Последние десятилетия ознаменовались значительными достижениями в самых различных областях, связанных с наукоемкими технологиями. Не исключением стала и репродуктивная медицина. С каждым годом появляется все больше методов исследования биологических материалов, привлекающих внимание ученых.

Одним из новых методов является рамановская спектроскопия (или спектроскопия комбинационного рассеяния), принципы которой описаны уже более 80 лет назад. Несмотря на давнюю историю, только совершенствование аппаратуры и программного обеспечения позволило применить эту методику для исследования детальной молекулярной структуры («отпечатка») биологического образца.

Неуклонно растет интерес исследователей к проблеме мужского бесплодия вообще и, в частности, к идентификации поломок ядерной ДНК сперматозоида. Известно, что сперматозоид может обладать хорошей морфологией и подвижностью согласно критериям оценки Всемирной организации здравоохранения, однако эмбрион, образовавшийся при оплодотворении яйцеклетки таким сперматозоидом, отличается плохим качеством, низким уровнем имплантации и часто останавливается в развитии [1–2]. Часть поломок ДНК в сперматозоиде может восстановить яйцеклетка, но при накоплении критической массы повреждений, репаративной системы ооцита оказывается недостаточно. В связи с этим возрастает интерес к исследованию ядерной ДНК сперматозоида и оценки ее функционального состояния. Так как рутинные методы исследования эякулята при помощи световой микроскопии не позволяют получить такую информацию, в последнее время стали широко распространяться дополнительные методы оценки сперматозоида. В особенности это касается методов исследования фрагментации ДНК сперматозоидов [3–7]. К ним можно отнести: окраску анилиновым голубым, хромомицином А3, метод дисперсии хроматина (Comet), TUNEL, SCSA и др. К сожалению, все эти методы деструктивны, а, следовательно, несут крайне мало практически полезной информации для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях. Существует потребность в методе, который соответствовал бы следующим критериям: позволял исследовать единичный сперматозоид без его повреждения, позволял проводить оценку целостности ядерной ДНК сперматозоида и его функционального состояния, т. е. биохимического и метаболического профиля, и использования данного сперматозоида для последующего оплодотворения методом ИКСИ (интрацитоплазматическое введение сперматозоида в яйцеклетку). С учетом вышеизложенных требований весьма перспективным представляется изучение возможностей конфокальной рамановской спектроскопии для получения более глубокой информации о строении и функциональном состоянии сперматозоида.

В последнее время появляется все больше работ, посвященных применению конфокальной рамановской спектроскопии для исследования биологических тканей, живых клеток, субклеточных органелл и метаболических внутриклеточных процессов. Однако существует не так много работ по изучению спектральных характеристик сперматозоида. В 1980 г. была применена рамановская спектроскопия на живой клетке с использованием сперматозоида лосося [8]. При сравнении рамановских спектров, полученные от сперматозоидов с нормальной и аномальной морфологией [9], исследователи пришли к выводу, что не всегда морфология сперматозоида коррелирует с правильной упаковкой ее ядерной ДНК. При изучении спектров, полученных от субклеточных органелл, а также влияния на них УФ-излучения [10] описаны спектры от акросомы, ядра и шейки сперматозоида. Работу по применению рамановской спектроскопии в визуализации повреждений ядерной ДНК сперматозоида продолжили и другие авторы [11]. Для нарушения структуры ДНК они использовали УФ-облучение и зафиксировали характерное изменение пиков в области 1095/1050 см^–1. Было также описано оксидативное повреждение ДНК в реакции Fenton с перекисью водорода  [12]. Спектры, полученные с поврежденных таким образом спематозоидов, полностью соответствовали представленными ранее [11]. Нами было высказано предположение о связи морфологии сперматозоида, целостности его ядерной ДНК и рамановских спектров, полученных с области ядра [13]. Впоследствии эти результаты были подтверждены другими авторами с использованием красителей хромомицина А3, анилинового голубого и акридинового оранжевого для комплексной оценки нуклеопротеинового комплекса сперматозоида [14].

В эпоху революции omics (метаболомика, протеомика и т. д.) рамановская спектроскопия является мощным инструментом для исследования биохимических процессов в клетке. Однако использование этого метода и интерпретация результатов невозможны без привлечения специалистов — физиков, химиков, математиков, так как знания и навыки, необходимые при работе с данной методикой выходят далеко за пределы биологического или медицинского образования.

Цель исследования — получить информацию о спектральных характеристиках клеточных органелл сперматозоида человека. Оценить влияние повреждающего действия рентгеновского излучения на нуклеопротеиновый комплекс ядра сперматозоида человека по изменению рамановского спектра.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Здоровые доноры сдавали образцы спермы с помощью мастурбации. Период полового воздержания составлял 2–7 дней.

Критерии включения доноров спермы в исследование: возраст 18–35 лет; отсутствие гемотрансмиссивных инфекций; отсутствие инфекций, передающихся половым путем; отсутствие тяжелых хронических соматических заболеваний; отсутствие психических заболеваний; нормальный мужской кариотип 46 XY.

Критерии исключения доноров спермы из исследования: повышенная температура тела на момент сдачи эякулята; прием антибиотиков, глюкокортикоидов, антидепрессантов на момент сдачи эякулята; отсутствие требуемого (2–7 дней) периода полового воздержания.

В каждом случае выполняли рутинное семиологическое исследование эякулята при помощи световой микроскопии. Результаты интерпретировали согласно Рекомендациям ВОЗ 2010 г., результаты соответствовали нормозооспермии.

Процедура пробоподготовки перед конфокальной рамановской спектроскопией

Эякулят центрифугировали в двойном градиенте плотности (FertiPro, Breenem; Бельгия) в течение 20 минут при 415 g.

После удаления супернатанта осадок ресуспендировали с PBS (phosphate buffered saline; Sigma–Aldrich, США) при 37 °C и повторно центрифугировали в течение 10 мин при 415 g. Далее 10 мкл суспензии сперматозоидов наносили на алюминиевую подложку, препарат фиксировали 70%-м спиртом и высушивали на воздухе.

Конфокальная  рамановская спектроскопия

Исследования выполняли на конфокальном рамановском микроскопе Senterra (Bruker, Германия). Прибор состоит из двух основных блоков — конфокального бинокулярного микроскопа с возможностью оцифровки изображения и спектрометра. Полностью конфокальная система способна приспосабливаться к трем различным возбуждающим длинам волн, при этом обеспечивая максимально возможное пространственное разрешение. Так как Senterra базируется на оптическом микроскопе, доступны все необходимые инструменты для визуальной характеристики образца. Спектральный анализ различных компартментов (ядра, акросомы, шейки) сперматозоида проводили при длине волны возбуждающего лазера 532 нм и мощности 10 мВт в диапазоне 280–1730 см^–1 с разрешением 3–5 см^–1. Время накопления сигнала в точке составило 3 раза по 20 с. Безопасность воздействия лазерного излучения на клетку и отсутствие фотоиндуцированного повреждения при указанных параметрах мощности подтверждены в литературе [15].

Предварительная обработка спектров

Каждый спектр анализировали в диапазоне 680–1700 см^–1 после коррекции базовой линии полиномиальной функцией 4-й степени (Polynomial baseline fitting) и сглаживания по методу скользящего среднего по 21 точке. Кроме того была выполнена стандартизация нормировкой вариации (SNV, standard normal variate) всех спектров.

На основе предобработанных спектров составили матрицу данных X (176 × 510), где в каждой строке записаны интенсивности рамановских спектров в интервале 680–1700 см^–1 с шагом 2 см^–1,  а количество строк соответствует количеству спектров.

Вторым этапом оценивали последствия повреждающего воздействия рентгеновского излучения на сперматозоид. Для этого суспензию сперматозоидов разделяли на три аликвоты. Первую аликвоту составлял контрольный образец; вторую и третью аликвоты подвергали воздействию фокусированного пучка рентгеновского излучения в течение 5 и 10 мин соответственно. Полученные результаты сравнивали между собой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было исследовано 19 образцов спермы, взятой у 19 здоровых доноров в возрасте от 18 до 35 лет. Всего было снято 176 спектров; определены спектры, присущие сперматозоиду с нормальной морфологией.

На рис. 1А представлен морфологически нормальный сперматозоид. Точками обозначены участки, с которых производилось снятие спектров. Метка номер 1 соответствует ядру сперматозоида, номер 2 — акросоме, номер 3 — средней части. На рис. 1Б представлен сравнительный график спектральных характеристик, полученных с каждого участка.

Рамановские спектры, полученные от ядра интактных сперматозоидов и сперматозоидов, подвергшихся воздействию рентгеновского излучения в течение 5 и 10 мин, представлены на  рис. 2.

Несмотря на разную интенсивность в полученных спектрах, мы не отметили различий в основных рамановских пиках, присущих клеткам при повреждении ДНК при воздействии рентгеновского излучения в течение 5 и 10 мин по сравнению с интактными образцами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как причины, приводящие к неправильному развитию сперматозоида или его последующему повреждению, крайне разнообразны, так и проявления подобных нарушений имеют мультивалентную природу.

Опираясь на данные литературы, мы сопоставили полученные нами пики, регистрируемые при рамановской спектроскопии с соответствующими им группами атомов (см. ).

При анализе спектров сперматозоида (рис. 1Б) можно выделить следующие характерные пики.

Присущие ДНК ядра (1092 см^–1 и 780 см^–1). Пик 1092 см^–1 является маркером B-ДНК и Z-ДНК. В норме для него характерно пологое или горизонтальное плечо в области 1063 см^–1. Данная особенность присуща ядру с неповрежденной ДНК. Пик в области 780 см^–1 соответствует вибрациям тимина и цитозина, а также остову ДНК. По мнению некоторых авторов, данный пик служит маркером протаминовой упаковки ДНК, что было подтверждено более поздними исследованиями [9, 16]. Тройной пик в областях 1420 см^–1, 1445 см^–1 и 1486 см^–1 отличается определенной формой в виде «лестницы» с наиболее высокой частью в области 1486 см^–1. Пик, характерный для аминокислоты фенилаланин (1002 см^–1), является постоянным и присутствует практически на всех графиках с разной интенсивностью.

Присущие акросоме. Анализируя спектральные характеристики акросомы, можно отметить общее снижение интенсивности практически всех пиков. Характерно изменение формы тройного пика 1420 см^–1, 1445 см^–1 и 1486 см^–1 с преобладанием средней части в области 1445 см^–1, что соответствует метиленовой деформации эндогенных липидов.

Присущие средней части сперматозоида (шейке). Спектральные характеристики средней части отличаются пиком высокой интенсивности в области 748 см^–1 — маркером присутствия митохондрий [4]. Также растет интенсивность пика 1576 см^–1, который помимо нуклеиновых кислот соответствует большому количеству АТФ [10]. Обращают на себя внимание исчезновение пика 1092 см^–1 и перемещение его в область 1127 см^–1. Возможно это связано с присутствием митохондриальной ДНК, но подтверждения этому в источниках литературы мы не нашли.

Отсутствие значимых изменений в спектрах при воздействии рентгеновского излучения может быть объяснено достаточно высокой стабильностью интактного нуклеопротеинового комплекса зрелого сперматозоида в отличие от активно делящихся клеток-предшественниц сперматогенного ряда.

ВЫВОДЫ

Проведенное пилотное исследование позволило  показать возможности рамановской спектроскопии в исследовании биохимических процессов и ультраструктуры сперматозоида. Были созданы собственная библиотека спектров, полученных с нормальных сперматозоидов, и модель с искусственным повреждением сперматозоидов пучком рентгеновского излучения. Исследование проведено на фиксированном сперматозоиде, тем не менее, при помощи конфокальной рамановской спектроскопии с использованием оптического (лазерного) пинцета теоретически возможно отбирать неповрежденный живой сперматозоид и использовать его для оплодотворения с помощью ИКСИ. Нужны дальнейшие работы в этом направлении.