Малые сверхчисленные маркерные хромосомы (мСМХ) представляют собой гетерогенную группу структурно аномальных добавочных хромосом, которые не могут быть однозначно идентифицированы при стандартном цитогенетическом исследовании в силу их малых размеров и особенностей генного состава, а именно присутствия субмикроскопических вариаций числа копий участков ДНК (copy number variations, CNV) [1]. Среди новорожденных доля носителей мСМХ в популяции составляет 0,044% и 70% из них не имеют видимых клинических проявлений [2, 3]. Показано, что мСМХ могут быть производными любой из 24 хромосом человека и иметь разнообразные морфологические формы, такие как инвертированные дупликации (inv dup), кольцевые (r) и минутные (min) хромосомы [4, 5]. Среди людей с кариотипом 47,XN,+mar мСМХ чаще всего представляют собой производные хромосомы 15 (примерно 30%) и хромосомы 22 (примерно 20%) [1]. Клинические проявления, связанные с наличием мСМХ в кариотипе, могут проявляться в широком спектре — от фенотипической нормы до значительных отклонений в физическом и психомоторном развитии — и зависят от хромосом, участвующих в их образовании, наличия эухроматиновых районов, генного состава, уровня мозаицизма и однородительской дисомии.

Фенотипически нормальные носители малых сверхчисленных маркерных хромосом могут иметь CNV в виде дупликации/трипликации, локализованных в прицентромерных эухроматиновых районах [6]. Это позволяет предположить, что такие CNV не содержат дозозависимых генов, поэтому увеличение их копийности не приведет к серьезным изменениям фенотипа. За последние десятилетия накапливается все больше фактов о том, что присутствие в геноме CNV, вовлекающих довольно протяженные, размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов (м.п.н.), эухроматиновые районы, не вызывает фенотипических отклонений у их носителей [7].

Таким образом, эухроматиновые мСМХ в кариотипе асимптоматических носителей могут представлять собой идеальную модель для анализа протяженности областей генома человека, не чувствительных к изменению числа копий генов, расположенных в прицентромерных районах. Это позволит более точно определить границы, где заканчиваются дозонечувствительные регионы и начинаются участки генома, изменение копийности которых может привести к аномалиям фенотипа и задержке психомоторного развития [8]. Подробное исследование каждого случая мСМХ и накопление дополнительных данных способствуют расширению наших знаний о механизмах образования и патогенетической значимости CNV, связанных с наличием в геноме этих добавочных маркерных хромосом. Целью исследования было получить дополнительные сведения о геномной топографии участков ДНК, не чувствительных к увеличению копийности генов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования были 18 образцов периферической крови асимптоматических носителей мСМХ15 (n = 9: трое мужчин, шесть женщин) и мСМХ22 (n = 9: пятеро мужчин, четыре женщины). Критерии включения: показанием к кариотипированию было участие всех пациентов в программе вспомогательных репродуктивных технологий.

Цитогенетическое исследование GTG-окрашенных хромосом выполняли по стандартному протоколу [9].

Идентификацию маркерных хромосом проводили методом FISH с коммерческими ДНК-зондами на центромерные (перицентромерные) районы хромосомы 15 (SE 15, Kreatech; Нидерланды) и хромосомы 22 (CCP22-Pericentromeric, CytoTest Inc.; США), а также районы 15q11.2 (LSI SNRPN, Kreatech; Нидерланды) и 22q11.2 (LSI TBX1, Kreatech; Нидерланды) для исключения присутствия клинически значимых эухроматиновых районов в составе маркерной хромосомы. FISHанализ с коммерческими ДНК-зондами проводили по протоколам фирм-производителей (Kreatech, CytoTest Inc.; США). Денатурацию и гибридизацию проводили с использованием гибридизационной системы ThermoBrite (StatSpin; США). Анализ поводили с использованием эпифлуоресцентного микроскопа AxioImager M.1 (Carl Zeiss; Германия) и компьютерной программы обработки цифровых изображений Isis (MetaSystems; Германия)

Основополагающим этапом исследования были разработка собственных (несерийных) ДНК-зондов на прицентромерный эухроматин хромосом 15 и 22 и проведение FISH-анализа для выявления CNV, потенциально не чувствительных к увеличению копийности участков ДНК. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer-BLAST NCBI [10] и базы данных UCSC Genome Browser [11]. Для проверки специфичности выбранных праймеров использовали программу OligoAnalyzer™ Tool [12]. Праймеры были синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия). Нуклеотидные последовательности подобранных ДНК-праймеров представлены в табл. 1.

Последовательности подобранных ДНК-праймеров были использованы для проведения LR-ПЦР с использованием набора BioMaster LR HS-PCR (2x) («БиолабМикс»; Россия) на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems; США) в соответствии с протоколом производителя [13]. Полученные ампликоны очищали на колонках с использованием набора diaGene для очистки ДНК из реакционных смесей («Диаэм»; Россия) согласно инструкции производителя, с последующим объединением в одну пробирку очищенных продуктов ПЦР для получения ДНК-зонда размером 10–30 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н). С целью введения флуоресцентной метки в ДНК-зонд использовали метод nick-трансляции [14–16].

Для проведения FISH с несерийными ДНК-зондами использовали раздельную денатурацию ДНК на хромосомном препарате и ДНК-зонда [14, 15, 17].

Для контрокрашивания хромосом использовали DAPI I (Abbott Molecular; США) в растворе Vectashield (Vector Labs; США) в соотношении 1:20. Для анализа изображений метафазных хромосом использовали программу обработки цифровых изображений Isis (MetaSystems; Германия), установленную в комплексе с эпифлуоресцентным микроскопом AxioImager M.1 (Carl Zeiss; Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При стандартном цитогенетическом исследовании у всех пациентов (n = 18) выявлен кариотип с дополнительной маркерной хромосомой — 47,XN,+mar. Во всех случаях отмечали мозаицизм с высоким уровнем аномального клона (более 40%). FISH с коммерческими ДНК-зондами на центромерные районы акроцентрических хромосом позволил в девяти случаях идентифицировать мСМХ как производную хромосомы 15 и в девяти случаях — как производную хромосомы 22 (рис. 1А). Кроме того, результаты молекулярно-цитогенетического анализа подтвердили отсутствие клинически значимых CNV на малых сверхчисленных маркерных хромосомах во всех наблюдаемых случаях (рис. 1Б).

FISH-анализ для выявления CNV в проксимальных эухроматиновых районах был проведен на хромосомных препаратах из культивированных лимфоцитов всех 18-ти асимптоматических носителей мСМХ — производных хромосом 15 и 22. Для этой цели были разработаны несерийные локус-специфичные ДНК-зонды (hm). В выборе локализации этих ДНК-зондов мы руководствовались сведениями об областях прицентромерного эухроматина на хромосомах 15 и 22, не чувствительных к дозе генов. Для хромосомы 15 она составляет 3 м.п.н. а для хромосомы 22 — около 100 т.п.н. [7, 18] Таким образом, для хромосомы 15 были разработаны два hm размером порядка 10–30 т. п. н. Ближний по отношению к центромере проксимальный (hm-15-prox) ДНК-зонд расположен на расстоянии 1,2 м.п.н. от прицентромерного гетерохроматина, в то время как дистальный ДНК-зонд (hm-15-dist) локализован на расстоянии 2,2 м.п.н. от прицентромерного гетерохроматина хромосомы 15 (рис. 2А). Интервал между двумя ДНК-зондами составил в 1 м.п.н. Для изучения района прицентромерного эухроматина хромосомы 22 были разработаны три несерийных локусспецифичных ДНК-зонда (hm) длиной порядка 30 т.п.н. Ближний по отношению к центромере проксимальный ДНК-зонд (hm-22-proximal) локализован на расстоянии 478 т.п.н. от прицентромерного гетерохроматина, медианный ДНК-зонд (hm-22-median) — на расстоянии 714 т.п.н. от прицентромерного гетерохроматина и дистальный (hm-22-distal) ДНК-зонд, дальний по отношению к центромере, — на расстоянии 1,2 м.п.н. от прицентромерного гетерохроматина хромосомы 22 (рис. 2Б).

Результат FISH-исследования прицентромерных эухроматиновых районов мСМХ, производных хромосом 15 и 22, с разработанными несерийными ДНК-зондами представлен в табл. 2, во всех случаях было проанализировано 30 метафазных пластинок.

Как видно из табл. 2, у четырех пациентов с мСМХ15 и восьми пациентов с мСМХ22 прицентромерный эухроматин обнаружен не был, т. е. маркерные хромосомы содержали только гетерохроматиновые районы.

У пяти пациентов (№ 3, 6–9, табл. 2) на мСМХ, производной хромосомы 15, выявлен прицентромерный эухроматин, однако детектировался только гибридизационный сигнал от проксимального ДНК-зонда, т. е. размер эухроматинового района не превышал 1,2 м.п.н. от прицентромерного гетерохроматина хромосомы 15 (рис. 3).

В одном случае (11 из табл. 2) на мСМХ 22 был выявлен прицентромерный эухроматин при гибридизации с двумя несерийными ДНК-зондами, а именно с проксимальным и медианным, соответственно, размер вовлеченного в хромосомную перестройку дисбаланса составил суммарно 714 т.п.н. (рис. 4).

Таким образом, у носителей мСМХ, производных хромосом 15 и 22, без видимых клинических проявлений в 67% случаев (12/18) маркерные хромосомы содержат только гетерохроматиновые районы, а в 33% случаев определены участки эухроматина в прицентромерных районах длинных плеч хромосом 15 и 22, размером 1,2 м.п.н. (chr15 [hg19]: 20 700 000–21 910 881) и 714 т.п.н. (chr22 [hg19]: 17 900 000–18 614 436) соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Малые сверхчисленные маркерные хромосомы представляют собой редкую хромосомную аномалию, поскольку они одновременно являются числовой и структурной перестройкой [18]. Клинические проявления при мСМХ варьируют, но для некоторых описаны синдромные формы — например, синдром кошачьего глаза (MIM#115470), синдром Эмануэль (MIM#609029), синдром Паллистера–Киллиана (MIM#601803) и синдром изохромосомы 18р (MIM#614290) ([OMIM — Online Mendelian Inheritance in Man; [19]).

Чаще всего особенности клинической картины в значительной степени объясняются вовлечением эухроматина в хромосомный дисбаланс, а именно с наличием (или отсутствием) чувствительных к дозе генов в прицентромерных эухроматиновых областях. Тем не менее, конкретные гены до сих пор не идентифицированы [7].

С развитием методов молекулярно-цитогенетического исследования появилась возможность определить хромосомное происхождение мСМХ и классифицировать их на основе наличия или отсутствия эухроматиновых районов, что облегчает анализ связи мСМХ с клиническими аномалиями фенотипа [6]. Лабораторные подходы к диагностике и изучению мСМХ широко представлены в литературе [20–22]. Наиболее часто для идентификации структуры и определения генного состава используют метод флуоресцентной гибридизации in situ и хромосомный микроматричный анализ. Из недостатков последнего — трудности в интерпретации точного уровня мозаицизма, что является важным моментом, учитывая высокую частоту мозаичных форм мСМХ [1]. Использование FISH-метода более предпочтительно, но коммерческие ДНК-зонды не всегда покрывают интересующие хромосомные регионы. Таким образом, все большее значение приобретают несерийные ДНК-зонды, разработанные для решения конкретной задачи. В одном из исследований обсуждается возможность применения разработанного авторами набора PeCR-FISH для определения прицентромерного эухроматина в составе мСМХ, и было показано, что локус-специфичные несерийные ДНК-зонды на основе BAC-клонов могут быть использованы для определения точного размера мСМХ и вовлеченности прицентромерного эухроматина [7]. В представленном исследовании были разработаны собственные несерийные олигонуклеотидные ДНК-зонды на прицентромерный эухроматин хромосом 15 и 22. Результаты FISH-анализа демонстрируют высокое качество гибридизационных сигналов и, как следствие, возможность использования такого подхода для изучения прицентромерного эухроматина у носителей мСМХ.

Полученные нами данные о размере прицентромерного эухроматина у асимптоматических носителей мСМХ 15 и 22 согласуются с известными литературными данными и дополняют их. На сегодняшний день опубликовано довольно много случаев присутствия в кариотипе мСМХ15 у пациентов без видимых аномалий фенотипа, а именно 418 случая, согласно базе данных по маркерным хромосомам (ChromosOmics — Database [23]), и большинство из них имеют в составе только гетерохроматин. Описанные случаи мСМХ с вовлечением эухроматина, не считая пренатальных, немногочисленны [18]. Так, например, установлено, что у асимптоматической носительницы мСМХ15 с бесплодием в анамнезе протяженность не чувствительного к дозе генов региона составляет 3,8 м.п.н. (15-O-q11.2/2-6 в вышеуказанной базе данных). Стоит отметить, что у пациентки отмечали высокоуровневый мозаицизм (74% по аномальному клону). Регион проксимального прицентромерного эухроматина, выявленный у пяти асимптоматических носителей мСМХ15 в нашей выборки, оказался менее протяженным (1,2 м.п.н.), чем описанный ранее «некритический» регион, что позволяет существенно дополнить базу данных нечувствительного к дозе генов региона маркерной хромосомы 15.

Количество публикаций по исследованию мСМХ22 у асимптоматических носителей значительно меньше, что коррелирует с частотой встречаемости этой хромосомной аномалии [24]. На сегодняшний день опубликованы данные о 156 таких пациентов (согласно данным сайта), у большинства из которых в состав мСМХ входит только гетерохроматин [23]. Показано, что размер не чувствительного к дозе генов прицентромерного эухроматина хромосомы 22 при трипликации составляет около 100 т.п.н. Однако важно отметить, что описанный случай единичный и представлен детекцией трипликации у плода, т. е. выявлен при пренатальном исследовании, при этом после рождения отмечен нормальный фенотип [7, 18]. В выявленном нами случае размер прицентромерного эухроматина хромосомы 22 у асимптоматического носителя мСМХ22 составил 714 т.п.н., что значительно превышает по размеру описанные данные относительно «некритического» проксимального региона q-плеча хромосомы 22. Полученные новые данные о размере нечувствительного к дозе генов проксимального эухроматина хромосомы 22 могут иметь важное значение для пренатальной диагностики случаев выявления геномного дисбаланса хромосомы 22 (дупликации, трипликации) такого размера при проведении высокопроизводительного секвенирования или хромосомного микроматричного анализа.

ВЫВОДЫ

Проведенные нами исследования указывают на то, что, по-видимому, в прицентромерном эухроматине длинного плеча хромосомы 15 (chr15 (hg19): 20 700 000–21 910 881) и длинного плеча хромосомы 22 (chr22 (hg19): 17 900 000–18 614 436) не присутствуют гены, потенциально чувствительные к увеличению копийности участков ДНК. Геномный дисбаланс, представленный дупликацией/трипликацией этих районов, не приводит к нарушению интеллектуального развития и аномалиям развития. Разработанный подход с использованием несерийных ДНК-зондов демонстрирует высокую чувствительность и специфичность FISH-метода для анализа прицентромерного эухроматина хромосом 15 и 22.