Нарушение микробиоты в организме человека приводит к изменению метаболизма и увеличению жировой ткани, постепенно способствуя развитию ожирения. Наблюдается неуклонный рост страдающих ожирением людей как среди взрослых, так и среди детей и подростков, что обуславливает актуальность поиска новых механизмов возникновения патологии. Важно своевременно выявлять предрасположенность к ожирению у детей и подростков, так как есть возможность отсрочить или в лучшем случае вообще предотвратить прогрессию заболевания, приводящую к развитию сахарного диабета II типа, дислипидемии, нарушений со стороны работы сердечно-сосудистой системы, репродуктивной системы, печени, микрососудистым нарушениям и т. д. Ожирение сопровождается морфологическими и функциональными изменениями в белой жировой ткани, привлекая иммунные клетки, такие как макрофаги, Т-клетки, В-клетки, вызывая инфильтрацию жировой ткани и таким образом запуская воспалительный процесс. Воспаление при ожирении носит вялотекущий и прогрессирующий характер, в отличие от острого воспаления, направленного на элиминацию патогена и восстановление гомеостаза. Воспалительный ответ может быть обусловлен как эндогенными (DAMP от англ. Damage Associated Molecular Patterns — молекулярный паттерн, ассоциированный с повреждением), так и экзогенными (PAMP от англ. Pathogen Associated Molecular Patterns — патогенассоциированные молекулярные паттерны) лигандами (в том числе бактериальной ДНК), распознающимися PRR (паттерн-распознающими рецепторами) [1, 2]. PRR экспрессируются в том числе и адипоцитами. Различные паттерн-распознающие рецепторы, такие как Toll-подобные рецепторы (TLR), активно участвуют в противовирусной и антибактериальной защите организма. PAMP способствуют повышению экспрессии рецепторов адипоцитов и секреции провоспалительных цитокинов и адипокинов. Активация TLR-3 запускает каскад внутриклеточных событий, сопровождающихся активацией иммунных клеток и продукцией хемокинов и провоспалительных цитокинов, таких как ФНОα, IL1β, IL6, IL8, хорошо известных в развитии воспаления в жировой ткани, сопровождающегося формированием инсулинорезистентности [3].

В то же время TLR участвуют в механизмах адипогенной дифференцировки, что выражается в их сочетанной экспрессии с PPARs (Peroxisome proliferator-activated receptors — рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом) на разных этапах дифференцировки адипоцитов [4, 5].

Однако на настоящий момент остаются неописанными изменения в содержании и таксономическом разнообразии микробиома крови и его связи с факторами воспаления.

Таким образом, целью работы было сравнение уровней содержания про- и противовоспалительных цитокинов в крови детей с ожирением и здоровых детей, а также их взаимосвязь с таксономической представленностью в микробиоме крови; определение вклада бактериальной ДНК различных семейств в формирование альфаразнообразия микробиома крови и его связь с микробиомом кишечника.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в 2019–2020 гг. Были обследованы 163 человека (дети и подростки), которые обратились в детскую городскую поликлинику №1 г. Ростова-на-Дону с целью очередной плановой диспансеризации. Из них 80 человек (в возрасте 10–18 лет, средний возраст составлял 13,25 ± 2,00 лет) были группой наблюдения — дети с алиментарно-конституциональным ожирением разной степени, которые уже находились на диспансерном учете с установленным диагнозом (табл. 1). Группой сравнения были 83 здоровых ребенка и подростка (в возрасте 10–18 лет, средний возраст составлял 12,92 ± 2,21 лет), которые не имели ожирения и других метаболических нарушений (табл. 1).

Критерии включения в обе группы: отсутствие приема антибиотиков, пробиотических и пребиотических препаратов в течение трех месяцев до включения в исследование, подписанное информированное согласие для участия в исследовании. Критерии исключения для обеих групп: тяжелые соматические заболевания (хроническая почечная недостаточность, хроническая печеночная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность), заболевания желудочно-кишечного тракта (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона), любое заболевание в острой форме. Дополнительный критерий включения в группу наблюдения: индекс массы тела SDS > +2,0 и установленный диагноз — алиментарно-конституциональное ожирение I–III степени. Исследование было одноцентровым и одномоментным со случайной выборкой участников.

Анализ таксономического состава микробиома крови проводили на базе центра цифровой и трансляционной биомедицины ООО «Центр молекулярного здоровья», Государственного бюджетного учреждения Ростовской области Детская городская больница №1 Российского национального исследовательского университета имени Н. И. Пирогова, Казанского (Приволжского) федерального университета. У всех участников исследования проводили оценку антропометрических параметров и забор крови и кала для лабораторных исследований.

Выделение микробной ДНК из образцов крови участников исследования проводили с использованием набора QIAamp BiOstic Bacterimia DNA Kit (Qiagen; Германия) в соответствии с протоколом производителя. Контроль качества ДНК, его количественный и качественный состав оценивали методами спектрофотометрии (Qubit, Thermo Fisher Scientific; США) и гель-электрофореза (1% агарозы).

Подготовку библиотек и секвенирование вариабельного участка V3–V4 гена 16S рРНК проводили на платформе Illumina MiSeq (Illumina; США) согласно рекомендациям производителя. Полученные последовательности генов 16S рРНК («риды») были проанализированы с помощью программного обеспечения QIIME (версия 1.9.1) [6] с использованием референсной базы данных Greengenes v. 13.8 [7] с 97%-ным порогом сходства между последовательностями.

Концентрации цитокинов IL6, 8, 10, 17, ФНОα определяли коммерческими наборами Milliplex (Merck; Германия) — Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel; фракталкин — Human Myokine Magnetic Bead Panel; PD-L1 (лиганд 1 запрограммированной клеточной гибели, от англ. Programmed cell death-ligand 1) — Human ImmunoOncology Checkpoint Protein Panel Magnetic Bead Panel методом мультиплексного иммуноферментного анализа (ИФА) на анализаторе Magpix (Bio-Rad Laboratories; США).

Статистическая обработка данных выполнена с помощью MedCalc® Statistical Software version 20.110 (MedCalc Software Ltd; Бельгия). Все массивы данных были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. Ввиду отсутствия нормального распределения, в качестве меры центральной тенденции использовали медиану и ее [25–75] перцентили. Для сравнения величин индексов бета-разнообразия (Евклидово расстояние, Манхэттенское расстояние, несходство Брея–Кертиса), уровней содержания цитокинов и анализа различий в бактериальной ДНК крови применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Сравнение частоты выявления ДНК различных семейств из образцов крови в контрольной группе и у детей с ожирением проводили с использованием хи-квадрат анализа. Вне зависимости от использованного критерия различия считались достоверными при уровне значимости р ≤ 0,05. Для выявления взаимосвязи между содержанием отдельных семейств (при условии их выделения из образцов крови пациентов) и характеристиками разнообразия микробиома крови проводили расчет коэффициента корреляции Спирмена. Коэффициенты корреляции (rho) принимали во внимание при условии |rho| ≥ 0,3 — умеренная сила связи в соответствии со шкалой Чэддока и при уровне значимости р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделенная из крови здоровых детей бактериальная ДНК принадлежала 29,0 [24,5–37,0] бактериальным семействам, а из крови детей с ожирением — 34,0 [28,0–42,0] семействам. Более 75% ДНК крови в обеих группах приходилось на 19 семейств: Sphingomonadaceae, Caulobacteraceae, Bradyrhizobiaceae, Micrococcaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Moraxellaceae, Propionibacteriaceae, Comamonadaceae, Streptococcaceae, Staphylococcaceae, Prevotellaceae, Chitinophagaceae, Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Veillonellaceae, Enterobacteriaceae, Methylobacteriaceae (рис. 1).

У детей с ожирением наблюдали статистически значимое увеличение доли ДНК: Chitinophagaceae (p < 0,001), Caulobacteraceae (p < 0,001), Bradyrhizobiaceae (p = 0,004), Porphyromonadaceae (p = 0,091) и Sphingomonadaceae (p < 0,001), тогда как содержание ДНК Prevotellaceae (p < 0,001) и Lachnospiraceae (p < 0,001) было статистически значимо ниже по сравнению с контрольной группой (табл. 2).

У детей с ожирением статистически значимо чаще выделялась бактериальная ДНК семейств: Sphingomonadaceae (p = 0,026), Ruminococcaceae (p = 0,085), Caulobacteraceae (p = 0,020), Bradyrhizobiaceae (p < 0,001), Porphyromonadaceae (p = 0,033), Chitinophagaceae (p < 0,001), Pasteurellaceae (p = 0,061) и реже Prevotellaceae (p = 0,044), Thermaceae (p = 0,084) (табл. 2).

Анализ таксономической принадлежности бактериальной ДНК крови в группе детей с ожирением позволил установить повышение разнообразия бактериальной ДНК на уровне типов у детей с ожирением [8]. Представляет интерес анализ корреляционных взаимосвязей показателей альфаразнообразия и таксономического состава бактериальной ДНК на уровне семейств. Выявлены отрицательные взаимосвязи показателей альфа-разнообразия с ДНК, относящейся к семействам — Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Propionibacteriaceae, Streptococcaceae, Staphylococcaceae, Caulobacteraceae, Bradyrhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Comamonadaceae, Moraxellaceae — как в контрольной группе, так и у детей с ожирением.

Вместе с тем бактериальная ДНК только четырех семейств устанавливает положительные корреляции с показателями разнообразия микробиома крови, причем преимущественно биотопами являются толстый кишечник (Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae) и ротовая полость (Prevotellaceae) (табл. 3).

Для выявления биотопов, формирующих микробиом крови, был проведен корреляционный анализ между характеристиками альфа-разнообразия долями бактериальной ДНК, приходящейся на отдельные семейства. Обнаружены положительные корреляции с Bacteroidaceae, Prevotellaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae. Положительные корреляции возникли с ДНК микроорганизмов, населяющих главным образом два биотопа — толстый кишечник и ротовую полость, а также верхние дыхательные пути, мочеполовую систему; отрицательные — с ДНК бактерий, обнаруживаемых в толстом кишечнике, на кожных покровах, ротоглотке, носоглотке, пищеводе, желудке, воде, почве.

Примечательно, что у детей с ожирением наблюдается разнонаправленное изменение выраженности положительных корреляционных связей индексов альфа-разнообразия с семействами из одного и того же биотопа — снижение с семейством Bacteroidaceae и увеличение с семейством Ruminococcaceae.

Обращает также внимание снижение при ожирении крайне выраженных отрицательных корреляционных связей индексов альфа-разнообразия с ДНК семейств Caulobacteraceae и Bradyrhizobiaceae и появление отрицательных корреляций с ДНК семейства

Porphyromonadaceae на фоне статистически значимого повышения их частоты встречаемости и доли в общем пуле бактериальной ДНК крови. Представители семейств Caulobacteraceae — обитатели почвы и воды, а Bradyrhizobiaceae входит в состав ядра микробиома грудного молока.

При анализе корреляций в группах здоровых детей и детей с ожирением выявлена различная архитектура взаимосвязей между ДНК различных таксономических групп, содержащая как общие для обеих групп паттерны взаимосвязей, так и уникальные для каждой группы.

Обращает внимание, что в центре корреляционных связей находится ДНК семейства Propionibacteriaceae, которая устанавливает взаимосвязи с двумя паттернами корреляции. Один паттерн включает Lachnospiraceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, другой — Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae, Streptococcaceae, Staphylococcaceae, Comamonadaceae, Moraxellaceae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, Sphingomonadaceae (рис. 2, рис. 3).

Примечательно, что в группе детей с ожирением возникает больше уникальных корреляционных взаимосвязей, и они образованы в основном ДНК микробиома внекишечных биотопов (кожа, ротовая полость, почва, вода).

Анализ бета-разнообразия проводили между микробиомами крови и кала. Данный анализ выявил значимое повышение показателей бета-разнообразия в группе детей с ожирением (Евклидово расстояние p = 0,03, Манхэттенское расстояние p = 0,07, несходство БреяКертиса p = 0,07), что свидетельствует о большем различии между микробиомами крови и кала у детей с ожирением. Это, в свою очередь, говорит о снижении доли кишечного микробиома в формировании микробиома крови и возрастании доли внекишечных микробиомов (рис. 4).

Таким образом, показанное нами ранее незначительное повышение альфа-разнообразия микробиома крови у детей с ожирением в виде статистически значимого увеличения количества операционных таксономических единиц (OTUs) и тенденции роста индекса филогенетического разнообразия (PD) дополняется данными о бета-разнообразии и корреляционных связях между ДНК различных семейств, которые свидетельствуют о том, что при ожирении повышение альфа-разнообразия микробиома крови сопровождается удалением его от микробиома кишечника, т. е. разнообразие достигается путем обогащения микробиома крови ДНК из внекишечных микробиомов [8].

Исследование уровня содержания цитокинов у детей с ожирением выявило статистически значимое увеличение IL17А и PD-L1 по сравнению со здоровыми детьми (табл. 4).

На основании проведенного корреляционного анализа установлены статистически значимые положительные взаимосвязи в группе детей с ожирением (табл. 5).

В группе здоровых детей корреляционный анализ позволил установить следующие взаимосвязи между цитокинами и бактериальной ДНК на уровне семейств:

IL10 умеренно положительно коррелировал с бактериальной ДНК Erysipelotrichaceae (rho = 0,438, p = 0,005, n = 40); IL8 умеренно положительно коррелировал с Bacteroidaceae (rho = 0,370, p = 0,005, n = 57), IL6 c Pseudomonadaceae (rho = 0,528,  p = 0,012, n = 22); IL17А с Microbacteriaceae (rho = 0,544, p = 0,006, n = 23), Bacillaceae (rho = 0,796, p < 0,001, n = 18), Fusobacteriaceae (rho = 0,506, p = 0,032, n = 18); PD-L1 c [Tissierellaceae] (rho = 0,353, p = 0,044, n = 33), Pseudomonadaceae (rho = 0,528, p = 0,012, n = 22).

У детей с ожирением выявлена умеренно положительная взаимосвязь IL10 c Lactobacillaceae (rho = 0,395, p = 0,034, n = 29), IL8 с Veillonellaceae (rho = 0,354, p = 0,017, n = 45); IL6 c Nocardiaceae (rho = 0,605, p = 0,010, n = 17), Lactobacillaceae (rho = 0,380, p = 0,042, n = 29), Veillonellaceae (rho = 0,459, p = 0,002, n = 45); IL17А с Nocardiaceae (rho = 0,521, p = 0,032, n = 17), ФНОα с Nocardiaceae (rho = 0,495, p = 0,043, n = 17), фракталкин с Bacillaceae (rho = 0,705, p = 0,010, n = 12).

Выявленные корреляционные взаимосвязи между бактериальной ДНК и содержанием цитокинов в группах детей ассоциированы с разными семействами. В группе здоровых детей системный провоспалительный цитокин IL8 коррелирует с бактериальной ДНК Bacteroidaceae, которые выполняют в кишечнике защитную функцию, у детей с ожирением данной корреляции не выявлено. Cледует также отметить, что взаимосвязи в контрольной группе выявлены с семействами, принадлежащими пяти филумам — Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria; у детей с ожирением только с семействами, принадлежащими двум филумам: Firmicutes и Actinobacteria.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты нашего исследования показали, что дети и подростки с ожирением характеризуются статистически значимо повышенными уровнями IL17А и PD-L1. В норме IL17А принимает участие в поддержании целостности эпителиального барьера слизистых оболочек посредством регулирования белков плотных контактов (окклюдина), однако главная функция заключается в рекрутировании нейтрофилов в кишечник при угрозе излишней проницаемости и в целях поддержания гомеостаза. В одном из исследований было показано, что ингибирование IL17А или IL17RА сопровождалось серьезным ослаблением эпителиального барьера [9]. IL17А также главный регулятор взаимодействия между организмом хозяина и микробиотой как на физиологическом уровне, так и при иммуноопосредованных воспалительных заболеваниях [10]. В экпериментах на мышах нокаут гена IL17 индуцировал развитие воспаления кишечника [11]. Вместе с тем в исследованиях, проведенных на трансгенной мышиной модели рассеянного склероза HLA-DR3, показано, что дефицит IL17А (мыши HLA-DR3.IL17A–/–) приводит к увеличению количества Tregиндуцирующих кишечных бактерий, таких как Prevotella, Parabacteroides и Bacteroides, что приводит к более легкому течению заболевания. Было также показано, что IL17А может регулировать активность Treg и влиять на течение заболевания путем модуляции микробиоты кишечника и обеспечивает новый механизм, с помощью которого иммуномедиаторы влияют на микробиоту кишечника. Интересно, что у мышей DR3 с достаточным содержанием IL17А заболевание протекает в более легкой форме при содержании с мышами с дефицитом IL17А, тем самым подчеркивая доминирующую роль микробиоты в индукции Treg и снижении тяжести заболевания [12]. IL17А принимает участие и в патогенезе аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, псориаз, системная красная волчанка, бронхиальная астма и др. [13]. Лечение спондилоартрита и псориатического артрита путем ингибирования IL17 приводило к уменьшению содержания Clostridiales и увеличению Bacteroidales. Таким образом, можно предположить, что, имея повышенный уровнь IL17А, дети с ожирением попадают в зону риска развития аутоиммунных заболеваний.

PD-L1 представляет собой лиганд, который играет важную роль в ингибировании опосредованного Т-клетками иммунного ответа [14]. Связывание PD-L1 с PD-1 вызывает апоптоз эффекторных Т-клеток и ускользание опухолевых клеток от иммунитета, что приводит к неблагоприятному прогнозу при онкологии. В ряде работ показано, что ингибирование взаимодействия между PD-L1 с PD-1 усиливает адаптивный иммунный ответ, и повышается противоопухолевая активность [15–17]. Также выявлено, что PD-L1 экспрессируется на белых и бурых адипоцитах у мышей [18]. PD-L1 — не столь однозначная молекула: ее низкая экспрессия или нокаут на адипоцитах повышает противоопухолевый иммунитет при наличии опухоли у мышей, а в отсутствии опухоли абляция PD-L1 адипоцитов усугубляет обусловленное диетой увеличение массы тела, инфильтрацию провоспалительных макрофагов в жировую ткань и резистентность к инсулину [19]. PD-L1 обладает двояким эффектом: с одной стороны, снижение экспресии повышает противоопухолевый иммунитет и подавляет рост опухоли, а с другой — увеличение экспрессии в адипоцитах позволяет поддерживать гомеостаз жировой ткани и смягчать вялотекущее воспаление, связанное с разрастанием жировой ткани и инфильтрацией ее макрофагами [20]. Микробиом кишечника может модулировать ответ пациентов с меланомой на иммунотерапию PD-1. По предположению авторов, пациенты с «благоприятным» микробиомом кишечника (например, с высоким разнообразием и обилием Ruminococcaceae и Faecalibacterium) имеют усиленный системный и противоопухолевый иммунный ответ, опосредованный улучшением презентации антигена и функции эффекторных Т-клеток на периферии и в микроокружении опухоли. Напротив, пациенты с «неблагоприятным» микробиомом кишечника (например, с низким разнообразием и высокой относительной численностью Bacteroidales) имеют нарушенные системные и противоопухолевые иммунные реакции, опосредованные ограниченной внутриопухолевой лимфоидной и миелоидной инфильтрацией и ослабленной способностью к презентации антигенов. Эти результаты подчеркивают терапевтический потенциал модуляции микробиома кишечника у пациентов, получающих иммунотерапию с блокадой контрольных точек [21].

Несмотря на схожесть доминирующих семейств микробиома крови, в обеих обследованных группах детей и подростков найдены статистически значимые различия как по частоте выделения бактериальной ДНК крови, так и по долям, приходящимся на семейства в группе детей с ожирением. Из этого можно предположить, что у детей происходят значительные нарушения в проницаемости как кишечника, так и других биотопов, главным образом кожи. Изменение микробиоты оказывает влияние на качество и количество пристеночной микробиоты, процессы выработки бокаловидными клетками кишечника слизи, защищающей от проникновения патогенов. В группе детей с ожирением мы показали, что ДНК семейства Bacteroidaceae вносит значимо меньший вклад в альфаразнообразие микробиома крови, что сопоставимо с данными других исследователей по микробиому кала [8]. Доказано, что увеличение доли Proteobacteria при ожирении, неалкогольной жировой болезни печени и неалькогольном стеатогепатите [22–24] является предрасполагающим фактором нарушения работы печени и всего желудочнокишечного тракта. Статистически значимое снижение доли Lachnospiraceae в группе детей с ожирением влечет за собой снижение синтеза бутирата, следовательно, снижается энергообеспечение клеток кишечного эпителия и утончается кишечный барьер в связи со снижением активации белка клаудина-1 [25]. Исследования показывают, что Ruminococcaceae сопряжены с развитием воспалительных заболеваний кишечника, таких как язвенный колит и болезнь Крона.

Основной биотоп Ruminococcaceae — это толстый кишечник, для Bacteroidaceae — толстый кишечник, ротовая полость, верхние дыхательные пути, мочеполовая система, а для Prevotellaceae — ротовая полость, что позволяет предположить снижение транслокации бактериальной ДНК из ротовой полости.

Согласно литературным данным у детей и подростков с ожирением были выявлены позитивные корреляционные взаимосвязи между содержанием трефоиловых факторов, а именно TFF3 с микробиотой кишечника, свидетельствующие о нарушении толерантности мукозального барьера к микробному сообществу [26].

Таким образом, вероятно, у детей с ожирением вследствие нарушения периферической толерантности и проницаемости мукозальных барьеров происходит усиленная транслокация бактериальной ДНК не только из кишечника, но и из ротовой полости и кожных покровов. В результате транслокации повышается разнообразие микробиома крови. Бактериальная ДНК активирует рецепторы TLR9 и запускает секрецию провоспалительных цитокинов, в частности, IL17А, вынуждая организм поддерживать баланс и активировать запуск противовоспалительных механизмов путем активации синтеза PD-L1.

ВЫВОДЫ

Увеличение альфа-разнообразия в группе детей с ожирением наблюдается за счет бактериальной ДНК семейств Lachnospiraceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae.

При ожирении увеличивается бета-разнообразие, что свидетельствует об увеличении транслокации бактериальной ДНК из внекишечных микробиомов. Появляются новые паттерны взаимосвязей по сравнению с паттернами взаимодействия в контрольной группе. У детей с ожирением повышение уровней IL17А и PD-L1 свидетельствует об активации про- и противовоспалительных механизмов и развитии вялотякущего воспаления. Ожирение характеризуется появлением значимых корреляций ДНК семейства Nocardiaceae с провоспалительными цитокинами, что свидетельствует о роли транслокации ДНК этого таксона в развитии вялотекущего воспаления и возможности разработки подходов по снижению этой транслокации в лечении ожирения.