Согласно определению, терапевтическое действие геннотерапевтического лекарственного препарата обусловлено последовательностью рекомбинантной нуклеиновой кислоты, входящей в его состав, или продуктом экспрессии такой последовательности [1]. В зависимости от молекулярного механизма, лежащего в основе заболевания, терапия может быть направлена на исправление генных дефектов или придание клеткам новых свойств. Тактика в отношении функции поврежденного гена может состоять в добавлении рабочей копии, подавлении экспрессии или исправлении последовательности. Добавление рабочей копии применяют для аутосомно-рецессивных заболеваний. Подавление экспрессии поврежденного гена — для аутосомно-доминантных [2]. С развитием методов геномного редактирования исправление последовательности поврежденного гена рассматривается как приоритетное направление разработки препаратов для лечения заболеваний и с аутосомно-рецессивным, и  с аутосомно-доминантным типами наследования. Действие CAR-T-терапии, наиболее широко используемого в клинической практике геннотерапевтического препарата, основано на придании клеткам новых свойств, в данном случае введении химерного рецептора, позволяющего распознавать и уничтожать опухолевые клетки [3].

Актуальные методы генной терапии

Вне зависимости от механизма реализации терапевтического действия нуклеиновой кислоты, содержащейся в генотерапевтическом препарате, ключевым для разработки технологии производства препарата является выбор между in vivo и ex vivo доставкой терапевтической конструкции в клетки-мишени. В варианте in vivo применения препарат, содержащий вектор, вводят непосредственно в организм пациента. Для ex vivo применения из организма пациента выделяют клетки, подвергают генетической модификации и возвращают пациенту.

На сегодняшний день использование вирусных векторов — наиболее изученный способ доставки гена в клетку. Вирусы используют для таргетной доставки необходимого генетического материала в клетки in vivo и ex vivo. Лидерами среди переносчиков модифицированных генов являются аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы и лентивирусные векторы. AAV-векторы преимущественно используют in vivo, в то время как лентивирусные — для ex vivo терапии [4, 5].

РНК-методы в генной терапии представляют собой быстро развивающуюся область со значительным потенциалом для лечения различных заболеваний. Эти методы включают терапию с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, РНК-интерференции и матричной РНК (мРНК). Развитие невирусных систем доставки РНК, в частности на основе инкапсуляции в липидные наночастицы, позволит в перспективе обходиться без вирусных систем доставки и избежать рисков, связанных с реакцией иммунной системы на вирусные белки и с неконтролируемой интеграцией трансгенов в геном клеток пациента [6].

Прорывной технологией стала разработка нового метода геномного редактирования CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas9 можно использовать для коррекции генетических мутаций путем точного редактирования дефектного гена. Этот подход особенно актуален для моногенных заболеваний, когда за заболевание отвечает точечная мутация гена [7].

Генная терапия in vivo обладает конкурентным преимуществом в большинстве случаев благодаря возможности создания готовых лекарственных препаратов, адаптированных под основную когорту пациентов. Этим обусловливаются легкость масштабирования, снижение цены за единицу продукции и готовность к применению по требованию.

Генная терапия ex vivo, в основном, представлена в лечении онкологических заболеваний (в этом случае модификации подвергают иммунные клетки) и в лечении наследственных заболеваний генетически модифицированными гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). ГСК являются оптимальными клеткамимишенями для терапевтического изменения генома благодаря их способности самообновляться и дифференцироваться. Таким образом обеспечиваются длительный уровень экспрессии терапевтической конструкции и доставка продуктов ее экспрессии в дифференцированные клетки, в большую часть организма. Кроме того, ГСК не несут риска иммуногенности, связанного с непосредственным применением высоких доз вирусных векторов in vivo [8].

Генная терапия на основе гемопоэтических стволовых клеток

Методика ex vivo генной терапии гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК ГТ) — многоступенчатый процесс. Сначала клетки ГСК забирают у пациента, затем их культивируют, подвергают генетической модификации, и модифицированные клетки вводят снова пациенту. Введенные клетки заселяют нишу ГСК в костном мозге [9]. ГСК ГТ ex vivo представляется перспективным подходом для лечения моногенных генетических заболеваний, включающих первичные иммунодефициты, гемоглобинопатии и лизосомные болезни накопления.

Наиболее успешный пример ГСК ГТ — зарегистрированный в 2020 г. геннотерапевтический препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии (МЛД) — Libmeldy. Препарат представляет собой аутологичные ГСК, трансдуцированные лентивирусным вектором, несущим функциональную копию гена ARSA. Результаты лечения показали наличие хорошего терапевтического эффекта и длительной продолжительности действия препарата [10]. Использование векторов на основе лентивирусов обеспечивает стабильную интеграцию генетической конструкции в геном, высокую и длительную экспрессию гена. Однако при использовании вирусных векторов для модификации ГСК возникает риск инсерционного мутагенеза. Так при попытке лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) аналогичным препаратом на основе ГСК ГТ был выявлен повышенный риск развития Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза. Несмотря на усилия, направленные на изменения дизайна лентивирусных векторов с целью снижения риска развития онкологических заболеваний вследствие интеграции трансгена, были выявлены аналогичные осложнения при применении препарата для лечения адренолейкодистрофии [11]. Повышение безопасности модифицированных ГСК может быть достигнуто использованием невирусных систем доставки на основе транспозонов и систем редактирования генома на основе CRISPR/Cas-систем.

Преимущество ex vivo ГСК ГТ в сравнении с in vivo терапией на основе вирусных векторов состоит в отсутствии необходимости использовать высокие дозы вектора и подвергать этим самым пациента риску развития иммунных реакций. В частности, при использовании AAV-векторов вследствие эффекта первого прохождения значительная часть частиц остается в печени. Другими словами, если целевой орган-мишень отличен от печени, то AAV векторы его не достигают в нужной терапевтической дозе, а использование более высоких доз оказывает гепатотоксический и имуногенный эффекты [12]. Так как при ГСК ГТ используют аутологичные клетки пациента, иммуногенность данных препаратов минимальна. Трансплантация ГСК со стабильной интеграцией генотерапевтической конструкции обеспечивает длительный, теоретически пожизненный, терапевтический эффект. В случае болезней кроветворения, таких как синдром Вискотта–Олдрича и других первичных иммунодефицитов, ГСК сами являются целевыми клетками. ГСК способны проникать через гематоэнцефалический барьер, дифференцироваться в макрофаги, занимая нишу микроглии, и экспрессировать необходимые ферменты в тканях головного мозга [13]. Этим объясняется эффект от трансплантации аллогенных ГСК от здорового донора для терапии группы наследственных заболеваний, обусловленных повреждением нервных клеток головного мозга, включающих мукополисахаридозы, адренолейкодистрофию, метахроматическую лейкодистрофию. Тот же эффект достигается при использовании аутологичных ГСК с исправленным генным дефектом.

Улучшение методов культивирования ГСК ex vivo позволяет получить значительно больше ГСК для модификации, чем доступно при непосредственном использовании клеток, собранных у пациента. Высокие дозы ГСК, используемых для трансплантации, позволяют надеяться на введение в практику протоколов трансплантации модифицированных ГСК, не требующих геннотоксичных режимов кондиционирования. В настоящее время для достижения клинического эффекта от трансплантации ГСК требуется предварительное миелоаблятивное кондиционирование с помощью химиотерапии, направленной на подавление костного мозга пациента. Такое кондиционирование несет как краткосрочные риски, связанные с развитием инфекционных заболеваний, так и отдаленные риски нарушения роста, интеллектуального развития, потери фертильности, развития других заболеваний [14]. В настоящее время разрабатываются протоколы формирования ниши ГСК с использованием конъюгатов антител, специфичных к ГСК с токсинами.

Сегодня самый дорогой препарат в мире — препарат Lenmeldy на основе ГСК для лечения метахроматической лейкодистрофии [15]. В силу использования для производства препарата клеток пациента отсутствует возможность снижения стоимости дозы препарата увеличением объема производимой партии. Кроме того, ex vivo применение требует обеспечения сложной логистики и несет дополнительные риски обеспечения качества и безопасности применения, связанные с донорским материалом. Возможность снижения стоимости производства данных препаратов связана с оптимизацией логистики доставки донорского материала и готового препарата и автоматизации процесса производства. Существенного снижения стоимости препаратов можно ожидать от замены используемых в настоящее время вирусных векторов на невирусные системы доставки геннотерапевтических конструкций. Такой подход поможет сократить время и затраты на каждую единицу лекарственного препарата. Создание научно-технологических комплексов для разработки персонализированных лекарственных препаратов на основе ГСК ГТ поможет автоматизировать, ускорить и масштабировать процесс производства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, разработка ГСК ГТ ex vivo актуальна и перспективна на сегодняшний день. Развитие такой терапии предоставит возможности для этиологического лечения многих неизлечимых генетических заболеваний. Дальнейшее изучение данного направления генной терапии, совершенствование имеющихся методов и разработка новых позволят расширить количество заболеваний, лечение которых эффективно с клинической и экономической точек зрения препаратами ГСК ГТ.