувствительных белков, которые под воздействием света с определенной длиной волны претерпевают конформационные изменения и димеризуются, тем самым сближая целевые белки. Фотодимеризующиеся домены успешно используются исследователями для манипуляции различными клеточными процессами, такими как сигнальные пути [23, 24], транспорт клеточных органелл [25, 26], ядерно-цитоплазматический транспорт [27, 28], динамика цитоскелета [29], фазовая сепарация [30, 31].

Полученные в данной работе результаты, свидетельствующие о возможности осуществлять светоидуцированный таргентинг в ядро, вполне согласуются с данными, полученными в других лабораториях. Например, фотоиндуцируемый сигнал ядерной локализации LINuS позволил исследователям транслоцировать белок mCherry из цитоплазмы в ядро, увеличив его представленность в ядре примерно в 1,8 раза [32], в то время как созданная нами система LANS позволила увеличить представленность пробы LANS2 в ядрышке в 1,5 раза относительно значений интенсивности флуоресценции, полученных до облучения ядрышка. Таким образом, данная система сенсоров может быть полезна для светоиндуцируемого рекрутирования целевых белков в ядрышко.

ВЫВОДЫ

В данной работе описана принципиально новая генетически кодируемая светоиндуцируемая система сенсоров LANS с минимальным уровнем токсического воздействия на клетки, объединившая подходы по созданию генетически кодируемых сенсоров для картирования ядрышка с методом оптогенетики. Благодаря светозависимой гетеродимеризации фотодоменов eMagA и eMagB в составе системы сенсоров мы наблюдали перемещение пробы LANS2 из цитоплазмы и визуализацию ядрышкового компартмента клетки. Стоит отметить, что отношение интенсивности флуоресценции ядрышко/цитоплазма до и после облучения не очень высокое (рисунокГ), что может быть объяснено слишком высоким уровнем экспрессии сенсоров LANS1 и LANS2 в данном эксперименте. Эта проблема может быть решена в дальнейшем путем подбора оптимальных концентраций сенсоров или созданием стабильной клеточной линии, экспрессирующей сенсоры.