Гетерогенность рака молочной железы (РМЖ) определяется не только разнообразием опухолевых клеток, но и сложным клеточным составом микроокружения опухоли [1]. Одними из ключевых клеток в микроокружении являются фибробласты — активные участники онкогенеза. Они ремоделируют внеклеточный матрикс [2], опосредуют иммуносупрессию, в частности, создавая физический барьер для иммунокомпетентных клеток [3], секретируют провоспалительные цитокины и факторы роста, которые непосредственно стимулируют пролиферацию опухолевых клеток и ангиогенез [4, 5]. Среди различных субпопуляций опухоль-ассоциированных фибробластов (ОАФ) особый интерес представляют фибробласты, экспрессирующие белок активации фибробластов альфа (fibroblast activation protein alpha, FAP), ввиду их исключительной роли в этих процессах. При некоторых карциномах высокий уровень экспрессии FAP является универсальным маркером агрессивной опухолевой стромы и достоверно ассоциирован с неблагоприятным прогнозом [6], однако при раке молочной железы его значение противоречиво. Как известно, молекулярный подтип рака молочной железы имеет весомое прогностическое значение, в том числе за счет особенностей микроокружения, характерных для каждого из них. Исследования с использованием ингибитора FAP, конъюгированного с технецием-99m ([99mTc]Tc-iFAP), указывают на то, что экспрессия FAP значимо коррелирует с определенными молекулярными подтипами РМЖ. Так, была выявлена сильная положительная корреляция между значениями накопления препарата в первичной опухоли и их молекулярными подтипами [7]. Авторы исследования особенно отметили, что подтипы HER2⁺ и люминальный B HER2⁺ демонстрировали наивысшие соотношения накопления, что предполагает более выраженную экспрессию FAP, связанную со столь агрессивными фенотипами. Связь экспрессии FAP c клиническими параметрами подтверждается и в другой работе, авторы которой обнаружили, что экспрессия FAP локализуется в строме опухоли и может быть гетерогенной в зависимости от различных характеристик опухоли, однако различия доли клеток с экспрессией FAP между молекулярными подтипами не достигали уровня статистической значимости [8]. Есть сообщение, что определенные субпопуляции ОАФ, обогащенные экспрессией FAP, связаны с подтипом тройного негативного РМЖ [9]. Последующие исследования подтвердили, что фибробласты при РМЖ представляют собой гетерогенную популяцию. Было показано, что люминальный А-подтип характеризовался большим количеством кластеров, содержащих ОАФ, секретирующих цитокины, в том числе TGFβ, а также ОАФ, ассоциированных с внеклеточным матриксом. Напротив, в подтипах Lum B и HER2⁺ и триплнегативном обнаруживались кластеры, содержащие АФО, ассоциированные с заживлением ран [10]. При люминальном РМЖ более высокие уровни FAP были ассоциированы с отдаленными рецидивами [11]. Тем не менее на сегодняшний день нет прямых данных сравнения транскриптомного профиля FAP⁺ клеток между подтипами.

В то же время ключевой вопрос о том, в какой степени транскриптомный ландшафт и, как следствие, функциональная программа FAP⁺-клеток варьируют между основными молекулярными подтипами РМЖ остается открытым. Понимание этих подтип-специфичных различий имеет критически важное значение для разработки новых терапевтических стратегий. На сегодняшний день терапия, нацеленная на FAP, представляет собой одно из перспективных направлений в онкологии. Высокая и специфичная экспрессия FAP на стромальных клетках внутри опухоли в сочетании с его практически полным отсутствием в здоровых тканях делает этот белок идеальной мишенью для создания высокоселективных препаратов. Активно разрабатываются и проходят клинические исследования различные терапевтические модальности, нацеленные на FAP, включая CAR-Tклетки, биспецифичные антитела, конъюгаты антител и лекарственных веществ (ADC) и радиофармацевтические препараты, доставляющие цитотоксические агенты непосредственно в строму [6]. Успех этих инновационных подходов напрямую зависит от глубокого понимания биологии мишени. Гетерогенность FAP⁺-клеток среди подтипов РМЖ может приводить к неодинаковой эффективности препаратов, что диктует необходимость их стратификации. В данном исследовании мы провели сравнительный анализ транскриптомных профилей FAP⁺клеток, ассоциированных с люминальным и тройным негативным подтипами РМЖ. Нашей целью было идентифицировать подтип-специфичные сигнальные пути, маркеры и молекулярные особенности этой популяции.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследование были включены образцы тканей, полученные от 15 пациенток. Критерии включения: морфологически подтвержденный люминальный A/B (n = 7) и тройной негативный (n = 8) РМЖ. Критерии исключения: наличие HER2-позитивных подтипов. Для проведения пространственного транскриптомного анализа использовали срезы тканей, полученных в ходе трипан-биопсии или при хирургическом вмешательстве до проведения лечения, фиксированные в формалине и залитых в парафин. Данные секвенирования срезов тканей РМЖ, использованные в данной публикации, доступны в базе данных GEO под номером доступа GSE242311. Подробные описания подготовки гистологических образцов, создания библиотеки и секвенирования с использованием платформы 10X Visium можно найти в оригинальных статьях [12, 13].

Биоинформатический анализ данных

Первичная обработка исходных данных в формате FASTQ была выполнена с использованием программного обеспечения Space Ranger v1.3 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния, США) со стандартными параметрами. Выравнивание файлов FASTQ проводили относительно референсного генома человека (GRCh38). Агрегацию срезов тканей для последующей ручной аннотации выполняли с использованием функции "spaceranger aggr". Ручную аннотацию срезов проводили в программе Loupe Browser v8.1.2 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния, США), и она включала идентификацию регионов с уровнем экспрессии FAP выше 3, которые анализировали отдельно для пациентов с люминальным и трижды негативным раком (рис. 1).

Каждый отобранный регион был оценен врачомпатологоанатомом для подтверждения наличия фибробластов. Регионы, не содержащие фибробласты, вручную исключали из кластера. Анализ дифференциальной экспрессии генов между аннотированными кластерами проводили с использованием встроенных инструментов Loupe Browser v8.1.2 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния, США). Гены с log fold change (LFC) > 0,58 и скорректированными p-значениями (FDR) < 0,05 считали дифференциально экспрессированными. Для визуализации аннотированных клеточных кластеров в пространстве пониженной размерности применяли метод t-SNE с использованием встроенных инструментов Loupe Browser. Анализ обогащения функциональных путей проводили с использованием онлайн-ресурса STRING [14] на основе базы данных Gene Ontology [15] с применением списков дифференциально экспрессированных генов, ранжированных по уровню экспрессии и скорректированным p-значениям (FDR q-value), полученным из анализа дифференциальной экспрессии. Биологические процессы с FDR q-value < 0,05 считали значимыми. Дополнительный анализ выполняли в среде R (https://www.R-project.org/) с использованием пакета Seurat (v5.0.0) [16]. Каждый из 15 образцов был преобразован в объект Seurat с помощью команды "Load10X_Spatial" и затем объединен в единый объект с использованием функции "merge". Предобработка данных включала в себя фильтрацию регионов с параметрами "nCount_Spatial" > 500 и "nFeature_Spatial" > 200. Результаты ручной аннотации, экспортированные из Loupe Browser v8.1.2 в виде таблиц, были включены в раздел метаданных каждого соответствующего образца.

Для генерации усредненных транскриптомных профилей из аннотированных FAP-позитивных регионов для каждого образца использовали функцию "AggregateExpression" из пакета Seurat (v5.0.0) с параметрами slot = "counts", normalization.method = "LogNormalize" и scale.factor = 10 000. В результате было получено 15 транскриптомных профилей, каждый из которых представлял усредненные уровни экспрессии всех регионов соответствующего образца. Эти профили были нормализованы с использованием масштабного фактора 10,000 и подвергнуты логарифмическому преобразованию. Для визуализации экспрессии сигнатур генов фибробластов и радиорезистентности в исследованных образцах были созданы тепловые карты в среде R (https://www.R-project.org/) с использованием пакетов pheatmap (v1.0.13) [17], RColorBrewer (v1.1-3) [18] и dplyr (vX.X.X) [19]. Визуализация тепловых карт включала этап Z-score стандартизации матрицы экспрессии целевых генов по строкам (генам). Данная биоинформатическая обработка позволила провести анализ дифференциальной экспрессии генов в двух группах образцов РМЖ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологические процессы, обогащенные в FAP⁺областях люминальных и тройных негативных опухолей

Для понимания различий в биологических процессах между двумя кластерами люминальных и тройных негативных опухолей мы провели анализ обогащения сигнальных путей (pathway enrichment analysis), чтобы выявить обогащенные молекулярные процессы в транскрипционных данных. Были идентифицированы наиболее значимые пути из наборов данных Gene Ontology (рис. 2).

Проведенное исследование позволило выявить ключевые биологические процессы, активированные в FAP⁺областях у пациентов с люминальным и тройным негативным РМЖ. FAP⁺-области у пациентов с люминальным РМЖ характеризовались активацией процессов морфогенеза (GO:0009887, FDR q-value = 0,00058), развития тканей (GO:0009888, FDR q-value = 0,0013) и организацией внеклеточного матрикса (GO:0030198, FDR q-value = 0,0307), в то время как у пациентов с тройным негативным раком преобладали иммунные сигнальные пути (иммунный ответ (GO:0006955, FDR q-value = 7,85e^-17), ответ на воспаление (GO:0006954, FDR q-value = 2,79e^-11), регуляция продукции цитокинов (GO:0001817, FDR q-value = 3,39e^-10)), а также ангиогенез (GO:0001525, FDR q-value = 7,83e^-08).

Маркеры фибробластов в FAP⁺-областях опухоли

Затем мы отобрали специфичные для фибробластов высокоэкспрессируемые и значимо обогащенные гены в двух группах пациентов с РМЖ. Эти гены были аннотированы как функционально важные в развитии рака (рис. 3).

В образцах люминального подтипа список генов с дифференциальной экспрессией включал ASPN, COL10A1, COL2A1, OMD, DCN, MMP13, SERPINA1/SERPINA3, PLAT, LRRC15, CXCL14, TSPAN8, а в тройных негативных опухолях — MMP7, COL4A1, COL4A2, COL15A1, ENG, TGM2, SLC11A1, CHI3L1, PLA2G2A, FDCSP, CD36.

Сигнатуры генов, связанные с резистентностью к лучевой терапии

Важная особенность FAP⁺-клеток — их радиочувствительность/резистентность, поскольку FAP является перспективным таргетом для радионуклидной терапии. В этой связи мы отобрали среди гиперэкспрессированных генов те, которые патогенетически связаны с радиорезистентностью по данным литературы, в двух группах пациентов с РМЖ (рис. 4).

Так, в люминальном раке была обнаружена экспрессия генов IGF1R, ERBB3, GREB1, XBP1, SERPINA1 / SERPINA3, TIMP3, FASN, IL6ST, BCAM, CRIP1. Тем временем в тройных негативных опухолях были гиперэкспрессированы гены CD36, CX3CL1, A2M, MYBL2, NOTCH4, S100A8 / S100A9, TGM2, UBE2C, FOXM1, ZEB2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенный анализ позволил выявить фундаментальные различия в биологических функциях FAP⁺-клеток в микроокружении люминального и тройного негативного подтипов рака молочной железы. Эти данные не только подчеркивают гетерогенность стромы опухоли, но и имеют важное значение для разработки персонализированных терапевтических стратегий, в частности, для таргетной терапии с использованием FAP в качестве мишени.

Ключевым результатом нашего исследования является четкое разделение роли стромальных FAP⁺клеток в зависимости от молекулярного подтипа опухоли. В люминальном РМЖ FAP⁺-клетки демонстрируют выраженную активность процессов морфогенеза, развития тканей и организации внеклеточного матрикса и отсутствие экспрессии генов, ответственных за развитие воспалительных реакций. Это согласуется с идентифицированными генами, маркерами фибробластов, такими как COL10A1, COL2A1, MMP13, CXCL14 и TSPAN8. В частности, высокая экспрессия MMP13 в FAP⁺-клетках указывает на активное ремоделирование матрикса [20]. Среди обнаруженных генов необходимо отметить ассоциированные с химиорезистентностью РМЖ. Так, экспрессия CXCL14 по данным механистических исследований является отличительным признаком фибробластов, усиливающих метастазирование и поддерживающих химиорезистентность [21], как и TSPAN8, экспрессируемого миофибробластами [22]. Такая стромальная ниша, вероятно, обеспечивает структурную поддержку опухоли, способствует ее прогрессии и резистентности к терапии, создавая жесткое десмопластическое микроокружение.

В тройном негативном РМЖ FAP⁺-клетки, напротив, проявляют ярко выраженный иммуномодулирующий и провоспалительный фенотип. Обогащение сигнальных путей, связанных с иммунным ответом и регуляцией цитокинов, а также гиперэкспрессия генов CHI3L1, CD36 и PLA2G2A, свидетельствует об активном взаимодействии с иммунными клетками микроокружения. Известно, что CD36⁺-фибробласты обладают мощным иммуносупрессорным эффектом [23] за счет подавления макрофагов, в то время как PLA2G2A⁺-фибробласты препятствуют эффектам CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов [24]. Показано, что фибробласты могут секретировать CHI3L1, что приводит к повышению IL8 и стимулирует ангиогенез [25]. Все это может способствовать формированию иммуносупрессивной среды, уклонению опухоли от иммунного надзора и поддержанию хронического воспаления. Таким образом, полученные данные указывают на ceщественные различия в молекулярных сигнатурах опухоль-ассоциированных фибробластов опухолей различных молекулярно-биологических подтипов.

Понимание радиочувствительности FAP⁺-клеток критически важно для разработки методов FAP-таргетной радионуклидной терапии. Наши данные выявили потенциальные предпосылки для функционирования различных механизмов радиорезистентности в двух подтипах. В люминальном подтипе выявленные гены указывают на активацию путей выживания и репарации. IGF1R и ERBB3 — известные рецепторные тирозинкиназы, опосредующие радиорезистентность при злокачественных новообразованиях [26, 27]. Показано, что ген SERPINA1 ассоциирован с радиорезистентностью при раке легкого [28], а ингибирование FASN улучшает результаты радиотерапии при раке молочной железы [29]. Еще один ген, CRIP1, способен взаимодействовать с BRCA2, усиливая репарацию ДНК на фоне химиотерапии [30]. Это позволяет предположить, что радиорезистентность в данном подтипе может опосредоваться через усиление репарации ДНК.

В тройном негативном раке профиль генов радиорезистентности более широк и связан с эпителиальномезенхимальным переходом (ЭМП) и стволовостью. ZEB2 и NOTCH4 — ключевые индукторы ЭМП, ассоциированного

с устойчивостью к терапии [31–33]. FOXM1 и UBE2C регулируют клеточный цикл и митоз, способствуя быстрому восстановлению популяции опухолевых клеток [34, 35]. Кроме того, усиленная репарация ДНК, зависимая от FoxO3a/FoxM1, может играть ключевую роль в сохранении устойчивых к гибели фибробластов после облучения [36]. TGM2 также связан с устойчивостью к радиотерапии [37]. Это указывает на то, что в тройном негативном РМЖ резистентность может быть связана с наличием популяции стволово-подобных опухолевых клеток с мезенхимными свойствами.

Наше исследование демонстрирует, что FAP⁺фибробласты не являются однотипной популяцией, а функционально адаптируются к специфике молекулярного подтипа. В люминальном РМЖ они выступают как архитекторы стромы, в то время как в тройном негативном РМЖ — как иммунные регуляторы и промоторы ангиогенеза.

Выявление различных наборов генов, ассоциированных с радиорезистентностью, но не ограниченные ею, позволяет предположить, что можно ожидать случаи резистентности при FAP-таргетной радионуклидной терапии и заранее разрабатывать стратегии для ее преодоления.

ВЫВОДЫ

Исследование позволило обнаружить высокоспецифичные транскриптомные портреты FAP⁺-стромы люминального и тройного негативного молекулярных подтипов РМЖ. Полученные данные подчеркивают необходимость учета молекулярного подтипа опухоли при разработке строманаправленной терапии и открывают новые возможности для создания персонализированных комбинированных методов лечения, нацеленных на специфические механизмы устойчивости в микроокружении опухоли.