Рис. 1. Структура конструкций на основе плазмид, кодирующих экзогенную мРНК MxA человека. A. Аминокислотная последовательность кодируемого белка MxA (получена в результате секвенирования разработанных конструкций), красным цветом показаны G1–G5 мотивы (по порядку встречаемости), синим — С-концевой эффекторный домен ГТФазы, желтым — вариация V379I. Б. Схема линеаризованных плазмид, разработанных для получения мРНК методом IVT. На схемах кирпичным цветом показана T7-промоторная область для T7-полимеразы (и T7-терминаторная область в случае конструкции № 2), желтым — вспомогательные регуляторные некодирующие элементы, оранжевым (в случае № 2) — участок, обеспечивающий матричное присоединение поли(А)хвоста (114 н.), синим — последовательность, кодирующая MxA, зеленым — сайт рестрикции, используемый для линеаризации. В. Электрофоретическое разделение линеаризованных плазмид, красным показаны ожидаемые длины продуктов (п.н.)

Рис. 2. Экзогенные мРНК, кодирующие белок MxA человека, и их трансляция в клетках MDCK. А. Электрофоретическое разделение полученных экзогенных продуктов мРНК до и после полиаденилирования, М — маркер молекулярного веса РНК (#AM1750, Thermo Fisher Scientific; США), UTR — мРНК-MxA-UTR (сразу с поли(А)-хвостом), CDS и CDS-полиА — мРНК-MxA-CDS до и после полиаденилирования, IRES и IRES-полиА — мРНК-MxA-IRES до и после полиаденилирования. Б. Результаты ИФА в клетках MDCK через 24 ч после трансфекции их экзогенными мРНК

Рис. 3. Подтверждение продукции MxA в клетках MDCK методом конфокальной микроскопии. Репрезентативные фотографии клеток MDCK (фиксированные препараты) получены через 24 ч после трансфекции их экзогенными мРНК, кодирующими зеленый флуоресцентный белок (мРНК-GFP-CDS) и белок MxA человека (мРНК-MxA-CDS и мРНК-MxA-UTR), которые представлены слева направо. Синим показаны ядра клеток (DAPI, экстинкция/эмиссия: 358 (УФ)/461 нм), красным — актиновый цитоскелет (фаллоидин: 540/605 нм). MxA показан цветом маджента (620/655 нм); GFP (контрольные клетки, не трансфецированные мРНК, кодирующей MxA) показан зеленым цветом (488/509 нм). Белые стрелки направлены на характерные структуры, определяемые как белок MxA

Рис. 4. Экспрессия генов MxA, PKR, OAS1, а также MDA5 и RIG-I в клетках A549 через 4 и 24 ч после трансфекции их мРНК в сравнении с интактными клетками (КK). В виде столбцов представлены средние значения (подписаны сверху) экспрессии четырех биологических повторов и стандартная ошибка среднего в качестве погрешности. Для расчета статистической достоверности выявленных различий использовали одношаговый анализ ANOVA с тестом Холма–Шидака для попарного сравнения образцов. Звездочками отмечены достоверные различия, выявленные при сравнении соответствующей группы с КК в этой же временной точке: ns — P_value < 0,1234; * * — P_value < 0,0021; * * * * — P_value < 0,0001