Ежегодно в мире выявляют около 10 млн случаев заболевания активным туберкулезом (ТБ) и около 1,5 млн смертей от него [1]. Поиски новой противотуберкулезной вакцины приводили в отчаяние не одно поколение энтузиастов-исследователей. Многочисленные и трудоемкие попытки понять фундаментальные механизмы протективного иммунитета при микобактериальной инфекции привели лишь к осознанию его сложности и не позволили установить надежные иммунологические корреляты протекции и сформировать базу для рационального отбора перспективных вакцин. Ясно, что при разработке вакцин нового поколения необходимо учитывать уникальные особенности эффективного иммунного ответа против соответствующего патогена [2]. Требования к таким вакцинам должны включать: 1) индукцию «правильного» соотношения Т-клеточных субпопуляций и цитокинового спектра при быстрой реакции на заражение в сочетании с индукцией протективного и длительного (иммунологическая память) иммунитета; 2) активацию «правильных» эффекторных механизмов, направленных на предупреждение заражения или элиминацию инфицирующего агента; 3) высокую специфичность в отношении инфицирующего агента во избежание риска аутоагрессии за счет перекрестных антигенов; 4) использование антигенов бактерии, экспрессируемых в хозяине всеми изолятами и штаммами; 5) иммуногенность для всех гаплотипов главного комплекса гистосовместимости (МНС) человеческой популяции.

Важнейшими аспектами для разработки новой эффективной противотуберкулезной вакцины представляются следующие: a) подбор антигенов, их комбинирование и выбор физико-химической природы антигенов (внутриклеточные, ассоциированные с поверхностью или секретируемые белки, гликолипиды, фосфолиганды); б) тип вакцины (цельные белки или пептиды, цельные живые атенуированные или убитые нагреванием бактерии, рекомбинантные бактерии, ДНКвакцины); в) форма и способ введения вакцины (высокие/ низкие дозы, адъюванты, иммуномодулирующие цитокины, иммуностимулирующие последовательности ДНК).

Применение вакцин на основе мРНК — относительно новое направление вакцинологии [3, 4]. Первые экспериментальные мРНК-вакцины были разработаны в начале 1990-х гг. Показано, что они индуцируют как гуморальный, так и клеточный иммунитет in vivo [5, 6]. Однако первые носители, используемые для переноса молекул мРНК, имели неблагоприятные профили безопасности, в то время как использование мРНК per se приводило к распознаванию нуклеиновых кислот иммунной системой и деградации РНКазами [6]. Эти проблемы были частично преодолены за счет использования в мРНК-молекуле модифицированных нуклеозидов (замена уридина псевдоуридином или другими аналогами), которые помогают избежать индукции опосредованных интерферонами противовирусных путей, которые приводили к разрушению молекул мРНК [7]. В  то же время, опосредованная toll-рецепторами активация механизмов врожденного иммунного ответа молекулами мРНК способна повысить эффективность вакцинации [8]. Разработка носителей в виде липидных наночастиц (содержащих пегилированные липиды, холестерин, ионизируемые липиды и фосфолипиды), характеризующихся улучшенным профилем безопасности, повысила эффективность доставки мРНК. В целом, эти достижения привели к росту и постоянному интересу к использованию мРНК-вакцин для профилактики различных инфекционных заболеваний, преимущественно вирусной природы. В то же время опыт применения мРНК- вакцин против инфекционных заболеваний, вызванных бактериями, крайне ограничен.

Тем не менее, не все мРНК-препараты высокоэффективны. Низкая стабильность РНК в клетке приводит к преждевременной деградации РНК, низкой эффективности трансляции, снижению уровня и продолжительности экспрессии целевого белка [9]. Одну из ключевых ролей в обеспечении стабильности молекул мРНК и эффективности их трансляции играют регуляторные последовательности нетранслируемых областей (5'-UTR и 3'-UTR). Следует отметить, что, несмотря на активные исследования свойств UTR, число исследований, оценивающих вклад отдельных UTR на трансляцию гетерологичных РНК, ограничено [10, 11]. Цель нашего исслеледования — изучить иммуногенность и протективную активность противотуберкулезных мРНК- вакцин с различными комбинациями последовательностей 5'-UTR и 3'-UTR в экспериметальной модели на мышах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный дизайн

В эксперименте использовали 65 самок мышей C57BL/6Cit (B6) и 65 самок мышей I/StSnEgYCit (I/St) весом 20–25 г в возрасте 2–4 месяца из питомника ФГБНУ «ЦНИИТ». Животных содержали в условиях конвенционального вивария при фиксированном световом режиме 12.00 : 12.00 ч и доступом к корму и воде ad libitum. Мышей B6 иммунизировали внутримышечно двухкратно с интервалом в три недели тремя различными вариантами мРНК-вакцин: mRNA 5'-TPL-Esat6-3’Mod, 5'-Rabb-Esat6-3'EMCV и 5'-Mod-Esat6-3'Mod по 50 мкг РНК на инъекцию (рис. 1). Контрольным животным вводили фосфатный буфер (PBS). Вакцинацию БЦЖ (BCG Pasteur) провели однократно в дозе 100 000 КОЕ/мышь подкожно за пять недель до забора тканей (В6)/инфицирования (I/St).

Восемь животных из каждой группы мышей В6 использовали для оценки гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Оставшихся мышей (пять в каждой группе) использовали для оценки Т-клеточного ответа (ELISpot), а также для оценки титра IgG и IgM к антигенам M. tuberculosis. У мышей линии I/St через 50 дней после инфицирования оценивали микобактериальную нагрузку селезенки и легких (пять в каждой группе), а также оценивали динамику гибели мышей после инфицирования.

Клонирование

С целью получения конструкций для последующей in vitro транскрипции РНК в коммерческий вектор pSmart (Lucigen; США) встраивали кассету, содержащую 5'-UTR, 3'-UTR, и последовательность, кодирующую различные эпитопы белка Esat6, которая была описана ранее [12]. В качестве 5'-UTR использовали последовательности 5’-UTR вакцины против SARS-CoV2 фирмы Moderna (США), последовательность трехчастного лидера поздних аденовирусных мРНК (tripartite leader, TPL) или кроличьего β-глобина Rabb (приложение 1). В качестве 3'-UTR использовали последовательность 3'-UTR вакцины против SARS-CoV2 фирмы Moderna или последовательность 3'-UTR вируса энцефаломиокардита EMCV. Фрагменты сшивали методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров. В конструкцию 5'-UTR-Esat6-3'-UTR вводили сайты рестрикции EcoRI и BglII, по которым и осуществляли клонирование в вектор pSmart. Для культивирования использовали штамм NEB-stable (New England Biolabs; UK).

In vitro транскрипция мРНК

In vitro транскрипцию проводили, как описано ранее [12]. РНК преципитировали добавлением LiCl до концентрации 0,32 M и EDTA (pH 8,0) до концентрации 20 мМ с последующей инкубацией на льду в течение часа. Далее раствор центрифугировали в течение 15 мин (25000 g, 4 °С). Осадок РНК промывали 70%-м этанолом, растворяли в ультрачистой воде и еще раз преципитировали спиртом по стандартной методике. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм.

Формуляция мРНК в липидные наночастицы

Формуляцию мРНК в липидные наночастицы проводили на приборе NanoAssemblr™ Benchtop (Precision Nanosystems; США), как описано ранее [13]. Компонентами липидной смеси были ионизируемый липидоид ALC-0315 (BroadPharm; США), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) (Avanti Polar Lipids; США), холестерин (Sigma-Aldrich; США), DMG-PEG-2000 (BroadPharm; США); мольное соотношение (%) составляло 46,3 : 9,4 : 42,7 : 1,6.

Концентрацию загруженной в липидные наночастицы мРНК определяли по разнице значений уровня флуоресцентного сигнала при окрашивании реагентом RiboGreen (Thermo Fischer Scientific; США) суспензии частиц до их разрушения и после. Для разрушения частиц использовали детергент Triton X-100 (SigmaAldrich; США). Количество инкапсулированной РНК в частицах во всех образцах было более 95% по отношению к общему количеству РНК (инкапсулированная плюс свободная). Размер частиц составил 80–90 нм, индекс полидисперсности — менее 0,15.

Измерение реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

Через четыре недели после вакцинации реакцию ГЗТ мышей каждой группы (по восемь мышей) оценивали по набуханию левой задней лапки мыши в ответ на введение 40 мкл PBS, содержащего 50 МЕ очищенного туберкулина (ФГУП «НЦЭСМП» МЗ РФ; Россия) через 48 ч после инъекции. Данные представлены в виде Δ (разность толщины левой и правой лапки в мм).

Антигены

В качестве антигена в экспериментах ex vivo использовали соникат M. tuberculosis H37Rv — растворимую фракцию разрушенных ультразвуком M. tuberculosis H37Rv [14].

Определение титров IgG и IgM к антигенам M. tuberculosis

Сыворотку крови мышей использовали для определения титров специфичных антител (IgG и IgM) к микобактериальным антигенам иммуноферментным методом, рутинно применяемым в лаборатории [15, 16]. Для определения антител использовали разведения сыворотки от 1 : 50 до 1 : 400.

Определение количества IFNγ-продуцирующих клеток

Уровень протективного Т-клеточного иммунного ответа оценивали по количеству спленоцитов, секретирующих IFNγ в ответ на стимуляцию микобактериальными антигенами, методом ELIspot при помощи наборов Mouse IFNγ ELISpot Set (BD NJ; USA) и AEC Substrate Set (BD NJ; USA) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Оценка протективного ответа

Мышей линии I/St дважды иммунизировали (за 42 и 21 день до инфицирования) мРНК-вакцинными препаратами. Иммунизацию БЦЖ проводили за 35 дней до заражения.

Мышей инфицировали вирулентным штаммом M. tuberculosis в дозе 500 000 КОЕ/мышь. На 50-й день после заражения определяли количество микобактерий во внутренних органах инфицированных мышей. Для этого стерильно выделяли легкие и селезенки зараженных животных, гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора, готовили серийные десятикратные разведения гомогенатов органов и высевали на чашки Петри с агаром Мидлбрука 7Н10 по 50 мкл на чашку. Чашки Петри с нанесенными суспензиями инкубировали при 37 °С, через 21 день подсчитывали количество макроколоний M. tuberculosis H37Rv на чашке и пересчитывали их количество на орган.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента, применяя поправку Бонферрони при сравнении более двух групп. Достоверными считали различия при p < 0,05. Данные на рисунках приведены как средние значения ± SEM. Для кривых выживания использовали Гехан–Бреслоу–Уилкоксон-тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммуногенность тестируемых вакцин оценивали по их способности индуцировать специфичный клеточный иммунный ответ ex vivo (ELIspot) и in vivo (ГЗТ), а также специфичный антительный ответ в крови провакцинированных мышей (рис. 2). На рис. 2А представлены результаты определения количества IFNγ продуцирующих клеток (ИПК) в селезенках экспериментальных животных. Достоверные различия с контролем получены для мРНК вакцины 5'-ModEsat6-3'-Mod и 5'-TPL-Esat6-3'-Mod (p < 0,004 и p < 0,0008 соответственно). Среди групп животных, проиммунизированных мРНК-вакцинами, по количеству ИПК лидировала группа, получившая 5'-TPL-Esat63'-Mod (p < 0,004 и p < 0,0004 в сравнении с мРНК- вакцинами 5'-Mod-Esat6-3'-Mod, 5'-Rabb-Esat6-3'-EMCV соответственно). В то же время максимальное количество ИПК определялось в группе мышей, провакцинированных БЦЖ (p < 0,006, p < 0,006 и p < 0,03 в сравнении с мРНКвакцинами 5'-Mod-Esat6-3'-Mod, 5'-Rabb-Esat6-3'-EMCV и 5'-TPL-Esat6-3'-Mod соответственно). 

Развитие реакции ГЗТ достоверно отличалось от контроля в случае иммунизации мышей мРНК-вакциной 5'-Rabb-Esat6-3'EMCV и 5'-TPL-Esat6-3'-Mod (p < 0,04 для данных групп) и были аналогичны данным, полученным в группе мышей В6 провакцинированных БЦЖ (рис. 2Б). Достоверных различий между группами 5'-Rabb-Esat63'EMCV, 5'-TPL-Esat6-3'-Mod и БЦЖ получено не было.

Исследования формирования гуморального иммунного ответа к мРНК-противотуберкулезным вакцинным препаратам также продемонстрировали различия с контролем. Результаты определения (кривые титрования) АГ-специфичных антител класса IgG представлены на рис. 2В. Все протестированные вакцины, включая БЦЖ, стимулировали продукцию антимикобактериального IgG у проиммунизированных мышей. При этом максимальная выработка АГ-специфичных IgG среди мРНК-вакцин отмечена в ответ на иммунизацию 5'-Rabb-Esat6-3'EMCV и 5'-TPL-Esat6-3'-Mod (в сравнении с контролем). Между группами 5'-Rabb-Esat6-3'EMCV, 5'-TPL-Esat6-3'-Mod и БЦЖ достоверных различий получено не было. Уровни продукции АГ-специфичного IgM у вакцинированных мышей не отличались от контрольных (приложение 2). Таким образом, наши результаты показали, что мРНКвакцины на основе эпитопов Esat6 приводят к индукции адаптивного иммунного ответа. Несмотря на то что все варианты мРНК-вакцин были менее эффективны, чем БЦЖ, мы наблюдали выраженную разницу в их эффективности в зависимости от последовательностей UTR. Наилучшие результаты при использовании вакцины как в тестах на клеточный, так и гуморальный ответ мы наблюдали у мРНК-вакцины 5'-TPL-Esat6-3'-Mod.

Исследование развития протективного ответа проводили на мышах I/St, чувствительных к туберкулезной инфекции. На рис. 3 представлены результаты определения микобактериальной нагрузки инфицированных животных, а также динамика гибели проиммунизированных мышей после заражения. Достоверное снижение количества микобактерий в легочной ткани в сравнении с невакцинированным контролем было выявлено у мышей, проиммунизированных мРНК-вакцинами 5'-Rabb-Esat63'-EMCV, 5'-TPL-Esat6-3'-Mod и БЦЖ (рис. 3Б). Причем микобактериальная нагрузка легочной ткани в группах мышей, провакцинированных мРНК-вакциной 5'-TPL-Esat63'-Mod и БЦЖ, достоверно не различалась. В селезенке достоверные отличия от неиммунизированного контроля получены только для мышей, провакцинированных БЦЖ (рис. 3А).

Один из основных критериев наличия протективного действия вакцины — увеличение времени жизни животных после инфицирования, поэтому мы сравнили динамику гибели контрольной и экспериментальных групп мышей после заражения. Достоверные отличия от невакцинированного контроля (Гехан–Бреслоу– Уилкоксон–тест для кривых выживания) были получены для мышей, иммунизированных БЦЖ и мРНК-вакциной 5'-TPL-Esat6-3'-Mod (р = 0,0005 и р = 0,04 соответственно). Также были показаны достоверные различия в динамике гибели мышей I/St, вакцинированных БЦЖ и мРНК- вакциной 5'-TPL-Esat6-3'-Mod (р = 0,01) (рис. 3В). Аналогично результатам по индукции адаптивного ответа, мРНК вакцина 5'-TPL-Esat6-3'-Mod показала наилучшие результаты по эффективности среди мРНК-вакцин; лишь она обеспечила снижение смертности по сравнению с невакцинированными животными.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании на модели туберкулезной инфекции у мышей мы показали, что двукратное введение мРНК-вакцин, состоящих из заключенной в липидные частицы кодирующей ряд эпитопов микобактериального белка ESAT6 мРНК, генерирует протективный иммунный ответ, эффективность которого зависит, в том числе, от использованных в составе вакцины нетранслируемых последовательностей мРНК. При этом уровень стимуляции гуморального иммунного ответа разными вариантами вакцины, определяемый по интенсивности продукции специфичных антител после вакцинации, существенно отличается от уровня активации клеточного иммунитета, регистрируемого по интенсивности реакций ГЗТ и продукции IFNγ (по данным ELIspot).

Исторически сложилось, что при изучении иммунологического ответа на инфекцию, вызванную M. tuberculosis, основное внимание уделяли Т-клеткам и макрофагам, поскольку их роль в формировании гранулемы была достаточно полно охарактеризована. В отличие от этого, роль В-клеток в патофизиологии туберкулезной инфекции была изучена относительно мало. Соответственно, большинство разработанных новых противотуберкулезных вакцин сосредоточено на индукции клеточного иммунного ответа [2]. Однако в ряде недавних исследований эффективности противотуберкулезных вакцин на мышах, нечеловекообразных приматах и людях показана значительная индукция антител против M. tuberculosis, что может быть связано с наблюдаемой эффективностью вакцин [17]. В настоящем исследовании максимальная протекция (по результатам высевания микобактерий из легких и выживания мышей после заражения) среди всех мРНК-вакцин достигнута при использовании мРНКвакцины 5'-TPL-Esat6-3'-Mod. Иммунизация мРНКвакциной 5'-TPL-Esat6-3'-Mod приводит к формированию выраженного клеточного иммунного ответа и умеренному уровню продукции специфичных антимикобактериальных IgG-антител. В то же время иммунизация мышей мРНКвакциной 5'-Mod-Esat6-3'-Mod стимулирует активную выработку специфичных антител, но не сопровождается генерацией защиты и не активирует клеточный компонент адаптивного иммунного ответа. 

Мы предполагаем, что различия между тремя мРНКвакцинами, отличающимися только нетранслируемыми последовательностями, могут быть связаны с длительностью и интенсивностью трансляции мРНК и соответственно различной эффективностью презентации антигенов. Последовательность трехчастного лидера аденовирусов (TPL) действует как энхансер трансляции мРНК вирусных поздних генов и, как полагают, обладает способностью инициировать трансляцию поздних аденовирусных мРНК кэп-независимым способом [18, 19]. Последовательность 5'-UTR TPL состоит из 245 нуклеотидов и имеет сложную вторичную структуру. Показано, что TPL содержит IRES, благодаря которому он способен рекрутировать рибосому независимо от взаимодействий с кэпом [18, 19]. Однако, поскольку независимая от кэпа инициация трансляции активируется только в условиях клеточного стресса, мы предполагаем, что наши результаты по TPL не связаны с инициацией трансляции, независимой от кэпа. Помимо большей длины, последовательность TPL имеет более высокое содержание GC и сильно отрицательную минимальную свободную энергию Гибса (ΔG), что связано с ингибированием трансляции [20]. Напротив, 5'-UTR кроличьего β-глобина (Rabb) и 5'-UTR из вакцины мРНК-1273 (Moderna) имеют длину около 50 нуклеотидов и не содержит сильных вторичных структур [21]. По-видимому, вторичные структуры в 5'-UTR, возникающие без участия РНК-связывающих белков, не оказывают выраженного ингибирующего действия на трансляцию, поскольку могут раскручиваться непосредственно перед инициацией трансляции  с помощью фактора eIF4A [22]. В то же время сильная вторичная струтктура TPL может способствовать привлечению РНК-связывающих белков, которые оказывают позитивное влияние на трансляцию.

Таким образом, наиболее перспективным для дальнейших исследований выглядит мРНК-вакцина 5'-TPL-Esat6-3'-Mod. Несмотря на то что она уступает БЦЖ, дальнейшая оптимизация, включающая увеличение дозы препарата, кэпа или использование аналогов уридина могут повысить ее эффективность. Следующим этапом тестирования мРНК-вакцины 5'-TPL-Esat6-3'-Mod может стать оценка перспективности ее использования для ревакцинации после первичной вакцинации БЦЖ.   

ВЫВОДЫ

Мультиэпитопные вакцины на основе мРНК можно рассматривать в качестве самостоятельной профилактической вакцины, а также в качестве бустерной вакцины против M. tuberculosis. Несмотря на то что эффективность исследованных вариантов вакцины ниже, чем у БЦЖ, была выявлена зависимость эффективности от последовательности регуляторных регионов. Наши результаты позолили установить оптимальную комбинацию регуляторных элементов экспрессионной кассеты.

Дальнейшая разработка мРНК-вакцины против M. tuberculosis будет направлена на увеличение ее эффективности.