В ведущих странах мира масс-спектрометрия является одним из новейших, но в то же время самым востребованным методом лабораторной медицины. Детальное изучение метаболома без применения масс-спектрометрии невозможно, и для развития инновационных технологий персонализированной медицины, обеспечивающих переход от реактивной к предсказательной и превентивной медицине, большое значение приобретают массивы данных, полученных этим методом. Так как наиболее перспективным направлением в решении комплекса задач персонализированной медицины является внедрение в практику профилактических обследований и информационных технологий для разработки алгоритмов диагностики заболеваний, метод тандемной масс-спектрометрии представляется наиболее подходящим для реализации этих направлений [1–3].

По частоте встречаемости нарушения метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов нередки по сравнению с другими наследственными болезнями обмена. Большинство врожденных нарушений метаболизма, многие из которых представляют собой ацидемии и проявляются в период новорожденности, встречаются с частотой 1:1000 – 1: 5000 новорожденных. Индивидуальная патогенетическая картина нарушений обмена аминокислот и ацилкарнитинов осложнена тем, что отдельные клинические признаки в различных сочетаниях и в различной степени выраженности, могут проявляться при разных типах нарушения обмена. В результате, только своевременная лабораторная диагностика, с помощью высокотехнологичных методов хроматографического анализа, может помочь в выявлении пациентов с данными патологиями.

Целью данной работы было определить эффективность основных (классических) маркеров нарушений обмена аминокислот и ацилкарнитинов, детектируемых хроматомасс-спектрометрическими методами, в диагностике наследственных болезней обмена и создать специфические панели наиболее эффективных показателей, а также определить потенциальную диагностическую эффективность выявления взаимосвязей между масс-спектрометрическими показателями у детей с наследственными болезнями обмена аминокислот и ацилкарнитинов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в научно-исследовательском клиническом институте педиатрии имени академика Вельтищева обособленного структурного подразделения ФГАОУ ВО РНИМУ имени Н. И. Пирогова Министерства здравоохранения России, а также в Государственном бюджетном учреждении «Научно-практический центр специализированной помощи детям им. В. Ф. ВойноЯсенецкого» в период с 2012 по 2023 гг.

Группу больных составили дети и подростки с подозрением на аминоацидопатии и органические ацидурии/ацидемии, а также пациенты с диагностически недифференцированными патологиями обмена веществ. Возраст пациентов, вошедших в группу, составил от 6 месяцев до 16 лет. По полу группа пациентов распределялась следующим образом: 48 мальчиков и 32 девочки. Критерии включения: дети с момента рождения и до 18 лет; наличие в анамнезе следующей симптоматики: задержка психомоторного и физического развития, судороги, нарушение мышечного тонуса, атаксия, наличие комплексной симптоматики с увеличением печени, снижением остроты зрения, дерматитом. Критерии исключения: возраст старше 18 лет, наличие сопутствующих заболеваний с тяжелым течением (например, детский церебральный паралич, врожденные пороки развития почек и мочевыводящих путей, тяжелые сердечно-сосудистые патологии), которые могли осложнить выполнение условий обследования или навредить пациенту. В группу сравнения для этой группы больных вошли 35 детей с подозрением на пероксисомные болезни обмена. Критерии включения в группу сравнения: возраст до 18 лет, наличие в анамнезе резких и характерных дефектов миграции нейронов, микроузелкового цирроза печени, кист почек, точечных хондродисплазий, помутнения роговицы, катаракты, глаукомы и ретинопатии, врожденных пороков сердца и дизморфических проявлений. Контрольная группа состояла из 40 практически здоровых детей разных возрастных групп.

В исследовании использовали методику количественного определения 12 аминокислот и 30 ацилкарнитинов в сухих пятнах крови методом высокоэффективной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией [4–7], которая была модифицирована следующим образом: для повышения чувствительности оптимизированы параметры массспектрометрического детектирования всех аналитов, а для сокращения времени анализа единичного образца — увеличена скорость потока элюента.

Стандартные образцы: лиофилизированная смесь внутренних стандартов MassChrom®AminoAcids and Acylcarnitines (Chromsystems; Германия).

Реактивы: ацетонитрил (LC/MS Grade) (Fisher Scientific; США), бутанол-1 (ч.д.а.; «Химмед», Россия), n-бутилацетат (ч.д.а.; «Химмед», Россия), соляная кислота (ч.д.а.; «Химмед», Россия), метанол (ч.д.а.; Sigma-Aldrich, Германия).

Лабораторные посуда и материалы: фильтровальная бумага для отбора биопроб Whatman 903® (Whatman; США), 96-луночный микропланшет c защитной адгезионной пленкой (Eppendorf; Германия).

Лабораторное оборудование: панчер DSB Puncher (PerkinElmer; США), термошейкер ST-3 (ELMI; Латвия), испарительная система (модель EVA EC-S) (VLM; Германия), дозаторы механические одноканальные Sartorius (модель Biohit Proline) (Sartorius Biohit Liquid Handling Oy; Финляндия) следующих объемов: 0–100,0 мкл, 0–200,0 мкл с оригинальными одноразовыми наконечниками.

Забор биоматериала

Образец крови из пятки новорожденного или пальца пациента старшего возраста забирали на специальную бумагу Whatman 903® в виде бланков для взятия капиллярной крови и сушили при комнатной температуре до полного высыхания. Пропитанную биоматериалом специальную бумагу хранили при комнатной температуре, до одного месяца.

Пробоподготовка биоматериала

Для проведения анализа из сухого пятна пробы крови при помощи панчера вырезали круг диаметром 3,1 мм (соответствует 3,2 мкл образца крови), который помещали в лунку микропланшета. Для экстракции к нему добавляли 200,0 мкл смеси внутренних стандартов (предварительно растворенной в ацетонитриле), далее микропланшет во избежание испарения и разбрызгивания образца закрывали защитной адгезионной пленкой и перемешивали на шейкере при 600 об./мин в течение 20 мин при комнатной температуре. Для упаривания с микропланшета удаляли защитную пленку, после чего образец упаривали при 60 °С в токе воздуха досуха. Для дериватизации образца к его сухому остатку в микропланшете добавляли 60,0 мкл дериватизирующего реагента (смесь бутанола-1, n-бутилацетата, соляной кислоты в объемном соотношении 7 : 2 : 1), после этого микропланшет закрывали защитной пленкой и инкубировали при 60 °С и 600 об./мин в течение 15 мин. Для концентрирования образца с микропланшета удаляли защитную пленку, и образец упаривали в токе воздуха досуха. Заключительный этап пробоподготовки включал в себя перерастворение сухого остатка в 10,0 мкл метанола, после чего образец перемешивали при 600 об./мин в течение 1 мин при комнатной температуре. В ВЭЖХ-систему вводили 10,0 мкл подготовленного образца.

Хроматографические условия

Анализ выполняли с использованием ВЭЖХ-системы, состоящей из двойного градиентного насоса Agilent 1200, вакуумного дегазатора, термостата хроматографических колонок и автосэплера CTC HTS PAL, соединенных с массдетектором Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies; США). В качестве колонки использовали муфту-переходник, в качестве мобильной фазы и раствора для промывки иглы инжектора — ацетонитрил. Настройки ВЭЖХсистемы: объем инжекции — 10,0 мкл, время анализа — 1,7 мин, скорость потока подвижной фазы во время уравновешивания системы — 0,5 мл/мин.

Обработка данных

Полученные данные выполняли с помощью программного обеспечения МassHunter® (Agilent Technologies; США).

Количественное определение аналитов проводили по методу внутреннего стандарта. Концентрацию каждого аналита в образце вычисляли по формуле (1) как отношение интенсивности его аналитического сигнала в образце к интенсивности аналитического сигнала соответствующего внутреннего стандарта в этом же образце, с последующим умножением на концентрацию данного внутреннего стандарта в смеси внутренних стандартов (калибровочной смеси):

c_(A, мкмоль/л) = (〖A_A〗_ )/A_IS × c_(IS, ммоль/л), (1)

где c_(A, мкмоль/л) — концентрация аналита в образце (мкмоль/л); A_A — интенсивность аналитического сигнала аналита в образце; c_(IS, ммоль/л) — концентрация внутреннего стандарта в калибровочной смеси (мкмоль/л); A_IS — интенсивность аналитического сигнала внутреннего стандарта в образце.

Концентрации всех внутренних стандартов в смеси MassChrom®AminoAcids and Acylcarnitines (Chromsystems; Германия, регистрационное удостоверение № РЗН 2018/7415 от 27.07.2018) были приведены в соответствующей сопроводительной документациии.

Валидационные характеристики методики

В зависимости от аналита степень извлечения аминокислот и ацилкарнитинов из сухих пятен крови составила 69–97%; предел обнаружения для аминокислот варьировался от 2,0 до 15,6 мкмоль/л, для ацилкарнитинов — от 0,1 до 1,6 мкмоль/л; коэффициент вариации для всех аналитов был в диапазоне от 3,4 до 15,6%; диапазон линейности аминокислот доходил до 2000 мкмоль/л, ацилкарнитинов — до 200 мкмоль/л.

Для доказательства диагностической значимости использовали метод построения ROC-кривых [8]. Также использовали иерархический кластерный анализ и тепловые карты на основе корреляции по Спирмену. Корреляционный анализ проводили с помощью языка программирования R, а также сравнивали значения медиан с интерквартильными диапазонами. Результаты обрабатывали с помощью статистической программы Morpheus и пакета статистических и прикладных программ для персонального компьютера SPSS Statistics 23® (IBM Corporation; США), Statistica 6.0® (StatSoftInc.; США), Excel’2007® (MicroSoft Corp.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам анализа сухих пятен крови 80 детей из первой группы с подозрением на аминоацидопатии и органические ацидемии/ацидурии на основании характерных клинико-лабораторных данных выявлено 54 пациента с моногенными заболеваниями: аминоацидопатиями, органическими ацидемиями, дефектами окисления жирных кислот и дефектом транспорта карнитина, впоследствии данные диагнозы были верифицированы молекулярногенетическими методами (таблица). По результатам анализа пятен крови 35 детей из группы сравнения (пациенты с подозрением на пероксисомные болезни) у пятерых пациентов выявлен низкий уровень свободного карнитина (С0) в крови (в диапазоне значений 10–16 мкмоль/л, при диапазоне референсного интервала 19–45 мкмоль/л), что может свидетельствовать о наличии у них других нарушений метаболизма, например вторичного дефицита карнитина. У остальных пациентов все показатели были в пределах референсного интервала или на их верхней границе. Результаты анализа сухих пятен крови 40 детей из контрольной группы подтвердили, что в нее вошли практически здоровые дети, так как у всех детей все исследуемые показатели были в пределах референсного интервала.

При сравнении медиан с интерквартильными диапазонами для маркерных метаболитов у обследованных из группы сравнения и у пациентов с выявленными НБО веществ видно их значимое (в 10–100 раз) различие. В качестве примеров приведено сравнение уровней маркерных метаболитов у обследованных из группы сравнения и у пациентов с выявленными наследственными нарушениями обмена аминокислот: фенилкетонурией (более чем в 100 раз), некетотической гиперглицинемией и гипераммониемией (рис. 1).

Обращает на себя внимание, что у пациентов с метилмалоновой ацидемией уровень основного маркера данной патологии — пропионилкарнитина (С3) значительно выше по сравнению с таковым у обледованных из группы сравнения, тогда как у пациентов с гомоцистинурией наблюдается противоположная тенденция — у пациентов с патологией уровень основного меркера — метионина (Met) ниже по сравнению с таковым у обледованных из группы сравнения (рис. 2).

Приведенные выше примеры подтверждают диагностическую значимость биохимических маркеров, определяемых хромато-масс-спектрометрическими методами в настоящем исследовании, при проведении диагностики НБО аминокислот, ацилкарнитинов.

На рис. 3 представлена тепловая карта с дендрограммой для пациентов с выявленными НБО аминокислот и ацилкарнитинов, на которой в строках представлены данные по каждому пациенту с выявленной патологией, в столбцах — по анализируемым метаболитам, а потенциальные маркеры сгруппированы с помощью кластерного анализа.

При подробном рассмотрении данных, представленных в правом верхнем углу тепловой карты, отмечается снижение уровня короткоцепочечных и длинноцепочечных ацилкарнитинов в крови у пациентов с фенилкетонурией по сравнению с таковым у обследованных из группы сравнения, при сохранении содержания среднецепочечных ацилкарнитинов. Эти результаты подтверждены для ацилкарнитинов C12, С14, C14:1, С16, C16:1, C18, C18:1, С5, C5OH непараметрическим критерием Манна–Уитни при p < 0,05. Таким образом, ацилкарнитиновый профиль может быть предложен в качестве потенциального дополнительного маркера при пограничных показателях фенилаланина.

Тенденция к снижению различных показателей ацилкарнитинового профиля (коротко-, средне-, и длинноцепочечных ацилкарнитинов) также наблюдается у пациентов с цитруллинемией и некетотической гиперглицинемией. Несмотря на то что эти данные не достаточны для формулировки значимых статистических выводов, они, определенно, являются основанием для проведения дальнейших исследований по выявлению групп маркерных метаболитов для диагностики НБО аминокислот.

Для редких заболеваний специфичность намного более важный параметр, чем чувствительность, поэтому тесты с высокой специфичностью более диагностически эффективны [9]. На рис. 4 представлена ROC-кривая для суммы нормализованных показателей ацилкарнитинов (С12+С16). Высокое значение площади под кривой (более > 0,9), специфичности (близко к 100%) и чувствительности (выше 80%) позволяют предложить данный показатель в качестве потенциального вторичного маркера фенилкетонурии.

Несомненно, для диагностики фенилкетонурии уровень фенилаланина — один из самых значимых диагностических маркеров по сравнению с другими, но дальнейшее изучение профиля ацилкарнитинов даст возможность с его помощью дифференцировать фенилкетонурию от других гиперфенилаланинемий.

Данные примеры позволяют с уверенностью сказать, что иерархический кластерный анализ может служить надежным помощником лечащим врачам в дифференциальной диагностике наследственных болезней обмена у детей.

Между некоторыми маркерами и группами маркеров, отобранных по результатам кластерного анализа, был проведен корреляционный анализ. Его результаты представлены в виде рисунков, на которых делениями обозначены оси абсцисс и ординат для гистограмм, по диагонали расположен график распределения концентрации каждого маркерного метаболита; под диагональю представлены графики корреляционной зависимости между двумя переменными, над диагональю — значения коэффициентов корреляции и уровни их значимости.

Как и ожидалось, наиболее метаболически близкие соединения, например короткоцепочечные ацилкарнитины, имели наиболее высокую степень корреляции (рис. 5).

Однако корреляционная взаимосвязь проявлялась и среди метаболически слабо связанных аминокислот, например, метионином и тирозином (r = 0,73), а также содержание орнитина имело достаточно выраженную корреляцию с уровнями аспарагиновой кислоты, глицина и глутаминовой кислоты (r = 0,55 и 0,43). Содержание последней, в свою очередь, коррелировало с уровнями глицина, аланина и орнитина (r = 0,47, 0,45 и 0,48 соответственно) (рис. 6).

Высокую корреляцию свободного карнитина (С0) с ацетилкарнитином (С2) и бутирилкарнитином (С4) подтверждают результаты корреляционного анализа: r = 0,46 и 0,48 соответственно (р < 0,001).

Высокая корреляция между всеми маркерами, входящими в группу длинноцепочечных ациалкарнитинов (С12, С14, С16, С18), позволяет использовать данную группу маркеров комплексно, т. е. в виде единого профиля — коэффициент корреляции между этими маркерами вариьировался от 0,69 до 0,88 (р < 0,001).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нашей стране внедрением и применением метода хромато-масс-спектрометрии в клинической лабораторной диагностике занимаются более 10 лет, и опубликованные работы отражают практическую значимость применения этого метода для врачей различных специальностей в диагностике различных заболеваний и нозоологий, и особенно, наследственных болезней обмена [10, 11]. Опубликованные работы содержат информацию о применении различных разработанных методик качественного и количественного определения маркеров метаболических нарушений для диагностики врожденных и приобретенных нарушений метаболизма, но корелляционный анализ показателей различных групп маркеров не проводился, и разные группы маркеров между собой не сравнивали. В опубликованных работах не проводили анализ массива данных и поиск новых статистически значимых маркеров [12, 13]. В то же время тактику анализа массивов данных сейчас стала активно применять в лабораторной диагностике. Большие объемы выборок позволяют создать на их основе массивы данных, которые дают возможность использовать параметрические критерии, применяемые в разных видах статистического (кластерного, корреляционного) анализа, что служит дополнительным инструментом в поиске новых лабораторных маркеров и оценке их диагностической эффективности. Было опубликовано несколько статей, где изучение всего массива данных по концентрациям аминокислот и ацилкарнитинов и поиска корреляций между этими группами метаболитов давало дополнительную информацию и позволяло проводить ассоциации и разрабатывать алгоритмы диагностики различных патологий обмена веществ, таких как диабет 2-го типа и метаболический синдром [14, 15]. Так, прогностическая модель, содержащая панель ацилкарнитинов и аминокислот, улучшила классификацию случаев диабета, по сравнению с моделью, содержащей исключительно установленные факторы риска [15]. В то же время исследований по изучению массивов данных по концентрациям аминокислот и ацилкарнитинов в педиатрической популяции не было, данные группы метаболитов всегда рассматривали отдельно друг от друга.

ВЫВОДЫ

Анализ экспериментальных данных показал, что для классических маркеров нарушений метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов подтверждена их эффективность в диагностике наследственных болезней обмена. Проведенная статистическая обработка позволила выявить новые маркеры и маркерные профили, которые помогут проводить более тщательную дифференциальную диагностику наследственных болезней обмена веществ. Выявленные взаимосвязи между масс-спектрометрическими показателями разных групп (аминокислот и ацилкарнитинов) имеют потенциальную диагностическую эффективность при обследовании детей на наследственные болезни обмена. Ацилкарнитиновый профиль может быть предложен в качестве потенциального дополнительного маркера при пограничных показателях фенилаланина, у пациентов с цитруллинемией и некетотической гиперглицинемией, суммы нормализованных показателей ацилкарнитинов (С12+С16) могут быть предложены в качестве потенциального вторичного маркера фенилкетонурии, а высокая корреляция между всеми маркерами, входящими в группу длинноцепочечных ациалкарнитинов (С12, С14, С16, С18), позволяет использовать данную группу маркеров комплексно, т. е. в виде единого профиля.