В настоящее время множественная антимикробная резистентность бактериальных инфекционных агентов представляет серьезную угрозу для мирового здравоохранения. Нерациональное применение антимикробных препаратов для лечения людей, использование их в животноводстве и сельском хозяйстве — определяющие факторы широкого распространения лекарственной устойчивости у бактерий [1–3].

Селективное давление антимикробных препаратов на бактериальную популяцию способствует реализации различных механизмов резистентности, которые возникают в результате приобретения генетических детерминант устойчивости или спонтанных мутаций [1, 4–6]. Изучение эволюционных преобразований в бактериальных геномах, связанных с антибиотикорезистентностью, способствует оптимизации терапевтических стратегий и профилактических мер. 

На сегодняшний день увеличение роли представителей нормальной микрофлоры, в частности представителей рода Corynebacterium, в инфекционной патологии также может быть связано с распространением в геномах бактерий генов антимикробной устойчивости. Все более частое выделение коринебактерий в качестве патогенов, особенно у людей с ослабленным иммунитетом, свидетельствует о повышении их роли в развитии инфекционных осложнений у пациентов [2].

Особое значение в развитии инфекций имеют следующие виды коринебактерий: C. amycolatum (инфекции кожи и мягких тканей, бактериемия, эндокардит, инфекции половой системы), C. urealyticum (острые и хронические инфекции мочевыводящих путей, мочекаменная болезнь), C. striatum (истинная бактериемия, колонизация протезов, катетеров, дыхательных трубок и т. д.), C. jeikeium (бактериемия, эндокардиты, пневмонии, инфекции кожи и мягких тканей), C. aurimucosum (острые или хронические инфекции суставов, инфицирование ран диабетической стопы), C. genitalium (инфекции мочеполовых путей) [2, 3, 5, 7–14]. Стоит отметить множественную лекарственную устойчивость некоторых видов коринебактерий к β-лактамам, макролидам, аминогликозидам, хинолонам, тетрациклинам и рифампицинам, линкозамидам и др. [1, 4, 12–14].

Тем не менее, данные о резистентности коринебактерий к лекарственным средствам разноречивы, в этой связи целью исследования стало проведение биоинформатического анализа спектра генов устойчивости к антимикробным препаратам в опубликованных геномах некоторых представителей рода Corynebacterium.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали данные о нуклеотидных последовательностях полных геномов 22 штаммов 6 видов коринебактерий (C. amycolatum, C. urealyticum, C. striatum, C. jeikeium, C. aurimucosum, C. genitalium), представленных в свободном доступе в NCBI GenBank, выделенных на территории различных стран и в разные годы (табл. 1).

Биоинформатический анализ полногеномных последовательностей с целью поиска генов антимикробной устойчивости в указанных геномах осуществляли с помощью онлайн-ресурса PATRIC (Pathosystems Resource Integration Center) с использованием комплексной базы данных по исследованиям антибиотиков (Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD) и базы данных устойчивых к антибиотикам организмов (Database of Antibiotic-Resistant Organisms, NDARO) [15].

Аминокислотные последовательности гена gyrA были взяты из репозитория Genbank. Для анализа аминокислотных последовательностей гена gyrA использовали программное обеспечение UGENE (Unipro UGENE) 48.1 [16]. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы MUSCLE, интегрированной в UGENE.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе проведенного биоинформатического анализа было установлено, что представленные геномы в различных комбинациях содержали гены устойчивости к антимикробным препаратам. Всего было определено 25 разных генов, кодирующих устойчивость к лекарственным средствам антимикробной направленности (табл. 2).

Стоит отметить, что значительно реже в геномах изучаемых изолятов встречались гены (табл. 3):

1. tetO (tetW) (кодирует устойчивость к тетрациклинам) — отсутствовал в геноме 19 штаммов (86,4%);
2. aph (3')-I, aph (6)-Ic (кодируют устойчивость к аминогликозидам) — отсутствовали в геноме 14 штаммов (63,6%);
3. ermX (кодирует устойчивость к макролидам, линкозамидам, стрептограминам) — отсутствовал в геноме 13 штаммов (59%);
4. lsu (rplF) (кодирует устойчивость к фузидиевой кислоте) — отсутствовал в геноме 12 штаммов (54,5%);
5. cmx (кодирует устойчивость к хлорамфениколу) — отсутствовал в геноме 8 штаммов (36,4,3%);
6. ispC (dxr) (кодирует устойчивость к фосфомицину) — отсутствовал в геноме 7 штаммов (32%);
7. gibB (кодирует устойчивость к аминогликозидам), oxyR (кодирует устойчивость к изониазиду), fabG (кодирует устойчивость к триклозану) — отсутствовали в геномах 1 штамма (4,5%) (Corynebacterium striatum 824M, Corynebacterium striatum 1197, Corynebacterium striatum 708C соответственно).

Вместе с тем, устойчивость к аминогликозидам, фузидиевой кислоте, фосфомицинам кодировалась несколькими генами, в этой связи отсутствие в геноме одного из генов не может быть свидетельством чувствительности изолята к данным антимикробным веществам.

Все остальные гены, представленные в табл. 2, встречались в геномах 22 штаммов коринебактерий в 100% случаев.

Штаммом, содержащим 24 из 25 обнаруженных генов антимикробной резистентности, был C. striatum 2308. В его геноме отсутствовал только ген tetO (tetW). По литературным данным известно, что штамм был выделен в 2011 г. из гемокультуры мужчины, который находился на лечении в больнице Рио-де-Жанейро. По фенотипической характеристике был чувствителен только к тетрациклину (МПК 1 мг/л), линезолиду (МИК 0,25 мг/л) и ванкомицину (МИК 0,5 мг/л) [12]. Данные биоинформатического анализа, полученные нами, подтвержают результаты фенотипического исследования [12]: отсутствие гена tetO (tetW) (устойчивость к тетрациклинам), отсутствие генов устойчивости к оксазолидонам (линезолид) и гликопептидам (ванкомицин). Стоит отметить, что генов резистентности к линезолиду и ванкомицину не было обнаружено ни у одного исследуемого штамма. Однако авторы указывают, что фенотипически данный штамм был устойчив к эритромицину (МИК > 256 мг/л) и клиндамицину (МПК > 256 мг/л), гентамицину (аминогликозид) (МИК 256 мг/л) [12]. Такие фенотипические проявления могут быть обусловлены присутствием генов ermX и aph (3')-I, aph (6)-Ic.

Еще одним штаммом, в геноме которого отсутствовал лишь ген ispC (dxr) (устойчивость к фосфомицинам), стал Corynebacterium amycolatum ICIS 9, выделенный из влагалища здоровой женщины в 2017 г. в России. Вместе с тем, устойчивость к фосфомицинам кодируется еще и геном murA, который присутствовал в геноме. Corynebacterium amycolatum ICIS 9 авторы публикации рассматривали в качестве возможного пробиотического препарата при лечении дисбиоза влагалища [9–11]. Была установлена фенотипическая устойчивость Corynebacterium amycolatum ICIS 9 к антимикробным препаратам (амикацину, гентамицину (аминогликозиды), амоксициллину (бета-лактамы), кларитромицину (макролид), хлорамфениколу, ципрофлоксацину (фторхинолон) и тетрациклину) [9–11]. Действительно, в ходе проведенного нами биоинформатического исследования в геноме данного изолята содержались гены, кодирующие устойчивость к пенициллинам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколам, фторхинолонам и тетрациклинам (табл. 2).

Что касается штаммов, в геноме которых отсутствует значительное количество генов антимикробной резистентности (от 6 до 10 генов), то к ним относились: C. amycolatum ICIS 99, C. amycolatum ICIS 53, C. amycolatum SB-1, C. amycolatum 1189, C. striatum 824M, C. striatum 708 (табл. 3).

Наименьшее количество генов резистентности к антимикробным препаратам (19 генов) содержал штамм C. striatum 708, выделенный из суставной жидкости пациента в Великобритании (BioSample: SAMN34403526).

В настоящее время выделяют множество причин антимикробной устойчивости микроорганизмов. Это явление обусловлено не только присутствием генетических детерминант, ассоциированных с антимикробной устойчивостью, но и различными мутациями в данных генах. Обнаружено, что мутации в коротких областях генов gyrA и gyrB (регионы, определяющие устойчивость к хинолонам (QRDR)), кодирующих А и В субъединицы ДНК-гиразы, приводят к формированию устойчивости к хинолонам/фторхинолонам [9].

У коринебактерий устойчивость к хинолонам/ фторхинолонам обусловлена спонтанными мутациями в гене, кодирующем субъединицу фермента гиразы А [12, 13]. Установлено, что мутации, связанные с изменением аминокислот в положениях 87, 88 и 91, повышают минимальные ингибирующие концентрации (МИК) хинолонов/фторхинолонов. Так, замены в 87 позиции Ser (S) на Arg (R), Phe (F), Val (V), в 88 позиции — Ala (A) на Pro (P), в 91 позиции — Asp (D) на Tyr (Y), Gly (G), Ala(A) повышали МИК ципрофлоксацина, левофлоксацина и моксифлоксацина [12, 13]. В этой связи мы посчитали необходимым провести молекулярно-генетический анализ аминокислотной последовательности данного гена у 22 изучаемых штаммов. Для проведения сравнительного анализа и определения номера аминокислотной позиции в качестве референса был использован GyrA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (код доступа GenBank: NP599264) [13].

Согласно литературным данным, изоляты C. striatum ATCC 6940, C. jeikeium ATCC 43734 и C. urealyticum DSM 7109 обладали чувствительностью к хинолонам/ фторхинолонам [13]. Аминокислотные последовательности гена gyrA данных штаммов использовали в качестве контроля.

В ходе анализа установлено, что штаммы C. striatum ATCC 6940, C. jeikeium ATCC 43734, C. amycolatum 1189, C. aurimucosum UMB7769, C. striatum 1115, C. urealyticum 994, C. urealyticum 996, C. urealyticum DSM 7109, C.  jeikeium K411, C. amycolatum SB-1, C. genitalium ATCC 33030 имели в позиции 87 аминокислоту Ser (S), в 91 позиции — Asp (D). По литературным данным, такая структура гена позволяла им быть чувствительными к хинолонам/фторхинолонам, несмотря на наличие генов резистентности [12, 13].

В 87 позиции замену Ser (S) на Arg (R) отмечали у C. amycolatum ICIS 53, C. amycolatum ICIS 99. У штамма C. amycolatum VH6958 кроме замены Ser (S) на Arg (R) в позиции 87 наблюдали также замену в 88 позиции Ala (A) на Pro (P). Стоит обратить внимание на штамм C. amycolatum BER245, у которого кроме замены Ser (S) на Arg (R) в позиции 87 наблюдали замену Asp (D) на Tyr (Y) в 91 позиции. Такие мутации резко повышали МИК к хинолонам/фторхинолонам [12, 13].

C. urealyticum VH3073 имел две уникальные замены: 87 — Ser (S)/ Val (V) и 91 — Asp (D)/ Tyr (Y). C. striatum 2308, C. striatum 708C, C. striatum 824M имели лишь одну аминокислотную замену 87 — Ser (S)/ Val (V). Вместе с тем обнаружены штаммы, несущие уникальные замены: 87 — Ser (S)/ Ile (I), 91 — Asp (D)/ Ala (A) — C. amycolatum ICIS 9; 87 — Ser (S)/ Ile (I), 91 — Asp (D)/ Gly (G) — C. jeikeium 574; 87 — Ser (S)/ Phe (F), 91 — Asp (D)/ Gly (G) — C. striatum 1197 (рисунок). Эволюционное значение данных замен предстоит определить в дальнейших исследованиях.

Таким образом, в 87 позиции 11 изолятов имеют аминокислоту Ser (S), 4 штамма — Val (V), 4 штамма — Arg (R), 2 штамма — Ile (I), 1 штамм — Phe (F). В 88 позиции 21 штамм имеет Ala (A), 1 изолят — Pro (P). В 91 позиции 17 изолятов имеют аминокислоту Asp (D), 2 штамма — Tyr (Y), 2 штамма — Gly (G), 1 штамм — Ala (A).

Подводя итог, стоит отметить, что двойные мутации в гене gyrA, описанные в литературе как вызывающие резкое повышение МИК к хинолонам/фторхинолонам, были обнаружены у: C. amycolatum VH6958, выделенного в 2016 г. в Испании (BioSample: SAMN18038700) — замена в 87 позиции Ser (S) на Arg (R), замена в 88 позиции Ala (A) на Pro (P). C. amycolatum BER245, выделенный в 2011 г. в Бразилии от больного отитом — замена в позиции 87 Ser (S) на Arg (R), в 91 позиции замена Asp (D) на Tyr (Y). C. urealyticum VH3073, выделенный в 2017 г. в Испании из мочи пациента (BioSample: SAMN12621417), замена в 87 позиции Ser (S)/ Val (V) и 91 — Asp (D)/ Tyr (Y).

У двух штаммов (C. amycolatum ICIS 53, C. amycolatum ICIS 99) отмечали одну мутацию — Ser (S) на Arg (R).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Распространение генов устойчивости к антимикробным препаратам посредством горизонтального переноса вызывает увеличение количества устойчивых микроорганизмов, в том числе и среди представителей условно-патогенной флоры. Стоит отметить, что штаммы коринебактерий, например, штаммы C. amycolatum ICIS 53, C. amycolatum ICIS 9, C. amycolatum ICIS 99, выделенные из вагинального содержимого здоровых женщин, обладали достаточно большим арсеналом генов антимикробной резистентности [9, 11]. В этой связи необходим постоянный мониторинг за антимикробной устойчивостью бактерий с целью разработки эффективных мер по борьбе с ростом их устойчивости к антимикробным препаратам. Базы данных, содержащие сведения об устойчивости бактерий к антибиотикам, позволят сравнивать результаты, полученные с помощью различных методов, проводить оценку распространенности генов антимикробной устойчивости.

Полученные нами результаты позволили выделить основной набор генов антимикробной устойчивости, содержащийся в геномах коринебактерий. Эти данные могут быть использованы в качестве возможной оценки применения антимикробных препаратов для лечения пациентов. Тем не менее молекулярно-генетические исследования должны сочетаться с другими методами, основанными на фенотипической оценке чувствительности к лекарственным средствам, поскольку не всегда данные по фенотипической и генотипической резистентности коррелируют между собой.

Устойчивость к антимикробным препаратам может быть связана с различными мутационными изменениями, в частности, устойчивость к хинолонам/фторхинолонам в основном реализуется за счет приобретения точковых мутаций в последовательности гена gyrA, кодирующего субъединицу А ДНК-гиразы, а сверхэкспрессия эффлюксного насоса может играть дополнительную роль в приобретении устойчивости к хинолонам [12, 13]. У C. amycolatum изменение в положении 87 GyrA придавало устойчивость ко всем протестированным хинолонам/ фторхинолонам [12, 13]. Данные замены мы увидели и в анализируемых нами геномах штаммов C. amycolatum. Вместе с тем, некоторые коринебактерии несли несколько мутаций в аминокислотной последовательности гена gyrA, повышающих МИК к хинолонам/фторхинолонам [12, 13]. Исследование мутационной изменчивости в генах играет важную роль в изучении эволюционных преобразований в геномах бактерий и может использоваться для разработки молекулярных экспресс-методов диагностики.

ВЫВОДЫ

Нарастающая этиологическая значимость коринебактерий в инфекционной патологии, особенно в качестве госпитальных патогенов среди пациентов с ослабленным иммунитетом, которые перенесли длительную госпитализацию, несколько курсов антибиотикотерапии и для лечения которых использовали инвазивные медицинские устройства, определяет необходимость регулярного мониторинга патогенов. Устойчивость бактерий к антимикробным препаратам вызывает серьезную озабоченность, в связи с этим в настоящей работе: 1) установлено присутствие в геномах коринебактерий большого арсенала генов (25 генов) антимикробной устойчивости в различных комбинациях. Присутствие гена коррелирует со способностью изолята обладать устойчивостью к противомикробным препаратам. Это важное эволюционное последствие воздействия антибиотиков на популяционную структуру микроорганизмов. Стоит отметить, что резистентность к антимикробным препаратам чаще всего кодируется несколькими генами. Вариабельность детерминант противомикробной устойчивости подчеркивает необходимость постоянного наблюдения за профилями резистентности коринебактерий; 2) выявлены мутации в аминокислотных последовательностях гена gyrA изучаемых штаммов (в позициях 87, 88, 91), которые ассоциируют с устойчивостью к хинолонам/фторхинолонам.

Цель работы достигнута. Ограниченность данных по изучению коринебактерий, в том числе молекулярногенетических, затрудняет проведение сравнительного анализа. Расширение спектра штаммов, в том числе представленных в различных базах данных, позволит иметь более полное представление о строении генома, фенотипических характеристиках, а выявление спектра генов антимикробной устойчивости позволит иметь более полное представление о направлениях антибактериальной терапии.