Микобактерии туберкулезного комплекса — генетически гомогенная группа бактерий с низкой, по сравнению с другими бактериями, частотой мутагенеза [1]. Несмотря на то что частота возникновения мутаций у Mycobacterium tuberculosis (МБТ) низкая, необходимо учитывать, что заболевание туберкулезом длится от нескольких месяцев до нескольких лет и размер бактериальной популяции в организме хозяина в это время может достигать более 1 млрд КОЕ, повышается вероятность возникновения спонтанных мутаций, в том числе в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, вследствие чего могут появляться клоны с новыми генотипами [2, 3].

Сосуществование лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых пулов МБТ в одном организме называют бактериальной гетерорезистентностью [4, 5]. Состояние гетерорезистентности может возникать не только в случае микроэволюции одного клона, как описано выше (моноклональная гетерорезистентность), но и в результате смешанной инфекции, когда человек инфицирован несколькими штаммами МБТ с разной лекарственной устойчивостью (поликлональная гетерорезистентность) [6–8]. Моноклональная гетерорезистентность считается одним из основных этапов развития лекарственной устойчивости у бактериальных изолятов [5, 9]. В ряде исследований была установлена связь между наличием гетерорезистентности и неудачей лечения туберкулеза [10, 11].

В настоящее время во всем мире отмечается рост туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ ТБ), когда возбудитель устойчив одновременно к двум основным препаратам первого ряда — рифампицину и изониазиду [12]. Наиболее эффективны для терапии МЛУ ТБ препараты группы фторхинолонов [13–15]. По данным разных авторов, частота гетерорезистентности МБТ к фторхинолонам колеблется в зависимости от изучаемого региона от 1 до 35% [16–20].

Описанные выше предпосылки: формирование лекарственной устойчивости через этап гетерорезистентности, неудачи терапии туберкулеза при наличии гетерорезистентности возбудителя, важность фторхинолонов как наиболее эффективных препаратов при МЛУ ТБ, делают актуальными исследования, направленные на понимание механизмов гетерорезистентности МБТ к фторхинолонам, а также эволюционных перспектив МБТ с различными генетическими детерминантами устойчивости к препаратам этой группы.

Цель исследования — изучить особенности роста in vitro штаммов МБТ, различающихся генетическими детерминантами устойчивости к фторхинолонам, в условиях конкуренции за питательные вещества.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Исследование проводили на пяти клинических штаммах МБТ, максимально сходных по фенотипической устойчивости, имеющих идентичный МЛУ-генотип (rpoB_S531L + katG_S315T) и относящихся к сполиговарианту SIT1 Пекинской сублинии, но различающихся генетическими детерминантами устойчивости к фторхинолонам (четыре штамма с различными мутациями в гене gyrA и один штамм с gyrA дикого типа; табл. 1).

Культивирование штаммов МБТ

Штаммы МБТ культивировали попарно и индивидуально на жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 и в условиях мультистресса (50% среда Middlebrook 7H9, 2мМ KNO₂, 0,02% H₂O₂). Время эксперимента составило 21 сутки.

Определение числа клеток МБТ в образце

Для определения числа клеток каждого штамма в образце применяли подход, использующий результаты мультиплексной ПЦР с использованием набора «Амплитуб-FQ-РВ» («Синтол», Россия), который выявляет основные мутации, ассоциированные с устойчивостью к фторхинолонам. Для этого были приготовлены серийные разведения каждого из штаммов МБТ от 10² до 10⁸ КОЕ/мл и построены калибровочные кривые зависимости порогового цикла амплификации по целевому для мутации каналу от концентрации клеток МБТ в образце. Согласно калибровочным кривым, по значению порогового цикла определяли концентрацию каждого из совместно культивируемых мутантов. Все исследования выполняли в трипликате.

Конкурентный фитнес

Конкурентный фитнес (W) штаммов МБТ, отражающий общий прирост культуры каждого штамма за время эксперимента при парном культивировании, определяли по формуле [21]:

форм. 1

где W — уровень конкурентного фитнеса;
S1(i) — начальная концентрация штамма 1;
S1(f) — финальная концентрация штамма 1;
S2(i) — начальная концентрация штамма 2;
S2(f) — начальная концентрация штамма 2.

При W > 1 конкурентный фитнес штамма 1 больше, чем штамма 2;

W < 1 конкурентный фитнес штамма 1 меньше, чем штамма 2;

W = 1 штаммы 1 и 2 имеют сходный конкурентный фитнес.

Для сравнения роста культуры штаммов МБТ, культивируемых парно, с индивидуальным ростом на среде, определяли удельную скорость роста культуры (µ) — накопление бактериальной массы в единицу времени во время экспоненциальной фазы роста, по формуле [22]:

форм. 2

где g — время генерации, определяемое как:

форм. 3

где t₁ и t₂ — время оценки параметра в процессе экспоненциальной фазы роста; n — число генераций, определяемое как:

форм. 4

где N₁ и N₂ — число КОЕ в моменты времени t₁ и t₂ соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Уровень конкурентного фитнеса был определен для 10 пар штаммов МБТ с разными детерминантами устойчивости к фторхинолонам (табл. 2). Было показано, что в условиях конкуренции за питательные вещества при росте в оптимальных условиях штаммы МБТ с gyrA дикого типа более интенсивно накапливали биомассу по сравнению со штаммами 90V, 94A и 94G. Штамм 94Y при культивировании в оптимальных условиях обладал наибольшим конкурентным фитнесом из всех исследованных штаммов, включая штамм WT. Наименьший конкурентный фитнес в оптимальных условиях культивирования был у штаммов МБТ 94A и 94G.

В условиях мультистресса на обедненной питательной среде Middlebrook 7H9 в присутствии активных форм кислорода и азота способность исследованных штаммов МБТ конкурировать за питательные вещества отличалась от оптимальных условий культивирования. При мультистрессе штамм с диким типом gyrA был более конкурентоспособен по сравнению со штаммами МБТ с мутациями в gyrA. Конкурентный фитнес штамма 94Y в условиях мультистресса резко снизился, а штамма 94A, напротив, улучшился по сравнению с оптимальными условиями культивирования. Конкурентный фитнес штамма 94G в условиях мультистресса, так же как и в оптимальных условиях, был наименьшим среди всех исследованных штаммов.

Удельная скорость роста культуры МБТ с различными генетическими детерминантами устойчивости к фторхинолонам тоже зависела от условий культивирования (табл. 3). При индивидуальном культивировании в оптимальных условиях штаммы gyrA дикого типа и мутанты 94Y и 90V имели сходную удельную скорость роста. Удельная скорость роста мутантов 94G и 94A была более низкой.

При парном культивировании в оптимальных условиях удельная скорость роста штаммов МБТ, как правило, была такой же, как и при индивидуальном культивировании. Более низкое значение удельной скорости роста при парном культивировании, по сравнению с индивидуальным, было отмечено только для штамма WT при совместном культивировании со штаммом 94A и для 94G при культивировании со штаммом WT и со штаммом 94A.

В условиях мультистресса при индивидуальном культивировании удельная скорость роста штаммов МБТ WT и 90V была на том же уровне, что и в оптимальных условиях, а у штамма 94A повышалась. Удельная скорость роста штаммов 94G и 94Y в условиях мультистресса при индивидуальном культивировании была ниже, чем в оптимальных условиях.

При совместном культивировании штаммов в условиях мультистресса удельная скорость роста штаммов WT, 90V, 94A и 94Y практически не отличалась от удельной скорости культивирования в оптимальных условиях, или, в некоторых сочетаниях, была выше. Удельная скорость роста штамма 94G при культивировании с другими штаммами или не менялась, по сравнению с оптимальными условиями, оставаясь на таком же низком уровне, или еще сильнее снижалась по сравнению с оптимальными условиями.

Величины удельной скорости роста штаммов при индивидуальном культивировании и при культивировании в условиях мультистресса, как правило, различались. У штамма 94G при совместном культивировании со штаммами WT и 94A и у штамма 94A при совместном культивировании со штаммом WT удельная скорость была более чем на 10% ниже, чем при индивидуальном культивировании. Но чаще при совместном культивировании штаммов в условиях мультистресса удельная скорость была выше, чем при индивидуальном культивировании (штамм WT при совместном культивировании с 94A; штамм 90V — с WT, 94G и 94A, штамм 94A — с 94Y и 90V; штамм 94G — с 90V и 94Y и штамм 94Y — с 90V и WT).

Было также установлено, что штаммы МБТ с мутациями в gyrA различались по способности реплицироваться при совместном культивировании, и этот параметр для большинства штаммов менялся в зависимости от условий культивирования.

Так, в оптимальных условиях штамм МБТ 94Y размножался более интенсивно, чем штаммы 94A и 94G, в то время как в условиях мультистресса лучшие показатели роста в паре продемонстрировал штамм 94A, а интенсивность деления штаммов 94Y и 94G при парном культивировании была идентичной. Аналогичным образом условия культивирования повлияли на уровень конкурентного фитнеса в парах 94G + 90V, 94G + 94A и 94A + 90V. Исключение составила только пара штаммов 94Y + 90V, в которой и в оптимальных условиях, и в условиях мультистресса большая интенсивность роста культуры была у штамма 94Y.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Были изучены характеристики роста культуры пяти штаммов МБТ, отличающихся генетическими детерминантами устойчивости к фторхинолонам, при индивидуальном и парном культивировании. Исследованные мутантные по gyrA варианты МБТ представлены в популяции с разной частотой: наиболее распространены штаммы с мутацией в gyrA D94G (40%), второе место по распространенности — у штаммов с мутацией A90V (20%), далее следуют штаммы с мутацией D94A (15%) и D94Y (5%) [20]. Существуют и другие мутантные по gyrA варианты МБТ, но они очень редко выделяются от больных, что не позволило нам включить эти штаммы в исследование.

Гетерорезистентность популяции МБТ в организме хозяина можно рассматривать как частный случай внутривидовой конкуренции, так как имеется конкуренция за ограниченный ресурс между представителями одного вида, имеющего незначительные различия (в нашем случае — разная структура альфа-субъединиц ДНК-гиразы, кодируемых геном gyrA). Итогом такой конкуренции может стать исчезновение наименее приспособленного пула МБТ и распространение в популяции наиболее приспособленного пула. Поскольку предстояло изучить конкурентоспособность мутантных вариантов МБТ, одним из оцениваемых нами параметров был конкурентный фитнес штаммов МБТ при совместном культивировании. Традиционно конкурентный фитнес МБТ определяют, культивируя устойчивый штамм совместно с чувствительным штаммом с последующим пересевом смеси штаммов на среду с противотуберкулезным препаратом, определяя тем самым число КОЕ устойчивого штамма в смеси [23]. Но такой подход не позволяет сравнивать конкурентоспособность двух устойчивых штаммов, поэтому для определения конкурентного фитнеса нами впервые был использован метод мультиплексной ПЦР, позволяющий количественно оценить число КОЕ каждого мутантного варианта в образце. Так как исследование проводили в динамике, а не по конечной точке, примененный нами подход позволил также оценить удельную скорость роста каждого мутанта при совместном культивировании.

Кроме того, мы изучали рост совместно культивируемых штаммов не только в оптимальных условиях, но и в модели мультистресса, которая позволяет in vitro частично воссоздать условия, с которыми возбудитель сталкивается в макроорганизме: недостаток питательных веществ и вырабатываемые макрофагами в качестве бактерицидных агентов активные формы азота и кислорода [24].

Нами было показано, что конкурентный фитнес штаммов МБТ с мутациями в gyrA ниже, чем у штаммов с диким типом gyrA. Исключение при культивировании в оптимальных условиях составил только штамм 94Y с редко встречающейся мутацией, но в условиях, максимально приближенных к естественным, на модели мультистресса, скорость его деления существенно снизилась.

Низкая скорость деления мутантных по gyrA штаммов МБТ в целом была предсказуема, так как указанный ген кодирует альфа-субъединицу ДНК-гиразы [25]. Изменение структуры этого фермента вследствие мутаций в gyrA может негативно сказаться на процессах репликации и транскрипции ДНК в клетке МБТ и привести к снижению скорости роста возбудителя.

Ассоциацию между частотой встречаемости в популяции мутантных по gyrA вариантов МБТ и уровнем конкурентного фитнеса можно проследить на модели культивирования в условиях мультистресса: штамм с часто встречаемой мутацией gyrA_A90V имел высокие показатели конкурентного фитнеса, штамм с редкой мутацией gyrA_D94Y — низкие. Фитнес штамма с мутацией gyrA_D94A в модели мультистресса был сравним со штаммом 90V, однако в популяции встречался реже, возможно вследствие того, что мутация gyrA_D94A не строго ассоциирована с устойчивостью к фторхинолонам и, следовательно, пул МБТ, несущих эту мутацию, мог быть элиминирован в процессе химиотерапии [20, 26, 27].

Вызывает удивление, что штамм с наиболее распространенной мутацией gyrA_D94G имел наименьший уровень конкурентного фитнеса и наименьшую удельную скорость роста из всех исследованных штаммов. Однако снижение скорости деления в естественных условиях не всегда является недостатком, особенно под давлением отбора вследствие химиотерапии. Большинство противотуберкулезных препаратов эффективны в отношении активно делящихся МБТ, а медленно делящиеся пулы представляют собой серьезную проблему в плане эффективности химиотерапии [28, 29].

Следовательно, можно предположить, что широкая распространенность устойчивых к фторхинолонам МБТ с мутацией gyrA_D94G связана с низкой скоростью деления таких штаммов, что позволяет им избегать воздействия противотуберкулезных препаратов.

При обобщении результатов проведенного исследования представляется, что эволюционный успех наиболее распространенного мутантного по gyrA варианта МБТ заключается в толерантности к противотуберкулезным препаратам вследствие медленного роста. Встречающиеся в два раза реже МБТ с мутацией gyrA_A90V обладают хорошими ростовыми свойствами и получили свое преимущество за счет этой особенности. Штаммы с мутацией gyrA_D94A встречаются еще реже, так как, имея высокий уровень конкурентного фитнеса, не всегда устойчивы к фторхинолонам. МБТ с мутацией gyrA_D94Y обладают наименьшим фитнесом в условиях мультистресса и редко встречаются в популяции.

В заключение следует отметить, что в статье приведены данные пилотного исследования на ограниченной группе штаммов, следовательно, полученные выводы можно пока расценивать как предварительные и не делать на этом этапе обобщение на всю популяцию устойчивых к фторхинолонам МБТ. Для подтверждения полученных результатов запланировано полномасштабное исследование на большой выборке штаммов.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования было установлено, что штаммы МБТ с мутациями в gyrA различаются по способности адаптироваться к условиям конкуренции за питательные вещества in vitro. На уровень конкурентного фитнеса штаммов МБТ с различными генетическими детерминантами устойчивости к фторхинолонам оказывают влияние условия культивирования штаммов. Для большинства штаммов МБТ показана прямая ассоциация между уровнем конкурентного фитнеса в условиях мультистресса и частотой встречаемости в популяции. Мутации в gyrA снижают скорость роста МБТ, возможно, это помогает выжить возбудителю в условиях химиотерапии.