Колоректальный рак (КРР) занимает одну из ведущих позиций в структуре онкологической заболеваемости в России и во всем мире. При этом распространенность рака ободочной кишки за последние 10 лет в РФ выросла с 116,7 до 161,0 случаев на 100 тыс. населения, а прямой кишки, соответственно, с 90,4 до 121,1 случаев [1].

В настоящее время стадия заболевания по системе TNM и степень дифференцировки являются основными параметрами, определяющими прогноз при КРР. Однако даже клинически однородные в отношении стадии и дифференцировки группы пациентов с КРР отличаются высокой гетерогенностью течения заболевания и неопределенным прогнозом. Подобное разнообразие связано с тем, что под видом одного и того же морфологического типа опухоли скрывается несколько ее разновидностей, которые различаются по своему молекулярному патогенезу и формируют биологическую гетерогенность опухоли.

Инструменты клинического прогнозирования, традиционно основанные на статистических регрессионных моделях, являются одним из методов объединения всей прогностической информации, которая позволяет избежать дальнейшей стратификации промежуточной системы TNM, основанной на бинарной логистической регрессии [2]. При надлежащей разработке и проверке эти инструменты могут интегрировать и персонализировать информацию о прогнозе у конкретного пациента и предоставить уточненную оценку риска прогрессирования для применения в клинической практике.

В настоящее время создано несколько тестсистем для определения прогноза заболевания и эффективности терапии, основанные на исследовании уровня экспрессии генов в ткани опухоли. Такие тестсистемы, как OncotypeDX, ColoPrint, ColDx, определяют вероятность прогрессирования рака на основе оценки уровня экспрессии ряда генов в опухоли [3]. В некоторых работах прогностическая эффективность этих коммерческих систем подвергают критике. Так, есть сообщение о создании более эффективной системы прогнозирования прогрессирования КРР и ответа на лечение в I–II стадии, чем OncotypeDX и ColoPrint [4]. Авторы формируют индивидуальный план лечения в начальных стадиях КРР, предлагая включать в схему адъювантную химиотерапию, чего обычно не происходит согласно актуальным международным и национальным клиническим рекомендациям.

Известны также специфичные биологические предикторы для прогнозирования возможности метастазирования КРР в лимфатические узлы — белок теплового шока 47 (HSP47) [5]. Как утверждают авторы, его обнаружение тоже будет индивидуализировать подход к лечению у пациентов с высоким риском метастазирования в лимфатические узлы.

В настоящее время постоянно предлагаются разнообразные модели прогнозирования, основанные как на использовании современных математических методов (нейросетевых моделей, моделей искусственного интеллекта, построения бинарного дерева классификации (BCT, Binary сlassification tree), экспертных оценок и т. д.), так и на расширении набора объясняющих переменных (определение точечных мутаций, микросаттелитной нестабильности, изучение микроопухолевого окружения и экспрессионных профилей). Тем не менее, потребность в совершенствовании моделей прогноза сохраняется. Эти обстоятельства побудили нас оценить возможность профилирования экспрессии мРНК из образцов опухоли для оценки прогноза при колоректальном раке.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены результаты профилей экспрессии мРНК 63 генов (табл. 1) потенциальных участников различных путей канцерогенеза, определенных в 217 образцах колоректальной аденокарциномы различной локализации. Образцы аденокарцином правой половины ободочной кишки составили 23% (50 образцов), из левой половины ободочной кишки — 39,6% (86 образцов). Из опухолей прямой кишки 37,4% (81 образец). Мужчин было 97 (44,7%), женщин 120 (45,3%). Образцы отбирались в процессе патоморфологического исследования операционного материала. Критерий включения в исследование: наличие морфологически верифицированной колоректальной аденокарциномы в локальных стадиях T_1-3, N_0-2, M₀. Какое-либо специальное противоопухолевое лечение до операции не проводилось. У всех пациентов в исследовании прослежены отдаленные результаты в срок не менее 36 месяцев. Медиана наблюдения составила 42 месяца. Критерием исключения явилось первично-множественное опухолевое поражение толстой кишки, а также наличие другого онкологического заболевания в анамнезе или на момент включения в исследование.

Методика выделения РНК и постановка ПЦР в реальном времени уже были опубликованы нами ранее [6]. В результате в каждом образце аденокарциномы различной эмбрионально-анатомической локализации был определен относительный уровень экспрессии мРНК изучаемой панели генов, относящихся к разным функциональным группам.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью открытого программного статистического пакета Jamovi (The Jamovi project; Австралия). Создаваемые логистические регрессионные модели оценивали показателями R2 и тестом на автокорреляцию Дурбина–Уотсона (DW). Качество модели считали приемлемым при значениях R2 > 0,3 и теста DW > 1,5.

Мы поставили перед собой задачу создать математическую модель бинарной логистической регрессии прогнозирования трехлетней безрецидивной выживаемости у пациентов с КРР, использовав при этом полученные профили экспрессии мРНК с учетом данных патоморфологического заключения. Для этого был сформирован перечень объясняющих переменных, которые мы условно разделили на две группы. В первую вошли данные патоморфологического исследования операционного препарата: критерии T и N, степень дифференцировки, наличии лимфоваскулярной и ангиолимфатической инвазии, соотношение общего количества удаленных лимфоузлов к числу метастатических. Вторую группу объясняющих переменных составили профили экспрессии мРНК 63 генов из образцов опухоли. Для проверки прогностических способностей разрабатываемой модели первоначальная выборка пациентов была разделена случайным образом на две подвыборки: рабочую (90% наблюдений), на которой проводили построение модели, и контрольную (10% наблюдений), на ней оценивали вероятность прогнозирования по построенной модели. Процентные доли указанных подвыборок соответствуют общей практике, принятой в современной научной литературе. Расчет выполнен в программном пакете EViews (IHS Global Inc.; США) версии 7.0. По результатам оценивания и на основе сравнения конкурирующих пробит- и логит-моделей по критерию коэффициента детерминации МакФаддена, а также информационных критериев Акаике и Шварца, наиболее удачной оказалась логит-спецификация.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе логит-модель прогнозирования развития прогрессирования КРР в течение первых 36 месяцев от момента постановки диагноза была создана с использованием только традиционных клиникоморфологических критериев риска прогрессирования КРР в качестве объясняющих переменных (табл. 2).

Коэффициент R2 составил 0,29, тест Дурбина– Уотсона — 1,51. Эти показатели бинарной логистической модели позволяют считать, что анализ классических морфологических факторов риска прогрессирования, таких как дифференцировка аденокарциномы, локализация опухоли, общее число удаленных и количество метастатических лимфоузлов, предсказывает вероятность прогрессирования КРР с минимально удовлетворительной точностью. В табл. 3 представлена матрица классификации этой логит-модели.

На рис. 1 представлена точность прогнозирования разработанной модели с включением традиционных факторов прогноза.

Как мы уже обращали внимание, общая точность прогнозирования этой модели, составившая 56,62%, оказалась не высока, а точность прогноза у пациентов без прогрессирования, равную 37%, мы расценили как неудовлетворительную и на следующем этапе работы использовали профили экспрессии мРНК панели 63 генов из образцов опухоли в качестве дополнительных объясняющих переменных.

Результатом работы стало создание второй логитмодели, в которой в качестве объясняющих переменных к морфологическим показателям мы добавили профили экспрессии мРНК из образцов опухоли. Статистически значимыми в математической модели оказались 12 показателей (переменных) (табл. 4).

Коэффициент R2 в этой модели составил уже 0,4, тест Дурбина–Уотсона 1,64. Существенное повышение точности разработанной модели достигнуто включением в регрессионное уравнение показателей экспрессии генов CCNB1, Ki67, GRB7, IGF1, IL2, IL6, IL8, GATA3 из образцов опухоли. Матрица классификации представлена в табл. 5.

Общая точность классификации составила 80,6% (рис. 2). Особо отметим, что точность прогнозирования у пациентов без прогрессирования повысилась с 37 до 70,5% в сравнении с первой моделью.

На основе этой модели мы рассчитали индивидуальный прогноз для каждого пациента в нашей выборке. На рис. 3 графически представлено распределение индивидуального риска в зависимости от выявления прогрессирования. Медиана показателя риска в группе без выявленного прогрессирования составила 57,1% [38,2; 70,7], а при его выявлении 79,2% [68,3; 96,4]. Различия показателей риска оказались статистически значимы (Крускал–Уоллис: р < 0,05).

Оцениваемые патоморфологами в ходе рутинного исследования факторы риска прогрессирования колоректального рака позволяют сформировать лишь минимально приемлемую с точки зрения точности прогностическую модель. Повышение точности прогностических моделей может быть достигнуто анализом информации вне патоморфологической стадии. Оценка профилирования экспрессии мРНК генов CCNB1, Ki67, GRB7, IGF1, IL2, IL6, IL8, GATA3 в опухолевых образцах позволяет повысить точность с 56,62 до 80,6%. Изменения экспрессии остальных генов панели тоже представляются важными, но их включение в модель не приводит к повышению ее точности вследствие мультиколиниарности, что может дополнительно свидетельствовать о системности происходящих изменений в слизистой толстой кишки при развитии колоректального рака.

Мы заметили, что классические патоморфологические признаки высокого риска прогрессирования КРР, такие как лимфоваскулярная и ангиолимфатическая инвазия, дифференцировка, характер поражения лимфоузлов, имеют отрицательные регрессионные коэффициенты в прогностической модели, тогда как опухолевый супрессор GATA3 имеет положительный коэффициент. Эта закономерность представляется логичной: усиление активности онкосупрессора GATA3 характерно для менее агрессивного течения КРР [7], тогда как наличие метастатических лимфоузлов в препарате, низкой дифференцировки и ангиолимфатической инвазии свидетельствует о высоком риске прогрессирования.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Актуальная задача улучшения результатов третичной профилактики колоректального рака в локальных стадиях неразрывно связана с объективной стратификацией его прогноза с целью персонализации терапии и, что особенно важно, оценкой эффективности существующих и перспективных схем лечения. И хотя до настоящего времени патоморфологическая стадия КРР является основой для формирования прогноза прогрессирования заболевания, именно изучение информации о патологическом прогрессе без привязки к стадии КРР может стать ключом к решению задачи оценки риска прогрессирования. Такой информацией, в первую очередь, могут быть молекулярно-генетические данные, полученные при анализе тканей пораженного органа. В разработанной математической прогностической логит-модели прогрессирования нами использованы 12 показателей, полученные при патоморфологическом и молекулярногенетическом исследовании опухоли. Они включают в себя как общепринятые факторы риска в виде степени дифференцировки опухоли, наличия ангиолимфатической и периневральной инвазии, а также характер изменений лимфоузлов, удаленных во время операции, и показатели экспрессии мРНК 8 генов: CCNB1, Ki67, GRB7, IGF1, IL2, IL6, IL8, GATA3.

Роль этих генов в онкогенезе неоднократно обсуждали в литературе [8–12]. Эти гены относятся к функциональным группам регуляторов клеточного цикла (CCNB1), пролиферации (Ki-67 GRB7), факторов роста (IGF-1) и цитокинов (IL2, IL6, IL8), участвующих в инвазии и метастазировании колоректального рака [12].

Сравнивая собственные результаты с уже имеющимися данными, в том числе с отчетами крупных исследований, мы обратили внимание, что однозначная интерпретация характеристик дифференцировки опухоли, ангиолимфатической и лимфоваскулярной инвазии затруднены отсутствием единой системы классификации и стандартов оценки [13–15]. Это позволяет данным показателям значительно варьироваться в разных клиниках [16, 17], так, например, считается, что частота выявления PNI, как правило, занижена, при этом показатели обнаружения варьируются от 9 до 42% [18]. Роль соотношения числа удаленных лимфоузлов в препарате к числу метастатических при КРР была первоначально изучена в 2005 г. [19]. Этот показатель был определен как отрицательный независимый прогностический фактор на III стадии и связан с уменьшением общей и безрецидивной выживаемости при КРР. Он оказывает более сильное влияние на прогноз при раке прямой кишки, чем при раке ободочной кишки. Его прогностическое значение повышается при исследовании более 12 лимфатических узлов. Критическое значение этого показателя варьируется от 0,125 до 0,3 в различных исследованиях. По-прежнему нет консенсуса относительно минимального количества собранных лимфатических узлов для надлежащей оценки этого показателя.

Нельзя не отметить, что в последние годы благодаря усилиям медицинских сообществ стали доступны клиникогеномные базы данных. Анализируя их, можно лучше понять геномный ландшафт КРР и оценить эффективность и безопасность лечения в подгруппах пациентов с различными геномными профилями. В литературе встречаются указания, что различия между базами данных по демографическим, клиническим характеристикам, схемам лечения и общей выживаемости необходимо учитывать при разработке исследований и интерпретации результатов, полученных в клинико-геномных базах [20].

Тем не менее, наши результаты подтверждают сформировавшуюся тенденцию: анализ дополнительной информации, в первую очередь молекулярно-генетической, вне патоморфологической стадии при колоректальном раке существенно повышает точность прогнозирования вероятности прогрессирования. При этом поиск новых предикторов, и что не менее важно, широкая валидация прогностических систем, должна быть продолжена.

ВЫВОДЫ

Мы установили, что факторы риска прогрессирования КРР, выявляемые при стандартном патоморфологическом исследовании, в нашей выборке пациентов при использовании прогностической логит-модели бинарного выбора обеспечивают точность прогноза, равную 56,62%. При этом ошибки классификации возникают в основном из-за пациентов, у которых прогрессирование не развивалось в течение 36-месячного периода наблюдения. Включение в модель, в качестве объясняющих переменных показателей экспрессии мРНК генов CCNB1, Ki67, GRB7, IGF1, Il2, Il6, Il8, GATA3 из опухолевых образцов, повышает точность прогнозирования до 80,6%. Это позволяет считать, что расширение поиска предикторов прогноза вне патоморфологической стадии системы TNM — перспективный путь повышения его точности с целью реализации эффективных мер третичной профилактики КРР.