Повышение эффективности производства биотерапевтических препаратов — одна из ключевых задач современной фармацевтики. В зависимости от желаемого состава препарата лимитирующей стадией может быть поиск природного источника или разработка его искусственного аналога, увеличение эффективности производства источником или решение задачи по оптимизации очистки от примесей и неэффективных форм [1, 2]. Наш коллектив авторов хочет осветить потенциал использования неклассических клеточных культур для решения вышеперечисленных проблем.

Самое широкое применение клеточные культуры нашли в производстве биотерапевтических белковых препаратов, среди которых наиболее значимы моноклональные антитела. Флагманом считают культуру клеток яичника китайского хомячка (chinese hamster ovary, CHO), которая сочетает в себе простоту культивации и быстрый рост, гарантирует корректную трансляцию, сворачивание и посттрансляционную модификацию рекомбинатного белка, а также способна к выделению в культуральную среду больших количеств продукта, что позволяет достичь наибольших выходов целевого препарата среди всех клеточных культур млекопитающих [3]. Недостатки всех культур клеток млекопитающих, включая CHO, — высокая стоимость и необходимость особых условий работы и оборудования, а также подверженность метаболической нагрузке (metabolic burden). Внешние проявления метаболической нагрузки выражены в том, что, начиная с определенных значений выхода рекомбинантного белка перестают работать стандартные технологии по его увеличению, такие как повышение числа копий рекомбинантного гена, использование более сильных регуляторных последовательностей и т. д. [4]. Причина заключается в том, что на данном этапе рекомбинантные процессы начинают конкурировать за ресурсы клеточной машинерии со внутренними процессами клетки-хозяина, необходимыми для поддержания ее жизнеспособности: всего насчитывается порядка 8–10 точек напряженности, включающих в себя процессы транскрипции, трансляции, посттрансляционных модификаций и экспорта белков [5]. Для преодоления негативных последствий метаболической нагрузки используют различные механизмы балансировки метаболизма, однако этот процесс очень трудоемкий, поскольку необходимо определить все лимитирующие стадии [6] и подобрать такой метод их преодоления, который не скажется на общей жизнеспособности клеткипродуцента [7, 8]. Однако даже успешная балансировка метаболизма может не привести к значительному повышению выхода рекомбинантного белка, поскольку производство некоторых биотерапевтических белков может быть настолько трудозатратным для клетки млекопитающего, что все попытки его оптимизации будут упираться в физиологические пределы клетки-хозяина. Так, например, рекомбинантное производство фактора свертывания крови VIII (F8) в культуре CHO может быть оценено в «энергетическую стоимость» около 10 000 молекул АТФ в расчете на одну функциональную молекулу F8 [5].  

Альтернативным подходом может стать применение для наработки белковых препаратов такого организмапродуцента, физиологические ресурсы которого исходно выше, чем у клеток млекопитающих: клетки других видов животных или ортогональные клеточные системы, например культура клеток растений (см. таблица). Одно из основных преимуществ биотерапевтических соединений растительного происхождения заключается в их высокой безопасности. Это обусловлено невозможностью заражения человеческими патогенами, отсутствием продукции эндотоксинов и сниженной иммуногенностью, в результате чего улучшается переносимость препаратов, а побочные эффекты минимизируются. Например, талиглюцераза альфа (β-D-глюкозил-Nацилсфингозинглюкогидролаза), вырабатываемая в клетках трансгенной моркови для лечения болезни Гоше 1-го типа, в ходе клинических испытаний не продемонстрировала явных побочных эффектов, связанных с N-гликановыми остатками. Также не было обнаружено антител к данному препарату [9]. Кроме того, культуры растительных клеток подходят для пероральной доставки биологических препаратов без очистки или с минимальной очисткой. Стенки растительных клеток могут защищать биопрепараты от ферментативной деградации в желудочно-кишечном тракте, а также способствовать доставке этих препаратов в лимфоидную ткань кишечника в активной форме. Производство пероральных биофармацевтических препаратов из съедобных растительных тканей показало свою эффективность и в клинических испытаниях вакцин [10].

Другим важным аспектом применения культур растительных клеток является достижение высокого уровня экспрессии мультибелковых комплексов, требующих сложных процессов сворачивания и сборки. Для увеличения выхода таких белков могут быть использованы стратегии конструирования одного вектора с набором рекомбинантных генов и совместный биосинтез рекомбинантных белков вместе с шаперонами того же происхождения [11]. Кроме того, введение экзогенной сигнальной последовательности, направляющей белок по определенному секреторному пути, может способствовать увеличению выхода малых белков массой менее 30 кДа. Оптимизация процесса ферментации, включая непрерывную или полунепрерывную ферментацию, рассматривается нами как универсальный метод для повышения выхода белка при использовании как культур растительных клеток, так и культур клеток насекомых.

Для производства биотерапевтических белков в системах бакуловирусной экспрессии также широко применяют клеточные линии насекомых Spodoptera frugiperda Sf21, Sf9 и Trichoplusia ni BTI 5B1-4 (High Five) — адгезивные неперемиссивные культуры, полученные из тканей яичников соответствующих насекомых [12]. Имея схожие механизмы посттрансляционной модификации белков, культуры клеток насекомых представляют собой удобный, экономически выгодный и масштабируемый инструмент для производства вакцинных антигенов и вирусоподобных частиц [13]. Кроме того, сконструированные бакуловирусы с промоторами млекопитающих обладают значительным потенциалом в качестве векторов для доставки генов в клетки млекопитающих [14]. Паттерн гликозилирования в этих экспрессионных системах немного отличается от человеческого, однако задачи гуманизированного гликозилирования можно успешно решить с помощью параллельной экспрессии гликотрансфераз млекопитающих, а также удаления специфических для насекомых альфа-1,3-фукозилированных гликанов, которые могут быть аллергенными для человека. В культурах клеток насекомых производят белки-антигены, потенциально являющиеся вакцинными кандидатами против COVID-19 [15–17] и малярии [18].

Использование технологии CRISPR может значительно ускорить получение стабильных экспрессионных гликоинженерных линий насекомых. Ранее было показано, что CRISPR можно применять для нокаутирования генов в клеточных линиях Drosophila и Bombyx, а также для нокаута гена N-ацетилглюкозаминидазы на клеточной линии S2, что приводит к кратному увеличению количества концевых остатков GlcNAc в рекомбинантном эритропоэтине человека [19]. Перспективным направлением представляется также модификация линий Sf9 и High Five, например, множественная дупликация генов гликотрансферазы млекопитающих может обеспечить еще более высокий уровень экспрессии белков с корректным гликозилированием и фолдингом.

Альтернативным решением для ряда биомедицинских применений могут также стать клеточные линии червей. Так, эмбриональные клеточные культуры из C. elegans используют для изучения процессов дифференцировки клеток, морфогенеза и динамики генной экспрессии, что открывает широкий спектр недоступных ранее экспериментальных возможностей [20]. Соматические клетки из различных тканей C. elegans (включая нейроны, мышечные клетки, клетки гиподермы и кишечника) могут быть культивированы для целенаправленного изучения тканево-специфических взаимодействий и сигнальных путей [21]. Клеточная культура паразитического плоского червя Schistosoma mansoni, способная к непрерывной культивации в течение 6 месяцев [22], также может стать интересным инструментом для изучения взаимодействий паразит–хозяин, а также тестирования антигельминтных препаратов. Многие виды морских червей являются источниками биологически активных соединений, в том числе пептидов с антимикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим, антиоксидантным и антигипоксическим действием [23]. Разработка и оптимизация технологий выделения и длительной культивации клеток червей могла бы дать толчок для скрининга и последующей эффективной наработки таких биологически активных веществ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование неклассических клеточных культур является перспективным направлением повышения эффективности производства биотерапевтических препаратов. Ряд особенностей механизмов экспрессии в альтернативных культурах позволяет минимизировать побочные эффекты и улучшить переносимость получаемых белковых препаратов. Также альтернативные организмыпродуценты помогают обойти ограничения, связанные с повышенной метаболической нагрузкой в культурах клеток млекопитающих. Это открывает двери для разработки и производства более эффективных и доступных биотерапевтических препаратов, способствуя прогрессу в области фармацевтики и медицины.