Несмотря на наличие множества терапевтических подходов, включающих современную хирургию с интраоперационной навигацией, современную радиотерапию, современную неоадъювантную терапию таргетными препаратами, ингибиторами контрольных иммунных точек и другие, продолжительность жизни пациентов при некоторых онкологических заболеваниях, таких как глиобластома, метастатическая меланома и ряд карцином с первичным метастазированием, остается крайне низкой. Именно поэтому актуальны исследования и разработки новых терапевтических подходов, направленных на элиминацию или предотвращение отдаленных метастазов.

Важным требованием к разработке новых противоопухолевых средств является высокоизбирательное онколитическое действие, способность обнаруживать и уничтожать только злокачественные/метастатические опухолевые клетки. Поэтому идеальными кандидатами на разработку онкоселективных средств являются непатогенные или аттенуированные вирусы. Онкоселективные терапевтические штаммы способны разрушать опухолевые клетки, эффективно реплицируясь в них, не повреждая при этом нормальные ткани [1].

В настоящее время особое внимание уделяется применению вирусов семейства Poxviridae в качестве прототипов онколитических вирусов для лечения метастазирующих карцином и меланомы. Перспективным онколитическим вирусом семейства Poxviridae является вирус осповакцины (vaccinia virus, VV) [2], в частности, российский биовариант штамма Листер — LIVP VV. Данный штамм широко применяли в международной программе ликвидации оспы, и он обладает исключительной онкоселективностью [3, 4], в особенности после инактивации гена тимидинкиназы, что приводит к избирательной репликации вируса в опухолевых клетках, богатых данным ферментом [5].

Для повышения противоопухолевых свойств аттенуированных штаммов VV конструируют рекомбинантные штаммы VV, экспрессирующие различные трансгены [6]. На данный момент известно множество трансгенов, которые проявили свою эффективность при экспрессии в VV, включая гены цитокинов и их рецепторов [7], иммуностимуляторов [8–10], онкотоксических белков [11], ингибиторов ангиогенеза [12].

В данной работе были сконструированы высокоонкоселективные штаммы вируса осповакцины, экспрессирующие человеческий или мышиный IFNα и tagRFP в составе бицистронной кассеты. Экспрессия IFNα рекомбинантным онколитическим штаммом может усиливать непрямое иммуноопосредованное онколитическое действие, за счет индукции экспрессии комплекса гистосовместимости I класса, увеличения активности цитотоксических Т-лимфоцитов, активации Т-хелперных клеток, макрофагов и NK-клеток [13].

Секреция интерферона в нормальных клетках приостанавливает трансляцию белка и клеточный цикл, замедляет метаболизм [14], поэтому, защищая клетки от вирусов, интерфероновые механизмы мешают пролиферации опухолевых клеток. Микроэволюция развивается таким образом, что в опухолевых клетках накапливаются ошибки в сигнальных путях индукции интерферона и интерферонового ответа, вследствие чего клетки могут утрачивать способность переходить в противовирусное состояние [15, 16]. Утрата механизмов интерфероновой защиты является одним из факторов, обусловливающих бесконтрольную пролиферацию опухолевых клеток [17].

Еще одним фактором, который делает онколитическую виротерапию перспективной, является способность ОВ стимулировать продолжительный противоопухолевый иммунный ответ [18]. Вирусы разрушают опухолевые клетки, и высвобождаются различные молекулы, такие как опухоль-ассоциированные антигены; патогенассоциированные молекулярные паттерны; молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждениями и цитокины [19]. Эти молекулы способствуют активации иммунных клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки и T-клетки, что формирует эффективный адаптивный иммунный ответ против опухоли [20, 21].

Интерфероны I типа ингибируют репликацию вируса в нормальных клетках, но в опухолевых клетках их действие не так эфективно [8, 17]. Благодаря этому интерфероны I типа обладают противоопухолевым действием, они способны индуцировать опухольспецифические цитотоксические Т-лимфоциты и активировать антиангиогенные факторы [22]. Примечательно, что сам по себе VV ингибирует систему интерферонового ответа посредством экспрессии некоторых генов [22]. Цель работы — оценить вклад экспрессии интерферона вирусом осповакцины в онколитическую активность вируса in vitro и in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы вируса осповакцины, используемые в работе

LIVP-hIFNα — вирус осповакцины, экспрессирующий человеческий IFNα и tagRFP; LIVP-mIFNα — вирус осповакцины, экспрессирующий мышиный IFNα и tagRFP; LIVP-RFP — вирус осповакцины, экспрессирующий tagRFP.

Культуры клеток, используемые в работе

BHK-21 — эмбриональная линия почки хомяка; HEK293T — трансформированная эмбриональная линия почки человека, содержащая SV40-антиген; U-87 MG, DBTRG05MG, U251-MG, PrGlioma 3821, PrGlioma 6067, PrGlioma 6138 — линии глиобластомы человека; HeLa — линия клеток аденокарциномы шейки матки; HEF — эмбриональная линия фибробластов человека; Embr.astro — эмбриональная линия астроцитов человека; B16 — мышиная меланома; 4T1 — мышиная аденокарцинома молочной железы.

Клеточные линии культивировали на среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone, США), антибиотика пенициллина-стрептомицина («ПанЭко», Россия) и 2 мМ L-глутамина. Клетки инкубировали при температуре 37 °C и 5% CO₂, пассировали каждые 3–5 дней.

Создание рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирющих кДНК IFNα мыши и человека

Получение плазмидных контрукций для рекомбинации

Для получения фрагмента кДНК мышиного IFNα самку мыши линии Balb/c инфицировали вирусом Сендай (Москва) в количестве 10⁹ инфекционных частиц. Через 24 ч мышь подвергали эвтаназии. мРНК экстрагировали из селезенки (total RNA isolation kit, Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. кДНК получали методом обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК Superscript III в соответствии с инструкциями производителя. Фрагменты амплифицировали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров:

Прямой: 5'-ATGGCTAGGCTCTGTG-3'

Обратный: 5'-TTTCTCTTCTCTCAGTCTTCCCA-3'

кДНК человеческого IFNa была получена путем ревертирования тотальной РНК периферических мононуклеаров крови здорового донора. Последовательности праймеров, использованных для амплификации:

Прямой 5'-ATGGCCTCGCCCTTTGC-3'

Обратный: 5'-TTCCTTCCTCCTTAATCTTTCTTGCAAG-3'

После получения ампликона была проведена повторная ПЦР с праймерами, содержащими рестрикционные сайты. Далее в шаттл-вектор, разработанный ранее в лаборатории пролиферации клеток, производили клонирование по липким концам. Готовые конструкции подвергали секвенированию по методу Сэнгера.

Полученные конструкции трансфецировали в клетки линии HEK293T с использованием PEI [23], после чего инфицировали биовариантом LIVP штамма Листер вируса осповакцины. Методом бляшек рекомбинантные штаммы отобрали на линии BHK-21 [7], а также наработали в препаративных количествах, как было описано ранее [24].

Определение чувствительности линий опухолевых клеток к штаммам вируса осповакцины

Чувствительность линий опухолевых клеток к штаммам вируса осповакцины определяли с помощью окрашивания резазурином. Для этого клетки рассевали на 96-луночные планшеты, далее инфицировали 10-кратными серийными разведениями вируса. В качестве контроля использовали среду, не содержащую вирус. Далее инкубировали при 37 °С, 5% СО₂. Через 72 ч после инфицирования проводили оценку цитотоксичности. Тест основан на возможности жизнеспособных клеток превращать резазурин в резоруфин путем окислительно-восстановительных реакций. Клетки инкубировали в течение 4 ч с красителем. Далее измеряли уровень флуоресценции при длине волны 590 нм с использованием длины волны возбуждения 560 нм на микропланшетном ридере CLARIOstar (BMG Labtech, Германия). По полученным данным определяли количество живых клеток в процентах относительно не зараженного контроля и считали величины показателя TCID₅₀.

Оценка вирусной кинетики методом проточной цитометрии

Экспрессия RFP в инфицированных клетках коррелирует с репликацией вируса. Клеточные линии рассевали на 24-луночные планшеты в количестве 10⁵ клеток на лунку. Далее клетки инфицировали LIVP-hIFNα в MOI 5, 1 и 0,2. Клетки собирали через 24, 48, 72, 96 ч после заражения для анализа методом проточной цитометрии. Образцы анализировали путем детектирования красной флуоресценции в PE-канале с использованием цитофлуориметра BD LSR Fortessa (Beckman Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США) с 10 000 событиями на образец.

Оценка функциональной активности интерферона, экспрессируемого вирусами

Вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана) является штаммом, чувствительным к противовирусному состоянию клетки, не способным оказывать цитопатогенное действие на клетках с сохранной системой интерферонового ответа после обработки интерфероном. Супернатант, содержащий IFNα, получали из вируссодержащей среды, снятой с клеток BHK-21, инфицированных в множественности 0,1 штаммом LIVP-hIFNα, или линии HEK293T в случае с штаммом LIVP-mIFNα. Вируссодержащую среду собирали через 48 ч, осветляли путем центрифугирования при 4 °С 4000 rpm 20 мин, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и получали супернатант, содержащий IFNα. В фильтрованном супернатанте оставались лишь следовые количества вируса осповакцины. Опухолевую клеточную линию обрабатывали в трех повторностях рекомбинантным человеческим IFNα2β (Фармаклон, Россия) или мышиным рекомбинантным интерфероном альфа (752802, Biolegend, США) в различных концентрациях, и супернатантом с интерферонами IFNα в различных концентрациях. В качестве контроля использовали супернатант с клеток, инфицированных LIVP-RFP и клетки без обработки интерфероном. Спустя день после обработки интерфероном на флуоресцентном микроскопе проверяли отсутствие вирусной инфекции. Через 24 ч после обработки супернатантом/интерфероном клетки инфицировали VSV в разных множественностях (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001). Через 24 ч проводили оценку цитопатического действия относительно не зараженного VSV контроля. И считали TCID50 по методу Рида и Менча.

Моделирование подкожной меланомы у мышей линии C57Bl/6, введение вирусов

Самкам (n = 12) и самцам (n = 12) мышей линии C57Bl/6 в возрасте 6–8 недель для создания модели мышиной меланомы подкожно, над задним бедром, вводили 106 клеток линии B16. Каждый день производили оценку роста и развития опухолей с помощью визуального осмотра и измерения размеров узла опухоли с использованием штангенциркуля. На седьмые сутки мышей с подтвержденным ростом подкожных аллографтов опухоли случайным образом распределяли на три группы — LIVPmIFNα (n = 8), LIVP-RFP (n = 8) и контроль (n = 8), по 4 самки и по 4 самца в каждой группе. Вируссодержащие растворы LIVP-mIFNα и LIVP-RFP в количестве 5 × 10⁶ БОЕ/мл растворяли в 100 мкл PBS и внутривенно вводили мышам соответствующих групп на 7-й и 10-й дни после имплантации опухолей. Животным контрольной группы в те же временные точки вводили физиологический раствор. За животными наблюдали в течение 24 дней, измеряли объем опухоли, чтобы оценить динамику ее роста или регрессии. Размеры опухолей измеряли до начала лечения, а затем каждые 2 дня. Объем опухоли вычисляли с использованием формулы:

формула

где a — меньшее из двух ортогональных измерений опухоли, b — второе ортогональное измерение. Затем, в каждой группе вычисляли средний объем опухоли (Vср).

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование

Гистологическое исследование проводили на трех дополнительных группах мышей C57Bl/6, которым вводили LIVP-mIFNα (n = 3), LIVP-RFP (n = 3) и физиологический раствор (n = 3) так же, как мышам основных групп.

На 24-е сутки после имплантации опухоли (14-е сутки после последнего введения вирусов) животных глубоко наркотизировали внутрибрюшинным введением запредельной дозы пропофола, после возникновения апноэ мышей подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков, подкожные аллографты опухолей аккуратно выделяли вместе с окружающей клетчаткой во избежание повреждения кистозных полостей и помещали в десятикратный объем 10%-го нейтрального забуференного формалина на 72 ч. Фиксированные ткани дегидратировали в растворах этанола восходящей концентрации (70%, 80%, 96%), затем в изопропаноле и О-ксилоле, после чего заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 3–5 мкм приготавливали с помощью ротационного микротома и монтировали на предметные стекла. Перед окрашиванием срезы депарафинировали в О-ксилоле, изопропаноле и этаноле. Для проведения гистологического исследования срезы окрашивали гематоксилином в течение 10 мин, промывали дистиллированной водой, затем проточной водопроводной водой и докрашивали эозином в течение 30 с. Далее срезы повторно дегидратировали в 96%-м этаноле, изопропаноле и О-ксилоле и монтировали с помощью среды «Витрогель» и покровных стекол толщиной 0,15 мм. Иммунопероксидазное окрашивание парафиновых срезов на маркеры иммунных клеток проводили c помощью иммуностейнера Benchmark Ultra Immunostainer (Ventana, США) с применением первичных антител к CD4, CD8, CD56 (Roche, США) и набора OptiView DAB IHC Detection Kit (Roche, США) в соответствии с протоколами производителя. Окрашенные и покрытые покровными стеклами препараты сканировали с помощью сканера Leica Aperio GT450 DX (Leica Biosystemc, США) и обрабатывались при 20-кратном увеличении с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Создание рекомбинантных штаммов

Ген IFNα — один из перспективных трансгенов, способный повысить онкоселективность вируса благодаря своим иммуностимулирующим свойствам и ингибированию вирусной репликации в нормальных тканях. В нашей работе были созданы рекомбинантные штаммы биоварианта LIVP, экспрессирующие под управлением промотора p7,5k VV IFNα (человека или мыши) в составе бицистронной кассеты с красным флуоресцентным белком RFP (рис. 1). Применение данного раннего промотора позволило добиться высокого уровня экспрессии интерферона в опухолевых клетках.

Для дальнейшего культивирования рекомбинантного штамма вируса осповакцины была выбрана клеточная культура BHK-21 как высокочувствительная к вирусу осповакцины. Рекомбинантные варианты экспрессировали флуоресцентный белок (рис. 2). Корректность экспрессии трансгенов была подтверждена путем секвенирования по Сэнгеру ампликонов транскриптов, фланкированных участками гена тимидинкиназы вируса осповакцины.

Эффективность репликации вируса в различных опухолевых линиях была определена методом проточной цитометрии спустя 24, 48, 72 и 96 ч после инфицирования вирусом. Были протестированы опухолевые клеточные линии человека: (аденокарцинома HeLa, глиобластома U251-MG) и мыши (меланома B16, аденокарцинома 4T1). Клеточная линия BHK-21 была использована в качестве эталонной. Клеточные культуры HeLa и U251-MG были инфицированы в MOI 1 и 0,1 штаммами LIVP-hIFNα, LIVPRFP. Клеточные культуры B16 и 4T1 инфицированы в тех же множественностях штаммами LIVP-mIFNα, LIVP-RFP. Через 24, 48, 72 и 96 ч после заражения определяли процент RFP-положительных клеток.

Было обнаружено, что рекомбинантный штамм LIVPmIFNα слабо реплицируется в аденокарциноме 4Т1, но при MOI 1 дает более чем 20%-й уровень репликации в меланоме В16 (рис. 3). LIVP-hIFNα показал эффективную репликацию в культурах опухолевых клеток человека. Спустя 24 ч линия HeLa при инфицировании различными множественностями показала максимальную заражаемость среди исследованных линий: MOI 1 — 34,44 ± 1,38%, MOI 0,1 — 7,82 ± 0,96%. Примечательно, что в культуре глиобластомы человека при MOI 1 через 96 ч после заражения репликация вируса LIVPhIFNα не отличалась от контрольного и составляла почти 100%. Для подтверждения гипотезы об онкоселективности LIVP-hIFNα в отношении глиобластомы мы протестировали его цитопатогенное действие на расширенной панели линий этой опухоли.

Оценка цитопатогенного действия рекомбинантных штаммов на панели опухолевых и нормальных клеточных линий

На панели опухолевых и нормальных клеток человека и мыши была исследована онколитическая активность вируса осповакцины, экспрессирующего интерфероны альфа, в сравнении со штаммом, экспрессирующим tagRFP. С помощью титрования вируса LIVP-hIFNα по методу Рида и Менча и определения величины TCID50, была оценена чувствительность клеточных линий глиобластомы U-87 MG, DBTRG-05MG, U251-MG, PrGlioma 3821, PrGlioma 6067, PrGlioma 6138 (рис. 4А), а также две нормальные клеточные линии: эмбриональная линия фибробластов человека HEF, эмбриональная линия астроцитов человека Embr.astro. Штамм, экспрессирующий мышиный интерферон, был протестирован на линиях мышиной глиомы CT2A и GL261, а также на аденокарциноме 4T1 и меланоме B16 (рис. 4Б).

Исследование на панели линий глиобластомы человека показало достаточно высокую чувствительность этих линий к LIVP-hIFNα, сопоставимую с чувствительностью клеток глиобластомы к контрольному вирусу, экспрессирующему tagRFP (рис. 4). Было обнаружено, что нормальные фибробласты и астроциты имеют меньшую чувствительность к вирусу осповакцины, экспрессирующему hIFNα, чем к вирусу, экспрессирующему tagRFP. Эти данные свидетельствуют о том, что полученный рекомбинантный штамм является более онкоселективным, по сравнению с контрольным штаммом LIVP-RFP. Одинаковая чувствительность исследованных линий к вирусам, экспрессирующим IFNα и tagRFP, в свою очередь свидетельствует, что прямая цитопатическая активность вируса, экспрессирующего интерферон, по отношению к опухолевым клеткам сохранилась.

Исследование функциональной активности интерферонов, экспрессируемых вирусом осповакцины

Функциональную активность экспрессируемых интерферонов определяли классическим тестом с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV). Вирус везикулярного стоматита чувствителен к противовирусному состоянию, т. е. не способен оказывать цитопатогенное действие на клетки с сохранной системой интерферонового ответа после обработки интерфероном. Было показано, что опухолевые клеточные линии U87-MG и B16 имеют сохранную систему интерферонового ответа [25].

Клеточные культуры обработали профильтрованным супернатантом, снятым с клеток, инфицированных LIVP-hIFNα или LIVP-mIFNα, а также заводскими рекомбинантными IFNα (рис. 5). В качестве контроля использовали клетки без обработки интерфероном и клетки, обработанные профильтрованным супернатантом, который был снят с клеток, инфицированных LIVP-RFP.

Супернатант для эксперимента с человеческим интерфероном был снят с клеточной линии BHK-21, инфицированной LIVP-hIFNα. Супернатант для эксперимента с штаммом LIVP-mIFNα получили с клеток линии HEK293T, так как мышиный и хомячковый интерфероны обладают кроссактивностью.

Спустя день после обработки интерфероном на флуоресцентном микроскопе проверяли отсутствие вирусной инфекции. Через 24 ч после обработки интерфероном клетки инфицировали VSV в разных множественностях инфекции.

ЦПД вируса везикулярного стоматита полностью отсутствовало при обработке клеток рекомбинантным интерфероном в концентрации 320 ед./мл, или 2%-м разведением кондиционированной среды в случае человеческого интерферона. Для мышиного интерферона ЦПД отсутствовало при обработке клеток рекомбинантным интерфероном в концентрации 6,6 нг/мл или 0,25%-м разведении кондиционированной среды.

Противоопухолевая активность LIVP-mIFNα in vivo

Онколитическую активность вируса осповакцины LIVP-mIFNα исследовали на мышах линии C57Bl/6 с мышиной меланомой B16 (рис. 6). Внутривенная виротерапия была проведена на 7-й и 10-й дни после имплантации опухоли. Контрольной группе мышей был введен физиологический раствор.

Объем опухолей измеряли через день. При лечении вирусом осповакцины наблюдали меньший объем опухолей по сравнению с контрольной группой, особенно при лечении вирусом, экспрессирующим мышиный интерферон альфа.

Средний объем опухолей в контрольной группе составил 1800 мм³, в группе, получавшей LIVP-RFP, — 1450 мм³, а в группе, получавшей вирус с мышиным интерфероном альфа, — 650 мм³ (p-value < 0,01). Снижение объема опухолей по сравнению с группой контроля составило 64% (рис. 6).

Гистологический анализ подкожных аллографтов опухолей на 24-е сутки после имплантации (14-е сутки после последнего введения вирусов) показал гетерогенную гиперцеллюлярную структуру опухоли с участками некрозов и кровоизлияний, с включениями меланина и гистиоцитарной инфильтрацией. В препаратах животных, получивших внутривенную терапию онколитическими вирусами, наблюдали сливные некрозы с выраженной гистиоцитарной инфильтрацией (рис. 7; H & E). Иммуногистохимический анализ показал наличие инфильтрации CD4⁺-, CD8⁺-Т-клетками и CD56⁺-NK клетками во всех исследуемых образцах. При этом в препаратах после терапии VV наблюдалось значимо более высокое содержание цитотоксических Т-клеток и NK-клеток (до 40 в поле зрения) (рис. 7). Полученные результаты позволяют заключить, что репликация рекомбинантных вирусов существенно снижает иммунологическую «холодность» меланомы В16, способствуя инфильтрации стромы опухоли иммунокомпетентными клетками.

Резюмируя полученные результаты, можно заключить, что разработанный онкоселективный штамм вируса осповакцины, экспрессирующий функционально активный мышиный интерферон альфа, обладает существенной противоопухолевой активностью на модели мышиной меланомы В16.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ДНК-содержащий вирус осповакцины является перспективной платформой для создания селективных рекомбинантных онколитических штаммов, поскольку его геном может вмещать вставки размером до 25 т.п.н. [6]. К настоящему моменту созданы и успешно испытаны в доклинических и клинических исследованиях рекомбинантные штаммы VV, содержащие последовательности цитокинов, хемокинов, онкотоксических белков [11], бактериальных иммуноатрактантов (например, лиганда рецептора врожденной иммунной системы TLR5 флагеллина [10]) и других белков, активирующих противоопухолевых иммунный ответ и рекрутирующих в опухоль цитотоксические иммунные клетки [7, 26, 27].

Рекомбинантный штамм вируса JX-594, содержащий делецию в гене тимидинкиназы (TK), а также последовательность гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и трансгены lac-Z, показал весьма обнадеживающие результаты во II фазе клинических испытаний онколитической терапии метастазов в печени колоректального рака и меланомы. Введенный внутривенно вирус JX-594 обнаруживался в опухолевой ткани, что сопровождалось секрецией IFNα, индукцией хемокинов и активацией противоопухолевого иммунного ответа [26].

В нашем исследовании с целью повышения онкоселективности мы также использовали штамм LIVP с дефектным геном TK — фермента, необходимого для синтеза ДНК вируса, который практически не экспрессируется в процессе нормального клеточного цикла, но высоко экспрессирован в низкодифференцированных опухолевых клетках [28]. Мы предположили, что включение в рекомбинантный вирус осповакцины последовательности IFNα может усилить селективность репликации вируса в опухолевых клетках, в которых интерфероновый сигналинг часто дефектен, а также будет способствовать активации NK-клеток, макрофагов и цитотоксических Т-клеток в ответ на опухольспецифичную репликацию вируса и таким образом, способствовать эффективной эрадикации опухоли.

Эксперименты с определением величины TCID50 для опухолевых и нормальных клеточных линий подтвердили наше предположение о повышенной онкоселективности LIVP-hIFNα, показав, что нормальные клетки имеют меньшую чувствительность к вирусу осповакцины, экспрессирующему IFNα, чем к вирусу, экспрессирующему tagRFP. Эксперименты со снижением ЦПД вируса везикулярного стоматита после обработки клеток глиобластомы человека и аденокарциномы мыши супернатантами от зараженных LIVP-hIFNα и LIVP-mIFNα клеток соответственно, подтвердили, что экспрессируемый зараженными клетками IFNα является функционально активным. Наиболее чувствительной к LIVP-hIFNα оказалась линия HeLa, что позволяет предполагать потенциальную применимость созданного рекомбинантного вируса для терапии аденокарцином. Обнаруженная нами чувствительность к LIVP-hIFNα у клеток глиобластомы U251-MG показалась весьма интересной с точки зрения возможного практического применения данного вируса в терапии глиальных опухолей. Это предположение было подтверждено нами еще на пяти линиях этой опухоли, включая первичные культуры глиобластомы, имеющиеся в нашем распоряжении. Эти данные позволяют предположить, что LIVP-hIFNα может быть перспективным онколитическим вирусом для терапии глиобластомы.

Результаты исследований in vivo на мышиной модели меланомы B16 подтвердили наше предположение о высокой онкоселективности LIVP-mIFNα и усиленной онколитической активности. Снижение объема опухоли у животных, получивших внутривенную терапию LIVP-mIFNα на 64% по сравнению с контрольными животными, убедительно свидетельствует о преимуществах созданного нами рекомбинантного VV, приводящего к секреции зараженными клетками функционально активного IFNα. Иммуногистохимические исследования показали высокий уровень инфильтрации опухолей, пролеченных LIVP-mIFNα  CD8⁺-Т-клетками и NK-клетками. Механизмы повышенной онколитической активности LIVP-mIFNα нуждаются в дополнительных исследованиях, но по данным литературы и нашим собственным данным в отношении других рекомбинатных штаммов [7, 10], содержащих последовательности цитокинов, можно предположить, что наблюдается повышенная активация NK-клеток и цитотоксических Т-клеток вокруг опухоли, секретирующей IFNα.

ВЫВОДЫ

Созданы новые рекомбинантные штаммы вируса осповакцины, экспрессирующие IFNα мыши и человека, характеризующиеся сопоставимой с материнским штаммом онколитической активностью, при этом для LIVP-hIFNα показана значимая онкоселективность за счет уменьшения чувствительности нормальных клеток к этому вирусу. В экспериментах in vitro подтверждена функциональная активность интерферонов, экспрессируемых рекомбинантными штаммами LIVP-hIFNα и LIVP-mIFNα.

Продемонстрирована достоверно более высокая онколитическая активность LIVP-mIFNα in vivo на модели мышиной меланомы В16.