Нейроглия центральной нервной системы включает в себя совокупность ненейронных клеток, необходимых для обеспечения нормальной жизнедеятельности нейронов: транспорта к ним питательных веществ, удаления продуктов распада, образования миелина, участия в передаче сигнала и т. д. [1]. К клеткам нейроглии исторически относят и популяцию микроглиальных клеток (микроглии или микроглиоциотов), которые, однако, происхождением отличаются от других глиальных клеток ЦНС [2]. Ведущая функция микроглии состоит в формировании собственной иммунной системы мозга [3]. Клетки микроглии способны к быстрой активации в ответ даже на незначительные патологические изменения в ЦНС, в связи с чем определение функциональной активности микроглии широко используют для оценки защитного ответа нервной системы на инфекцию, травму, ишемическое повреждение мозга или нейродегенерацию [4, 5].

Изначально в качестве иммуногистохимических маркеров микроглии использовали антитела к белкам главного комплекса гистосовместимости II класса. Впоследствии в 1996 г. был выделен белок Iba-1 (от англ. ionized calcium-binding adapter molecule 1) [6], который считают высокоселективным маркером микроглии благодаря тому, что в головном мозге ген iba1 специфично экспрессируется именно в этой популяции клеток. Ряд авторов считает данный белок идентичным белку AIF-1 [7–10]. Белок Iba-1 в настоящее время наиболее широко используют для изучения микроглии. Однако существует проблема адекватной интерпретации результатов иммуногистохимической реакции. Она обусловлена тем, что ген iba1 может подвергаться альтернативному сплайсингу, в результате которого формируется несколько изоформ белка [11]. Поскольку характер распределения этих изоформ не является полностью идентичным [12], результаты иммуногистохимических реакций от исследования к исследованию могут также различаться в зависимости от эпитопов иммуногена, к которому выработаны использованные антитела. Существование альтернативного сплайсинга и различных изоформ белка может быть причиной того, что антитела к Iba-1 иногда выявляют не только микроглию и клетки моноцитарно-макрофагального ряда, но и ряд клеток иного происхождения. Так, положительная реакция на белок Iba-1 была выявлена в гладких миоцитах [13], клетках эпителиальных опухолей молочной железы [14] и печени [15], а также в клетках эпителио-сперматогенного слоя семенников [6, 16]. Эти данные ставят под вопрос утверждение о предполагаемой высокой специфичности конкретных антител к белку Iba-1 как маркеру микроглии.

Одними из наиболее широко используемых антител для маркирования микроглии являются козьи антитела к Iba-1 (Abcam, Великобритания; по каталогу: ab5076), которые упоминаются в 1145 публикациях (по данным сайта производителя). Они выработаны против синтетического пептида, соответствующего C-концевым аминокислотам белка Iba-1. Однако в настоящее время более доступны для исследователей в Российской Федерации антитела к Iba-1 (Huabio, Китай; по каталогу: ET-1705-78). Иммуногеном для этих первичных реагентов выступает пептид с последовательностью, соответствующей N-концевым аминокислотам белка. Данные первичные антитела хорошо зарекомендовали себя в работе с образцами ткани различных лабораторных животных [17–19].

В связи с необходимостью определения более надежных вариантов антител к Iba-1, которые можно использовать для маркирования микроглии, и выяснения возможности их взаимозамены, целью настоящего исследования стала оценка результатов выявления микроглии и макрофагов с использованием антител к различным последовательностям белка Iba-1, выпускаемых разными производителями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала для исследования были использованы образцы тканей головного мозга и семенника половозрелых (3–5 месяцев) крыс-самцов Wistar массой 350–400 г (n = 8). Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область, Россия), содержались в виварии при комнатной температуре в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Перед отбором материала животным проводили эвтаназию путем передозировки парами этилового эфира. Материал фиксировали в цинк-этанол-формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leica RM 2125RT изготавливали срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла с адгезивным покрытием HistoBond®+ (Paul Marienfeld; Германия). Срезы головного мозга изготавливали на уровне –2,12 мм от Брегмы.

После депарафинирования препаратов по стандартной методике проводили ингибирование эндогенной пероксидазы путем инкубации срезов в 3%-м водном растворе перекиси водорода в течение 10 мин. Перед нанесением первичных антител срезы обрабатывали нормальной лошадиной сывороткой (008-000-121; Jackson Immunoresearch, США) или блокировочным раствором (ab64226; Abcam, Великобритания) при комнатной температуре в течение 10 мин. Выявление микроглии и макрофагов проводили с помощью антител к кальций-связывающему белку Iba-1. Использовали козьи поликлональные антитела в разведении 1 : 1000 (ab5076; Abcam, Великобритания) и рекомбинантные кроличьи моноклональные (клон JM36-62) антитела в разведении 1 : 1200 (ET-1705-78; Huabio, Китай). Инкубацию с первичными антителами проводили во влажной камере трое суток при температуре 27 °С.

В качестве вторичных реагентов применяли полимерную систему детекции UltraVision Quanto Detection System HRP (TL-060-QHL; Fisher Scientific, США), которая обладает двойной активностью к мышиным и кроличьим первичным реагентам, и авидин-биотиновый набор VECTASTAIN Universal Quick HRP kit (PK-8800; Vector Laboratories, США), который обладает способностью детектировать первичные реагенты мыши, крысы и козы. Кроме того, использовали вторичные реагенты из наборов Cell & Tissue Staining Kit (CTS005 и CTS008; R&D Systems, США), обладающие монореактивностью по отношению к кроличьим и козьим антителам соответственно. Режимы инкубации вторичных реагентов соответствовали рекомендациям производителя. Для обоих вариантов антител был проведен отрицательный контроль с использованием соответствующих наборов вторичных реагентов и системы проявления HRP. Для постановки негативного контроля вместо раствора первичных антител срезы обрабатывали раствором использованного разбавителя антител. Блокировку неспецифичного связывания антимышиных вторичных антител с близкородственными иммуноглобулинами крысы проводили с помощью нормальной крысиной сыворотки.

Для визуализации продукта реакции использовали хромоген 3'3-диаминобензидин из набора DAB+ (K3468, Agilent, США). После постановки иммуногистохимической реакции часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином либо альциановым синим. После обезвоживания и просветления в орто-ксилоле (Вектон; Россия) препараты заключали в среду Cytoseal 60 (23-244257; Richard-Allan Scientific, США). Полученные препараты анализировали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica; Германия), оснащенного цифровой фотокамерой ICC50 (Leica; Германия). Применяли программу захвата изображений LAS EZ (Leica; Германия).

Проводили цифровую оценку оптической плотности окрашенного продукта иммуногистохимической реакции с применением различных антител к Iba-1. Измерения осуществляли в области стриатума с применением программы для морфометрического анализа Fiji (ImageJ). На изображениях предварительно выделяли области интереса фиксированного размера 10 × 10 мкм с помощью опции «Region of Interest». Измеряли среднюю яркость на единицу площади исследуемых структур (микроглиоцитов, просветов кровеносных сосудов и нейропиля стриатума). Результаты исследования представляли в единицах оптической плотности. Полученные данные обрабатывали в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software; США) и представляли в виде mean ± SD (число значений, использованных для подсчета среднего, было равно 7).

Проверку соответствия аминокислотных последовательностей изоформ Iba-1 (или, по другой номенклатуре, AIF1) проводили с использованием сервиса UniProt [20]. Сравнивали сиквенсы под номерами P55008-1, P55008-2 и P55008-3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Предварительный анализ препаратов показал хорошую сохранность срезов и структуры исследуемых образцов тканей. На препаратах головного мозга и семенника крысы наблюдается высокоинтенсивная иммуногистохимическая реакция на Iba-1 при минимальном уровне фонового окрашивания, которое отсутствовало при использовании кроличьих первичных реагентов, а в случае применения козьих первичных антител было незначительно.

Iba-1-позитивные клетки были обнаружены во всех исследованных препаратах тканей крысы. На препаратах головного мозга они представляли собой типичные микроглиоциты, имеющие большое количество тонких разветвленных отростков (рисунокА–Г). Вблизи кровеносных сосудов серого вещества коры головного мозга встречаются веретеновидные клетки с уплощенными крупными отростками. При использовании моноклональных кроличьих антител отростки Iba-1содержащих клеток демонстрировали многочисленные шипикоподобные выросты. Кроме того, моноклональные антитела были выявлены в оболочках головного мозга безотростчатые клетки овальной формы с интенсивно окрашенной цитоплазмой.

Применение козьих поликлональных антител к Iba-1, несмотря на высокую интенсивность специфической реакции, привело к появлению на препаратах незначительного уровня фона. Он проявлялся в слабом окрашивании нейропиля, а также более явным неспецифическим фоновым окрашиванием сыворотки крупных кровеносных сосудов (рисунокА). Интенсивность окрашивания нейропиля и сыворотки крупных кровеносных сосудов составляла 0,61 ± 0,03 и 0,75 ± 0,03 соответственно. Использование моноклональных кроличьих антител не приводило к развитию заметного фонового окрашивания (значения оптической плотности окрашенного хромогена в нейропиле и просвете кровеносных сосудов были равны 0,57 ± 0,02 и 0,59 ± 0,01 соответственно). При этом среднее значение интенсивности окрашивания микроглиоцитов для обоих вариантов антител оказалось схожим: 0,87 ± 0,09 для поликлональных антител и 0,87 ± 0,08 для антител клона JM36-62.

Использование обоих вариантов первичных антител при работе с образцами ткани семенника крысы позволило выявить два типа иммунопозитивных клеток стромы извитых семенных канальцев (рисунокД–Е). В первом случае это клетки, расположенные в непосредственной близости к сосудам. Они обладают небольшой околоядерной областью округлого профиля и тонкими неветвящимися отростками. Второй тип — это крупные малоотростчатые или безотростчатые клетки овальной формы. Последние могут располагаться как поодиночке, так и формировать небольшие группы по 3–4 клетки.

Третий тип клеток выявлялся только при использовании для иммуногистохимической реакции поликлональных козьих антител к Iba-1. В этом случае скопление продукта иммуногистохимической реакции обнаруживалось в цитоплазме клеток эпителио-сперматогенного слоя извитых семенных канальцев. Морфологически они соответствуют ранним (округлым) и поздним (удлиненным) сперматидам (рисунокД, двойная стрелка). Ни на одном из изученных препаратов, обработанных кроличьими первичными реагентами, Iba-1-иммунопозитивных клеток в составе эпителио-сперматогенного слоя обнаружено не было.

Результаты иммуногистохимической реакции, полученные с помощью моноспецифичных систем детекции Cell & Tissue Staining Kit, основанных на авидинбиотиновой амплификации, соответствовали результатам, полученным при использовании систем VECTASTAIN Universal Quick HRP kit и UltraVision Quanto Detection System HRP.

Сравнение аминокислотных последовательностей трех изоформ Iba-1/AIF1 (а именно сиквенсов P55008-1, P55008-2 и P55008-3 из библиотеки UniProt) показало, что аминокислотные последовательности иммуногенных фрагментов различных антител могут отсутствовать у той или иной изоформы. Так, последовательность N-концевого иммуногенного фрагмента для моноклональных кроличьих антител клона JM36-62 присутствует только у изоформы P55008-1 (с последовательностью в 147 аминокислот), а более короткие изоформы P55008-2 и P55008-3 (с последовательностями в 93 и 132 аминокислоты соответственно) этого фрагмента не содержат. В противоположность этому, участок C-концевого иммуногенного фрагмента для поликлональных козьих антител Abcam присутствует в сиквенсах двух изоформ из трех исследованных: P55008-1 и P55008-2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Оба использованных в настоящей работе первичных антитела показали хорошие результаты иммуногистохимической реакции и высокое соотношение уровня интенсивности иммуноспецифического сигнала к неспецифическому фоновому окрашиванию. Несмотря на это протокол, основанный на использовании козьих первичных реагентов, способствовал проявлению более высокого уровня фонового окрашивания нейропиля головного мозга и паренхимы семенников по сравнению с аналогичным, основанным на применении антител клона JM36-62. На представленных фотографиях (рисунок) соотношение специфического сигнала к фоновому кажется ниже у поликлональных антител. Дополнительное количественное исследование цифровых изображений показало, что интенсивности специфической иммуногистохимической реакции для обоих вариантов антител оказались близки. Однако интенсивность окрашивания нейропиля и сыворотки крупных кровеносных сосудов действительно были выше на препаратах, окрашенных с помощью поликлональных козьих первичных реагентов. Как известно, работа с первичными козьими реагентами накладывает определенные ограничения при проведении иммуногистохимических исследований с использованием непрямого метода Кунса или его модификаций. Во-первых, наиболее распространенные вторичные реагенты являются моно- или бивалентными, т. е. направлены против иммуноглобулинов одного или двух видов животных (чаще всего, кролика и мыши), что значительно усложняет подбор вторичных антител и удорожает проводимое исследование. Вторая проблема состоит в том, что козьи антитела создают больше неспецифического фона при незначительном усилении интенсивности реакции, поскольку реагируют и с иммуноглобулинами быка, которые могут в следовом количестве присутствовать в реагентах, содержащих бычий сывороточный альбумин [6]. Результаты настоящего имуногистохимического исследования это тоже подтверждают.

Белок Iba-1, состоящий из 147 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 17 кДа [21], всегда присутствует как в теле, так и в отростках микроглиальных клеток, благодаря чему его повсеместно используют для проведения исследований, связанных с оценкой морфофункционального статуса микроглии. При взаимодействии с фимбрином Iba-1 участвует в сшивании актиновых филаментов и регуляции конфигурации плазматической мембраны [22], поэтому повышение уровня Iba-1 в клетках отмечается при переходе микроглии из покоящегося состояния в активированное [23]. Однако это свойство Iba-1 подразумевает присутствие данного белка и в других фагоцитирующих клетках организма. Действительно, часто антитела к Iba-1 используют для выявления клеток моноцитарно-макрофагального ряда, что отражено в многочисленных публикациях. Так, иммунопозитивными по Iba-1 оказываются резидентные макрофаги различных органов лабораторных животных и человека: клетки Купфера [18, 24], альвеолярные макрофаги легких и макрофаги селезенки [25, 26], клетки Лангерганса [6, 16]. Поэтому полученные в настоящем исследовании данные, указывающие на присутствие Iba-1 в интерстициальных макрофагах семенника и лептоменингиальных клетках головного мозга, были ожидаемы. Гораздо более интересен результат, продемонстрированный для клеток эпителио-сперматогенного слоя семенных канальцев при постановке иммуногистохимической реакции с использованием различных антител к Iba-1 на препаратах семенника крысы. Использование в работе козьих поликлональных антител приводило к образованию окрашенного продукта иммуногистохимической реакции в клетках, морфологически соответствующих сперматидам. Антитела клона JM36-62 не связывали антигены в эпителио-сперматогенном слое.

Утверждение о присутствии белка Iba-1 в сперматидах семенных канальцев было выдвинуто в ряде публикаций [7, 16, 27–29]. Вопреки этим данным, наши результаты по данной группе клеток отличались при использовании различных первичных антител. Это может быть следствием как свойств первичных антител, выявляющих эпитопы разной специфичности, так и особенностями вторичных реагентов. Поэтому для исключения возможности ложноположительной реакции со стороны сперматид семенника был поставлен дополнительный контроль с использованием идентичных вторичных систем визуализации козьих и кроличьих антител, основанных на авидин-биотиновой технологии, а также дополнительной блокировке эндогенного биотина — Cell & Tissue Staining Kit. Результаты иммуногистохимической реакции в этом случае соответствовали результатам, полученным при использовании полимерной системы детекции UltraVision Quanto Detection System HRP для выявления кроличьих, и набора VECTASTAIN Universal Quick HRP kit для выявления козьих антител. Это дополнительно подчеркивает, что реакция со стороны сперматид не является следствием неспецифичного связывания вторичных реагентов (а именно стрептавидина).

Такой результат иммуногистохимической реакции может быть обусловлен различиями антигенных детерминант: присутствующие в сперматидах эпитопы Iba-1 могли более точно соответствовать паротопам поликлональных, но не моноклональных антител. Так, в соответствии с информацией, предоставленной на сайте производителя, для поликлональных козьих антител в качестве антигена был использован синтетический пептид последовательностью TGPPAKKAISELP, локализованной на С-конце белка Iba-1. На сайте производителя также отмечено, что антитела ab5076 способны выявлять как минимум две изоформы Iba-1/AIF1. В противоположность этому, имуногенный пептид для моноклональных кроличьих антител имел последовательность SQTRDLQGGKAFGL и соответствует N-концу белка. Сравнение сиквенсов разных изоформ человеческого Iba-1/AIF1 показало, что последовательность иммуногена для кроличьих антител соответствует изоформе белка с последовательностью в 147 аминокислот, которая принята в качестве канонической [6]. При этом козьи поликлональные антитела, согласно сопоставлению аминокислотной последовательности фрагментов белка, соответствующих иммуногенному пептиду, должны выявлять как каноническую изоформу, так и более короткие формы белка. Таким образом, наши данные косвенно свидетельствуют о том, что альтернативный сплайсинг матричных РНК iba1 может исключать из конечного транскрипта N-концевой фрагмент, выявляемый моноклональными антителами клона JM36-62, но оставлять C-концевой фрагмент, присутствующий у изоформ, выявляемых поликлональными антителами производства Abcam. Обращение к изначальным публикациям, в которых была представлена характеристика белка Iba-1, показало, что авторы исследовали экспрессию гена в различных органах [13–16]. Это позволило им продемонстрировать высокую экспрессию iba1 в семенниках и селезенке, а также слабую — в легких, почках и головном мозге (благодаря специфической экспрессии гена исключительно в макрофагах и/или микроглии). Большое количество других работ, посвященных экспрессии iba1 в различных тканях [16–18, 24, 25], также дают основания предполагать, что она не ограничена микроглией, моноцитами и макрофагами. Поэтому нельзя исключать, что козьи поликлональные антитела действительно выявляют белок Iba-1, причем и ту его изоформу, которая не содержится в клетках моноцитарно-макрофагального ряда.

ВЫВОДЫ

Моноклональные антитела клона JM36-62 позволяют добиться более высокой селективности выявления антигена при лучшем соотношении сигнал/фон и пригодны для замены более часто используемого реагента. Более высокая селективность антител клона JM36-62, повидимому, обусловлена более правильным выбором иммуногена производителем антител. Выявление сперматид при использовании поликлональных антител Abcam может быть обусловлено присутствием в этих клетках изоформы Iba-1, лишенной эпитопа, соответствующего последовательности N-концевого фрагмента нативного белка. Для оценки функционального значения различных изоформ Iba-1 требуются дальнейшие исследования.