Белки Mx, индуцируемые интерферонами типов I и III, являются важными медиаторами врожденного иммунитета и участвуют в защите от различных РНК- и ДНК-содержащих вирусов [1]. Эти белки принадлежат к обширному семейству ферментов гидролаз (ГТФаз) и гомологичны для позвоночных [2, 3].

У человека в 21-й хромосоме кодируются две различные Mx-ГТФазы, называемые MxA и MxB. Оба белка локализованы в цитоплазме и при иммунофлуоресцентной детекции имеют характерное зернистое окрашивание [3]. Человеческий MxA представляет собой цитоплазматический белок массой 78 кДа, тесно связанный с гладким эндоплазматическим ретикулумом [1]. MxA обладает сравнительно широким противовирусным спектром действия против различных типов вирусов, независимо от места их внутриклеточной репликации. К MxA-чувствительным вирусам относятся представители буньявирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов, тогавирусов, пикорнавирусов и вируса гепатита В — ДНК-вируса с промежуточной геномной РНК [2, 4, 5]. Интересно, что некоторые вирусы ингибируются специфичным для каждого типа клеток образом. Это позволяет предположить, что неизвестные клеточные факторы могут влиять на противовирусную специфичность [6].

В дополнение к противовирусной активности, в недавно проведенных исследованиях выявлена роль MxA при различных типах рака, в частности, при раке молочной железы и карциноме предстательной железы [1]. Так, описано, что высокий уровень MxA и обилие опухольинфильтрирующих лимфоцитов являются независимыми прогностическими факторами безрецидивной выживаемости у пациентов с трижды негативным раком молочной железы [7]. Описано также, что экспрессия MxA опухолевыми клетками чаще приводит к выживаемости без метастазов после адъювантной химиотерапии [8]. В этой связи ожидается, что искусственное повышение уровня MxA в опухолях может приводить к благоприятному исходу у онкобольных и сделать проведение химиотерапии более эффективной. Все это позволяет предположить, что MxA является крайне перспективным терапевтическим агентом.

Поскольку MxA — внутриклеточный белок, а доставка белков такого размера в клетки все еще представляет существенную проблему, для исследования биологических свойств MxA мы предложили сравнительно новый подход использования экзогенной мРНК, кодирующей человеческий белок MxA. Эта концепция активно развивалась в последнее десятилетие и достаточно успешно реализовала себя в 2020 г. при создании нового поколения мРНК-вакцин против COVID-19 производства Pfizer/BioNTech и Moderna. Значительные успехи были достигнуты в области регенеративной медицины, где мРНК используют для перепрограммирования соматических клеток, а также в заместительной белковой терапии при лечении генетических заболеваний.

Цель исследования — сконструировать и получить методом IVT экзогенную мРНК, кодирующую функциональный цитоплазматический белок MxA человека; изучить ее трансляционные свойства; оценить и выявить закономерности в экспрессии некоторых генов системы интерферонов (ИФН-стимулируемых генов) в ответ на введение экзогенной мРНК в клетки. В дальнейшем мы предполагаем оценить терапевтический потенциал разработанных конструкций мРНК в отношении вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса и коронавируса SARS-CoV-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструирование плазмидных векторов

Нуклеотидные вставки, кодирующие человеческий белок MxA, были получены из препаратов тотальной РНК, выделенных из клеток A549, методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров (GAGAGCGGCCGCGCCACCATGGTTGTTT/ ATCTTCTAGATTAACCGGGGAACTGGGCAAGC), содержащих сайты рестрикции для эндонуклеаз Not I и Xba I. Фрагменты требуемой длины (2017 п.н.) были вставлены в векторную систему pJET1.2, содержащую T7-промоторную область, методом рестрикции по сайтам Not I/Xba I с последующим лигированием по липким концам. Для получения конструкции с кэп-независимой трансляцией аналогичным образом был амплифицирован IRES-фрагмент размером 605 п.н. с использованием плазмидного вектора pIRESneo3 в качестве матрицы; последовательности поли(А), 5′- и 3′-UTR длинами 114, 57 и 110 п.н. соответственно, были синтезированы компанией «Евроген» (Россия). Все нетранслируемые компоненты кассеты были лигированы в вектор pJET1.2 согласно предложенному дизайну (см. «Результаты исследования»).

Полученные в результате клонирования колонии скринировали методом ОТ-ПЦР. Плазмидные конструкции, содержащие вставки ожидаемой длины, были накоплены и очищены с использованием набора Plasmid Miniprep 2.0 («Евроген»; Россия). Последовательности разработанных плазмидных конструкций были подтверждены методом секвенирования по Сэнгеру компанией «Евроген» (Россия).

In vitro транскрипция

Препараты экзогенных мРНК (мРНК-MxA-CDS, мРНК-MxA-IRES, мРНК-MxA-UTR и мРНК-GFP-CDS) были получены путем IVT с использованием набора HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (#RNT-102; Jena Bioscience, Германия). В качестве матрицы для синтеза РНК использовали 1 мкг линеаризованной по сайту Xba I плазмиды. В качестве кэпа использовали синтетический аналог ARCA, AntiReverse Cap Analog, добавляемый в реакционную смесь в соотношении ARCA/GTP как 4 : 1. В реакции использовали модифицированные азотистые основания 5-метилцитидин (#NU-1138, 5-Methyl-CTP, m5C; Jena Bioscience, Германия) и псевдоуридин (#NU-1139, Pseudo-UTP, Ψ; Jena Bioscience, Германия). Реакцию проводили согласно протоколу производителя.

После синтеза РНК матрицу ДНК удаляли путем последующего расщепления ДНКазой Turbo (#AM1345, Thermo Fisher Scientific; США). Для нематричного полиаденилирования 3′-концов транскрибируемых мРНК использовали набор Poly(A) Tailing Enzyme Testkit (#RNT004, Jena Bioscience; Германия). Полученные транскрипты очищали на колонках RNA Clean & Concentrator kit (#R1017, Zymo Research; США). Концентрацию полученных мРНК измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop-1000 и флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США).

Электрофорез в агарозном геле

Препараты плазмидной ДНК анализировали в 0,8%-м агарозном геле, приготовленном на 1× TAE-буфере с содержанием бромистого этидия до 0,5 мкг/мл, с использованием 6× буфера для нанесения ДНК.

Образцы мРНК анализировали в денатурирующих условиях в 1%-м агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. 500 нг образца мРНК смешивали с равным объемом Gel Loading Buffer II (#AM1344, Invitrogen; США), прогревали в течение 5 мин при 80 °C и наносили на гель.

Результаты электрофоретического разделения визуализировали с использованием Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad; США).

Ведение клеточных культур и их трансфекция экзогенными мРНК

В работе для различных экспериментов были использованы: перевиваемая культура клеток A549 (#CCL-185, карцинома легкого человека), полученная из коллекции ATCC (США), и культура клеток MDCK (#FR-58, клетки почки собаки), полученная из коллекции IRR (США).

Клетки A549 культивировали на питательной среде F12K (Gibco; США) в присутствии 10% сыворотки КРС (Gibco; США); MDCK — на среде альфа-МЕМ («Биолот»; Россия) с добавлением сыворотки КРС до 5%. Ведение культур и все эксперименты проводили без добавления антибиотиков.

Для трансфекции экзогенными мРНК использовали суточный 90–100% монослой клеток, ростовую среду непосредственно перед внесением мРНК заменяли на бессывороточную. Трансфекцию клеток проводили с использованием коммерческого трансфекционного реагента Lipofectamine MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific; США) согласно инструкции производителя. В лунки 96-луночного планшета мРНК-комплексы вносили в объеме 10 мкл, в лунки 12-луночного планшета — в объеме 50 мкл. На 1 лунку 96-луночного планшета приходилось 100 нг мРНК и 0,3 мкл реагента Lipofectamine MessengerMAX, 12-луночного планшета — 450 нг РНК и 1 мкл реагента Lipofectamine MessengerMAX. В зависимости от задач эксперимента инкубацию клеток с комплексами РНК/липофектамин проводили в течение 4–24 ч при 37 °C и 5% СО₂.

Конфокальная микроскопия

Конфокальную визуализацию фиксированных клеток проводили через 24 ч после их трансфекции экзогенными мРНК. Для этого монослой клеток, выращенных на стеклянных предметных стеклах, промывали DPBS, фиксировали 4%-м раствором параформальдегида в течение 10 мин и пермеабилизовали 0,1%-м раствором Triton X-100. Блокирование осуществляли раствором 1%-го БСА на DPBS. Окраску ядер проводили DAPI (AppliChem; США), актинового цитоскелета — фаллоидином, ковалентно связанным с родамином (Thermo Fisher Scientific; США). Для визуализации белка MxA человека использовали первичные антитела MxA/Mx1 Antibody, меченые биотином (Novus Biologicals; Германия) с последующей проявкой с использованием Streptavidin DyLight 633 (Thermo Fisher Scientific; США). Микроскопию клеток проводили с помощью инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SP8 (Leica; Германия).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Измерение уровня белка MxA проводили с использованием набора Human MxA Protein ELISA (BioVendor; Чехия) в соответствии с инструкцией производителя. Регистрацию результатов проводили в двухволновом режиме (при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 655 нм) с использованием микропланшетного ридера

CLARIOstar (BMG Labtech; Германия)

Оценка уровня экспрессии

Оценку уровня экспрессии ИФН-стимулируемых генов проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, разработанных ранее [9]. Препараты тотальной РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Thermo Fisher Scientific; США), далее проводили обработку ДНКазой («Биолабмикс»; Россия). Реакцию ОТ проводили с использованием набора RNAscribe RT («Биолабмикс»; Россия) с использованием олиго(dT)₁₆-праймеров и 2 мкг РНК, свободной от примесей геномной ДНК. ПЦР проводили с использованием готового набора БиоМастер HS-qPCR (2×) («Биолабмикс»; Россия), куда вносили 1–2 мкл кДНК.

Относительную экспрессию генов рассчитывали по методу дельта-дельта Ct (ΔΔCt), используя GAPDH и ACTB в качестве нормировочных генов. Относительный уровень экспрессии генов определяли по индуктивной формуле R = 2^–[ΔΔCt]. Вычисления осуществляли с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003/2007 (США).

Статистическая обработка результатов

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы GraphPad Prism 6 (GraphPad Software; США) с использованием теста непараметрического критерия Краскела–Уоллиса (для оценки значимости различий в трех и более независимых группах) и теста Даннета (для множественного группового сравнения). Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение функциональных мРНК

Согласно базе данных NCBI [10] у человека выявлено четыре транскрипционных варианта мРНК, кодирующих белок MxA. Несмотря на разницу в длинах и вариации в 5′-UTR, транскрипционные варианты 1, 2 и 3 кодируют одинаковую изоформу белка MxA, называемую изоформой a. Транскрипционный вариант 4 имеет альтернативный 5′-UTR, а также не содержит трех экзонов в 3′-кодирующей области, что приводит к сдвигу рамки считывания, вследствие чего эта мРНК кодирует более короткую изоформу белка MxA — b, также известную как varMxA [11]. При дизайне конструкций, кодирующих мРНК гена MxA человека, были подобраны праймеры для специфического клонирования канонической формы белка MxA a.

С использованием подобранных праймеров методом ОТ-ПЦР (Pfu ДНК-полимераза) из препаратов тотальной РНК (после обработки ДНКазой) была получена последовательность, кодирующая человеческий белок MxA. Согласно результатам секвенирования (рис. 1А) последовательность была полностью идентична ожидаемой канонической изоформе белка MxA a, однако имела одну описанную аминокислотную вариацию V379I, не влияющую на физико-химические свойства белка MxA [12].

Для получения мРНК методом IVT были предложены три плазмидных конструкции (рис. 1Б), содержащие в качестве обязательного элемента кассеты промоторную область, специфичную для РНК-полимеразы фага T7. Одна из конструкций содержала исключительно белок-кодирующую последовательность MxA (мРНКMxA-CDS), а в две другие были дополнительно введены нетранслируемые области, потенциально усиливающие эффективность трансляции белка, кодируемого этими мРНК. Для реализации кэп-независимой трансляции была сконструирована вторая мРНК-MxA-IRES, дополненная на 5′-конце укороченным IRES-элементом II типа из вируса энцефаломиокардита EMCV, содержащим бифуркационную последовательность A7 [13, 14]. Третья мРНК-MxA-UTR содержала дополнительные нетранслируемые области на 5′- и 3′-концах, а также участок, обеспечивающий матричную достройку поли(А)хвоста в процессе IVT.

Все три предложенные плазмидные конструкции были успешно получены, накоплены, а секвенирование экспрессионных кассет показало их полное соответствие ожидаемым последовательностям. Далее плазмиды были линеаризованы (результаты электрофоретического разделения представлены на рис. 1В) и использованы в качестве матрицы ДНК для проведения IVT.

Полученные нами мРНК (рис. 2А) содержали синтетический аналог кэпа — ARCA, модифицированные основания псевдоуридин (Ψ) и 5-метилцитидин (m5C), что, согласно современным литературным данным, снижает иммуногенность экзогенных транскриптов [15, 16], а также поли(А)-хвост на 3′-конце. Последний был добавлен матрично (в случае использования кассеты для мРНК-MxA-UTR) или с проведением отдельной реакции полиаденилирования (для мРНК-CDS и мРНК-IRES).

Дополнительно нами также была получена экзогенная мРНК, кодирующая флуоресцентный зеленый белок (GFP), — мРНК-GFP-CDS, не содержащая никаких нетранслируемых областей, строение которой было эквивалентно мРНК-MxA-CDS. Количества полученных мРНК, кодирующих белок MxA, достигали 200 мкг, концентрации — до 350 нг/мкл.

Оценка трансляции белкового продукта, кодируемого экзогенными мРНК

Трансляционная активность полученных экзогенных мРНК была оценена трансфекцией клеток MDCK. Методом ИФА, согласно полученным в серии экспериментов результатам, было показано, что мРНК-МхА-IRES не была способна к трансляции в исследуемой клеточной линии: выявить белок MxA при использовании этой мРНК не удалось на протяжении 36 ч после ее введения в клетки. Однако уже через 4 ч после трансфекции клеток MDCK двумя другими мРНК в клеточных лизатах на диагностически значимом уровне выявлялся белок MxA человека (результаты не представлены).

Через 20 ч после трансфекции концентрации человеческого белка MxA как в случае мРНК-MxA-CDS, так и мРНК-MxA-UTR, были сопоставимы и достигали 20 нг/мл (рис. 2Б).

Интернализация и внутриклеточная локализация человеческого белка MxA, кодируемого экзогенными мРНК, была изучена методом конфокальной микроскопии. Как показано на рис. 3, белок MxA эффективно транслировался клетками MDCK через 24 ч после введения мРНК. Как следует из результатов иммунофлуоресцентного анализа, MxA, кодируемый обеими экзогенными мРНК, присутствовал исключительно в цитоплазме клеток, располагаясь диффузно в виде характерных гранул.

Изучение экспрессии ИФН-стимулируемых генов в ответ на введение экзогенной мРНК-MxA-UTR

Известно, что введение синтетических экзогенных мРНК может приводить к активации цитозольных РНК-сенсоров и активировать иммунный ответ. Белок MxA, как один из важнейших эффекторных метаболитов врожденной иммунной системы, также может модулировать продукцию ИФН-стимулируемых генов. Мы оценили специфичность этого ответа через 4 и 24 ч после трансфекции клеток A549 мРНК-MxA-UTR, используя мРНК-GFP-CDS в качестве контроля неспецифической стимуляции (рис. 4). Так, через 4 и 24 ч после трансфекции клеток мРНКMxA-UTR детектируемый относительный уровень мРНК MxA примерно в 6500 раз превышал его уровень в контрольных клетках (принятый за единицу) (рис. 4А). Было также показано, что введение экзогенной мРНК в клетки приводит к неспецифическому (не зависящему от вида экзогенной мРНК) увеличению экспрессии гена OAS1, а также генов цитозольных сенсоров MDA5 и RIG-I, что указывает на активацию врожденного иммунного ответа. Любопытно, что трансфекция клеток мРНК-MxA-UTR приводила почти к 1000-кратному снижению уровня PKR по сравнению с интактными клетками, тогда как в случае мРНК-GFP-CDS, напротив, наблюдалась тенденция к четырехкратной активации этого гена.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Белок-кодирующие экзогенные мРНК представляют собой многообещающий инструмент, позволяющий как проводить фундаментальные исследования, выявляющие закономерности функционирования, сигналинга и метаболизма белков в клетках, так и имеющий огромный терапевтический потенциал. Сконструированные и синтезированные нами препараты экзогенных мРНК, кодирующие белок MxA человека, в дальнейшем будут использованы для оценки их противовирусного действия в отношении респираторных вирусов.

Синтетические мРНК обладают той же структурой, что и природные молекулы мРНК: имеют кэп на 5′-конце (чаще его структурный аналог), 5′- и 3′-UTR, фланкирующие белок-кодирующую область, и поли(А)-хвост [17, 18].

Из трех предложенных мРНК нам удалось достоверно показать стабильную трансляцию двух конструкций, одна из которых содержала участки 5′- и 3′-UTR, другая кроме белок-кодирующей части не содержала никаких служебных областей (за исключением аналога кэпа и поли(А)-хвоста). Удивительно, но несмотря на показанную в литературе повышенную эффективность трансляции IRES-содержащих мРНК [19], синтез белка c предложенной нами мРНК-MxA-IRES не происходил. В нашей работе мы использовали IRES-элемент EMCV семейства пикорнавирусов, не задействующих кэп в процессе репликации. Полученная конструкция мРНК содержала одновременно и кэп-аналог, и IRES-элемент. Предположительно, одновременное наличие в непосредственной близости этих двух рибосомузнаваемых участков приводит к блокированию кэпзависимой трансляции с этого транскрипта.

Тем не менее в дальнейшем мы планируем оценить трансляцию синтетической мРНК-MxA-IRES, не содержащей кэп-аналога. По литературным данным, несмотря на то что в нормальных условиях IRES-зависимая трансляция имеет более низкую эффективность по сравнению с кэп-зависимой, в условиях клеточного стресса (в том числе теплового шока, вирусного инфицирования и т. д.) IRES-опосредованная трансляция может сохраняться и превосходить трансляцию с использованием кэпа [20].

Известно, что одними из ключевых регуляторов внутриклеточной кинетики молекулы мРНК являются 5′- и 3′-UTR. В частности, мРНК с длинными 3′-UTR имеют более короткий период полураспада, в то время как мРНК с короткими 3′-UTR транслируются менее эффективно [18]. Сопоставление уровней белка MxA в клетках MDCK через 24 ч после трансфекции их экзогенными мРНК не позволило выявить какие-либо преимущества в трансляционной активности, обусловленные наличием или отсутствием в них участков UTR. Обе мРНК, способные к трансляции, приводили к продукции белка на уровне 20 нг/мл через сутки после трансфекции. Иммунофлуоресцентный анализ клеток MDCK, трансфецированных экзогенными мРНК, показал наличие в них гранул предположительно кольцевой конфигурации (выявляется при максимальном увеличении), диффузно распределенных в цитозоле. Этот результат полностью согласуется с опубликованными данными о том, что in vivo при физиологических концентрациях солей в клетке происходит гомоолигомеризация MxA; такая агрегация предотвращает деградацию и обеспечивает стабильность белка с периодом полураспада более 24 ч [21]. Наши результаты позволяют предположить, что продуцируемый белок MxA будет функционировать в клетках подобно нативному.

При оценке противовирусного потенциала белка MxA, транслируемого с экзогенной мРНК, особое внимание следует уделить неспецифической активации врожденного иммунного ответа, обусловленной повышенной иммуногенностью молекулы мРНК. Известно, что паттернраспознающие рецепторы, такие как трансмембранные TLR3, 7, 8, 9, а также цитозольные сенсоры RIG-I и MDA5, способны узнавать чужеродные нуклеиновые кислоты и приводить к ответной экспрессии провоспалительных цитокинов или активации воспаления [22]. Нами было показано повышение экспрессии цитозольных сенсоров RIG-I и MDA5, а также ИФН-стимулируемого гена OAS1, через 24 ч после трансфекции клеток экзогенными мРНК. Паттерны экспрессии этих генов отличались по силе и коррелировали друг с другом для разных экзогенных мРНК. Мы предполагаем, что эти изменения обусловлены неспецифической иммуногенностью экзогенных мРНК. Наибольшее воздействие на экспрессию исследованных генов оказала мРНК, кодирующая GFP, что может быть связано как с ее структурой, так и с тем, что в случае мРНК-MxA возможна негативная регуляция экспрессии этих генов, обусловленная петлей отрицательной обратной связи.

Любопытно, что трансфекция клеток A549 мРНК-MxA-UTR уже через 4 ч приводила к продолжительной (как минимум до 24 ч) мощной специфической супрессии PKR на уровне транскрипции.

ВЫВОДЫ

В представленной работе: 1) с использованием разработанных нами плазмидных конструкций в качестве матрицы в реакциях IVT были получены мРНК, кодирующие белок MxA, способные к эффективной трансляции в эукариотических системах; 2) уровни накопления белкового продукта MxA после трансфекции клеток экзогенными мРНК достигали 20 нг/мл в течение суток; 3) подтверждено диффузное внутриклеточное распределение белка MxA в клетках; 4) исследована экспрессия цитозольных сенсоров и некоторых ИФН-стимулируемых генов в ответ на введение в клетки экзогенной мРНК, кодирующей белок MxA человека. Дальнейшие исследования авторов будут посвящены оценке терапевтического потенциала разработанных конструкций мРНК в отношении вирусов гриппа подтипов А и В, респираторно-синцитиального вируса и коронавируса SARS-CoV-2. Первоначально изучение будет проведено на клеточных моделях инфекций, вызываемых перечисленными патогенами, а при высоком терапевтическом потенциале планируется оценить противовирусное действие экзогенных мРНК, кодирующих белок MxA, на мышиной модели гриппозной пневмонии.