Системная склеродермия (ССД) — системное аутоиммунное заболевание, характеризующееся васкулопатией, последующим прогрессирующим фиброзом кожи и внутренних органов [1] и высокой смертностью: 25% пациентов погибают в первые 5 лет после постановки диагноза, 37,5% — в первые 10 лет [2–5]. Средняя продолжительность жизни пациентов с ССД на 16–34 года меньше среднестатистической [4]. Распространенность заболевания варьируется от 38 до 341 на миллион человек в год, а частота возникновения новых случаев заболевания колеблется от 8 до 56 человек на миллион в год по данным разных стран [6–11]. Наиболее частой причиной смерти при ССД является поражение внутренних органов — легких, сердца, желудочно-кишечного тракта [4, 5]. Помимо данных проявлений, течение заболевания у 35% пациентов осложнено развитием дигитальных язв, которые в свою очередь часто приводят к гангрене вплоть до ампутации пальцев, что определяет тяжелую функциональную недостаточность у таких пациентов [12–13].

Несмотря на то что заболевание мультисистемно, поражение кожи является его отличительной особенностью и определяет клинико-прогностическую стратификацию. По степени распространенности кожного процесса ССД подразделяют на диффузную форму (дСС) и лимитированную форму (лСС), которые различаются скоростью прогрессирования, особенностями течения и прогнозом [1].

Молекулярные механизмы, которые приводят к развитию ССД, до конца не изучены, что затрудняет подбор таргетной терапии для таких пациентов. В настоящее время выбор потенциальных опций для лечения крайне ограничен, что диктует необходимость поиска новых. Несмотря на то что Т-клеточные ответы типа Th2 и Th17 могут играть важную роль в патогенезе ССД [15, 16], показано, что активация интерфероновых путей, особенно типа I, имеет более выраженную ассоциацию с ССД, чем другие типы иммунного ответа [17, 18].

Последние исследования показывают схожую экспрессию генов, вовлеченных в интерфероновый каскад, у пациентов с системной красной волчанкой и ССД [19–21]. Для ревматоидного артрита, синдрома Шегрена и полимиазита также характерна повышенная экспрессия IFN-ассоциированных генов [23–29].

Активация пути IFN-I и соответственно «интерфероновая» генная сигнатура наблюдаются у значительной части пациентов с ССД уже на ранних стадиях в крови и коже и, по некоторым данным, ассоциируются с тяжестью поражения (в том числе легких и кожи) [30, 31]. Вывод о зависимости между уровнями экспрессии IFN-индуцированных генов с тяжестью заболевания, опровергается исследованиями [28, 32].

Актуальные рекомендации EULAR (обновление 2023) отражают смещение к таргетным подходам при ССД, что повышает значение валидируемых биомаркеров стратификации [33]. Эти наблюдения поднимают вопрос о потенциальной эффективности блокирования интерферон-опосредованных путей у части больных ССД.

Цель данной работы — провести оценку уровня экспрессии интерферон-зависимых генов у пациентов с ССД в клетках периферической крови и в поврежденных участках кожи для оценки потенциальной возможности стратификации пациентов и прогноза перспективной, но не одобренной в настоящее время терапии антителами к рецепторам интерферона при ССД [34]. Тестировали гипотезу, что IFN-I-сигнатура у пациентов с ССД может отражаться в периферической крови, анализ которой может стать альтернативой повторным биопсиям кожи для стратификации и мониторинга пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследование были включены пациенты в возрасте 21–77 лет с системной склеродермией с лимитированной или диффузной формой заболевания, поступившие в ревматологическое отделение ГБУЗ МКНИЦ Больница 52” ДЗМ с апреля 2023 по февраль 2025 г., соответствующие критериям ACR/EULAR2013 [35].

Критерии включения: наличие антинуклеарного фактора в крови пациентов, определенное методом непрямой иммунофлюоресценции. При обнаружении антинуклеарного фактора, проводилось исследование спектра ядерных антител методом иммуноблотинга (табл. 1).

Критерии исключения: наличие иных системных аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита, идиопатических воспалительных миопатий, системной красной волчанки); наличие признаков инфекционных заболеваний (по внешним признакам).

Из исследования не исключали пациентов при отсутствии каких-либо конкретных антител или отрицательном результате иммуноблота, так как: 

1. для постановки диагноза ССД, согласно критериям ACR/EULAR, наличие конкретных антител не является облигатным критерием для постановки диагноза [35];
2. для ССД также характерны антитела к РНКполимеразе III, которые не определяют в РФ; кроме того, ССД может быть ассоциирована с антителами вне анализируемого спектра.

Скрининговое определение антинуклеарных антител проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) на полуавтоматическом ИФА-анализаторе Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific Inc., США) при помощи набора реагентов ANA-Screen ELISA IgG (Euroimmun AG, Германия) согласно инструкции производителя. Подтверждающее определение антинуклеарных антител проводили методом иммунного блота при помощи набора реагентов ANA profile 1 IgG (Euroimmun AG, Германия) согласно инструкции производителя.

Проведены клинико-иммунологическая оценка пациентов, включая оценку активности заболевания согласно EScSG (табл. 1) [36], оценка капилляроскопического паттерна на момент осмотра, лабораторная оценка на наличие специфических антител. Все пациенты были обследованы на наличие/отсутствие поражения возможных органов мишеней: кожи (проведен кожный счет по Rodnan), суставов (оценено число болезненных и припухших суставов), легких (всем пациентам была выполнена мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) органов грудной клетки (ОГК)), сердца и легочной артерии (проведены электрокардиография, ЭХО-кардиография, катетеризация желудочно-кишечного тракта у одного пациента (проведена рентгеноскопия пищевода с барием)).

Отбор и обработка биологического материала, выделение РНК

Сбор образцов осуществляли в клинике в рамках общего обследования пациентов при поступлении в больницу. Всего в исследование было включено 48 пациентов с ССД. У 25 пациентов в качестве биологического материала для исследования были взяты только образцы периферической крови. Еще для 10 пациентов были также получены препараты пораженного участка кожи и образцы периферической крови, а для 13 пациентов были взяты только образцы пораженного участка кожи. Образцы биопсии кожи брали из предплечья, из места наибольшего уплотнения кожи, методом инцизионной биопсии.

В качестве образцов сравнения использовали образцы здоровой кожи трех доноров без диагноза ССД, а также образцы периферической венозной крови 31 здорового донора в возрасте 20–54 лет. 20% когорты здоровых доноров составляли мужчины.

Образцы пораженной кожи пациентов диаметром 4 мм помещали в протективный раствор для тканей (MACS® Tissue Storage Solution, Miltenyi, США) на +4 °С и передавали в лабораторию для выделения РНК. Полученные образцы измельчали в жидком азоте с одновременным добавлением лизирующего буфера RLT. Выделение РНК проводили с помощью набора реагентов HiPure Total RNA Kit (Magen, Китай) согласно инструкции производителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 3.0 и набора реагентов (Thermo Fisher Scientific, США).

Образцы крови (4 мл) забирали в пробирки с добавленной в качестве антикоагулянта калиевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. Цельную кровь после забора и до выделения мононуклеаров хранили при 4 °С. Выделение мононуклеаров периферической крови проводили методом седиментации в растворе фиколла плотностью 1,077 («ПанЭко», РФ). Полученную фракцию клеток помещали в лизирующий буфер RLT (Qiagen, Германия) и в таком виде хранили при температуре –80 °С до момента выделения тотальной РНК. Выделение тотальной РНК проводили с помощью набора HiPure Total RNA Kit (Magen, Китай) согласно инструкции производителя.

Концентрацию РНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 3.0 (США) и набора реагентов (Thermo Fisher Scientific, США). Качество выделенного препарата РНК оценивали с помощью метода гель-электрофореза в агарозном геле. Выделенную РНК замораживали и хранили при температуре –80 °С до момента постановки обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени.

Постановка ОТ-ПЦР и анализ данных

Количественную ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) в одной пробирке проводили с использованием набора реагентов One-Tube RT-PCR TaqMan («Евроген», Россия) [37]. Набор представляет собой мастер-микс, содержащий реакционный буфер для ОТ и ПЦР, нуклеотидтрифосфаты и Taq ДНК-полимеразу с «горячим стартом». На первом этапе, когда происходит синтез первой цепи кДНК, Taq-полимеразу инактивировали моноклональными антителами; прогрев при 95 °C перед ПЦР обеспечивает быстрый «горячий старт». Модифицированную MMLVревертазу добавляли в реакционную смесь отдельно. Праймеры, служащие одновременно затравкой для синтеза первой цепи кДНК и для последующей ПЦРамплификации, добавляли в реакцию в концентрации 0,4 мкМ. Визуализацию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием флуоресцентных проб типа TaqMan. Пробы добавляли в реакцию в концентрации 0,1 мкМ. Все олигонуклеотиды, специфичные к исследуемым и референсным генам, подбирали таким образом, чтобы оптимум их работы обеспечивался применением одного универсального ОТ-ПЦР протокола.

Обратная транскрипция: 55 °C, 15 мин, один цикл, без считывания флуоресценции. Затем проводили инактивацию ревертазы/активацию полимеразы: 95 °C, 1 мин, один цикл, без считывания. Далее 40 циклов амплификации: денатурация — 95 °C, 15 с (без считывания); отжиг — 60 °C, 20 с (со считыванием флуоресценции); элонгация — 72 °C, 20 с (без считывания).

Для анализа интерфероновой сигнатуры оценивали уровень экспрессии IFIT1, IFIT3, IFI27, IFI44, ISG15, XAF1, ранее протестированной на образцах периферической крови пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) и референсного гена TBP [29, 31].

Для анализа интерфероновой сигнатуры оценивали уровень экспрессии IFIT1, IFIT3, IFI27, IFI44, ISG15, XAF1 и референсного гена TBP. По той же методике оценивали экспрессию гена-маркера SFRP4, признанного в качестве маркера, ассоциированного с прогрессированием фиброза при склеродермии [22].

Относительный уровень экспрессии интерферонзависимых генов оценивали с использованием нормирования на экспрессию гена «домашнего хозяйства» TBP.

Относительную экспрессию определяли методом ΔΔCt с нормированием по референсному гену, амплифицируемому в той же ПЦР. Относительный уровень экспрессии исследуемого гена определяли исходя из эффективности его амплификации и разности пороговых циклов (Ct) исследуемого гена по сравнению с референсным.

Статистическая обработка данных

Для статистической обработки результатов использовали непараметрические методы, пригодные для малых выборок данных.

Для сравнения уровня экспрессии генов между образцами доноров из экспериментальной (пациенты с ССД) и контрольной групп использовали тест Манна–Уитни. Для сравнения значений экспрессии генов в образцах кожи и крови статистическую значимость разницы выборок оценивали с использованием парного критерия Уилкоксона. Все значения p-value были дополнительно скорректированы с помощью поправки на множественное сравнение Бенджамини– Хохберга. Для оценки корреляции между показателями использовали коэффициент корреляции Спирмена.

Значение IFN-I-сигнатуры считали как среднее из стандартизированных оценок (z-score) относительного уровня экспрессии пяти генов (IFIT3, IFI27, IFI44, ISG15, XAF1). Стандартизированные оценки корреляции усредненной IFN-I-сигнатуры между кровью и кожей вычисляли относительно распределения значений внутри группы пациентов, для которых были получены парные образцы крови и кожи.

Стандартизированные оценки значений IFN-I-сигнатуры в образцах периферической крови вычисляли относительно распределения значений в группе здоровых доноров — отдельно для образцов крови и кожи.

Рассчитывали средние значения и стандартное отклонение (табл. 2 и табл. 3). Однако в связи с ограниченной применимостью данных показателей для малых выборок (с недоказанной гипотезой о нормальном распределении значений) приведены также расчеты медианы и межквартильного расстояния.

Стандартное отклонение для бинарных клинических признаков рассчитывали для распределения Бернулли.

Всю работу с таблицами, корректировку данных, построение графиков и применение статистических тестов проводили с помощью встроенных функций языка R и дополнительных библиотек к нему: tidyverse, ggplot2 и corrplot.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены 48 пациентов с ССД, преимущественно женщины (90%), средний возраст 61 год, длительность болезни 13,5 лет, в основном с хроническим течением (84%) и лимитированной формой болезни (62,5%). Ведущее органное поражение — интерстициальное заболевание легких (56%, главным образом NSIP); часто встречалось поражение пищевода (71%) и суставов (58%). Кожная активность в среднем низкая (mRSS 7), феномен Рейно диагностирован почти у всех (98%), дигитальные язвы — у 31%. Результаты клинико-иммунологического обследования пациентов с ССД представлены в табл. 1.

Для интегральной оценки IFN-I-сигнатуры использовали модификацию тест-системы из пяти генов: IFI27, XAF1, IFI44, IFIT3, ISG15, с использованием одного рефренсного гена вместо двух, ранее протестированной на образцах периферической крови пациентов с СКВ [32, 38]. В качестве гена-маркера заболевания использовали SFRP4 (от англ. secreted frizzled-related protein), уровень экспрессии которого ассоциирован с кожным фиброзом при ССД [22].

Уровень экспрессии для всех пяти анализируемых генов достоверно отличался между группами больных ССД и здоровых доноров для образцов РНК, выделенных из кожи, и для 4 из 5 анализируемых генов (за исключением IFI27), между группами больных ССД и здоровых доноров для образцов крови (рис. 1A, Б; табл. 2). Уровень экспрессии SFRP4 был повышен в образцах кожи пациентов с ССД по сравнению с образцами кожи здоровых доноров (рис. 1А).

Сопоставление экспрессии между компартментами, проведенное на парных образцах кровь/кожа (рис. 2; табл. 3), показало, что уровни экспрессии генов XAF1, IFI44, IFIT3, ISG15 в крови пациентов значительно выше, чем в образцах кожи. Экспрессия гена IFI27, напротив, более выражена в коже (рис. 2А, В). Направленность изменений сохранялась в обоих типах материала, что поддерживает эффективность применения как кожных биопсий, так и образцов крови для диагностики и динамического мониторинга (рис. 2Б, Г). Интегральный индекс IFN-I-сигнатуры у пациентов с ССД значительно превышает референсный пороговый интервал, рассчитанный по значениям здоровых доноров, как в образцах периферической крови, так и в биоптатах пораженной кожи (рис. 2Д, Е). Ограничение способа сравнения индекса IFN-I-сигнатуры в коже связано с малым числом образцов здоровых доноров. Интегральный индекс, посчитанный по крови, показал, что у 62% (22 пациента) превышен референсный интервал.

Корреляционный анализ клинических параметров и экспрессии генов (рис. 3; табл. 4) показал, что гены IFN-I-сигнатуры (IFIT3, IFI27, IFI44, ISG15, XAF1) образуют тесно согласованный модуль (Rs — от 0,52 до 0,87; p < 0,05 для кожи) с выраженными положительными межгенными корреляциями, тогда как SFRP4 практически не связан с этим модулем и отражает отдельный, фиброзассоциированный компонент.

В образцах крови гены IFIT3, IFI27, ISG15, XAF1 также образуют корреляционный кластер друг с другом, но с несколько меньшими значениями корреляции (Rs — от 0,38 до 0,63). Ген IFIT27 образует самую тесную связь с ISG15 (Rs = 0,77), однако выпадает из общего кластера корреляций (Rs  c IFIT3, IFI27, ISG15, XAF1 < 0,15).

Клинические признаки «тяжести» заболевания (активность по EScSG, прогрессия, диффузная форма) заметно коррелируют между собой.

Гены IFN-I-сигнатуры показывают незначительную корреляцию с диффузной формой заболевания: в образцах кожи Rs составляет от 0,23 до 0,34, в образцах кожи небольшая корреляция наблюдается только для ISG15 и IFIT27 (0,21 и 0,27 соответственно). Возраст слабоотрицательно ассоциирован с уровнем экспрессии IFN-I-индуцированных генов (Rs — от –0,32 до –0,36) в образцах кожи, для крови связи незначительны (от 0 до –0,13). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Определение уровня экспрессии IFN-I-стимулированных генов с помощью метода ПЦР в последнее время все чаще применяют в клинических исследованиях. Разработаны различные диагностические тест-системы для анализа экспрессии IFN-сигнатуры. Наиболее часто в рамках определения IFN-сигнатуры выявляют уровень экспрессии генов IFI44L, IFI44, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, SIGLEC1, IFI35 [39]. Российскими учеными также предложены решения в этом направлении [40, 41]. В частности, одна из систем включает анализ трех генов (RIG-1, IFIT-1, IFIH-1). Однако подход к нормализации экспрессии в этих панелях представляется неоптимальным: в первой в качестве референсного гена используют HPRT, но не описывают нормировку по ΔCt, а во второй в качестве референсного гена предлагается использовать GAPDH, что может приводить к артефактам из-за наличия многочисленных псевдогенов в геноме человека. В данной работе мы использовали интегральную оценку IFN-I-сигнатуры с помощью тест-системы из пяти генов: IFI27, XAF1, IFI44, IFIT3, ISG15 с нормированием на один референсный ген. Ранее эти гены по отдельности и в виде тест-системы были протестированы нами на образцах периферической крови пациентов с СКВ [32, 38].

Согласно проведенному исследованию, у пациентов с ССД, по сравнению со здоровыми донорами, отмечено повышение экспрессии интерферон-индуцированных генов как в образцах кожи, так и в образцах периферической крови. Эти данные подтверждают вовлеченность интерферонов I типа в патогенез заболевания и согласуются с ранее опубликованными результатами по ССД [17, 21, 30]. По результатам нашего анализа уровень экспрессии IFN-I-индуцированных генов имеет тенденцию к корреляции в образцах крови и пораженных участков кожи. Подобная закономерность ранее была продемонстрирована на большей когорте пациентов с ССД с использованием транскриптомного профилирования (microarray). Было показано, что экспрессия IFN-ассоциированных генов в коже согласуется с аналогичными изменениями в периферической крови [42]. Эти и другие наблюдения указывают на информативность оценки IFN-I-сигнатуры в образцах крови пациентов с ССД [18].

Клинические признаки тяжести заболевания (активность по EScSG, прогрессия, диффузная форма) заметно коррелируют между собой, но демонстрируют лишь слабые и неоднородные связи с IFN-I-сигнатурой. Таким образом, применимость разработанной тестсистемы для стратификации пациентов и прогноза успешности терапии ингибиторами рецептора IFN-I следует оценивать независимо от тяжести и формы заболевания.

В связи с тем что уровень оцениваемой IFN-I-сигнатуры у некоторых пациентов с ССД находится в зоне значений, близких к контролю (рис. 2), и не выявлена корреляция между экспрессией генов и тяжестью заболевания (рис. 3), можно предположить у пациентов с ССД наличие различных иммунологических паттернов, кроме паттерна активации интерферона I типа (по аналогии с описанными в [26] паттернами при СКВ). Наличие у пациентов с ССД как значимо более высоких, так и низких (на уровнях контрольной группы) уровней экспрессии IFN-индуцированных генов может свидетельствовать о необходимости стратификации пациентов для прогноза эффекта от терапии антителами к рецептору интерферона.

С учетом текущих клинических исследований ингибитора рецептора IFN-I при ССД (DAISY; NCT05631227) [37] повышенное значение IFN-I-сигнатуры потенциально может служить критерием отбора пациентов и инструментом мониторинга эффективности ответа на терапию блокатором рецепторов интерферона (анифролумаб). Схожесть сигнальных путей для ССД и СКВ, связанных с интерфероном [14, 23, 42], а также имеющиеся данные об эффективности анифролумаба при СКВ [43], позволяют предположить, что использование данного препарата при ССД тоже может быть высокоэффективным для пациентов, имеющих высокие значения интерфероновой сигнатуры.

ВЫВОДЫ

У пациентов с ССД, по сравнению со здоровыми донорами, отмечено повышение экспрессии интерферониндуцированных генов как в образцах кожи, так и в образцах периферической крови, что указывает на вовлеченность интерферонов I типа в патогенез ССД. Уровень экспрессии IFN-I-индуцированных генов имеет тенденцию к корреляции в образцах крови и пораженных участках кожи. Разработанная RT-qPCR-панель, включающая IFN-I-индуцируемых гены (IFI27, IFI44, IFIT3, ISG15, XAF1) обладает потенциалом для стратификации пациентов с ССД, а также для оценки эффективности таргетной терапии блокаторами рецепторов интерферона (в случае одобрения данной терапии для ССД). Для проверки данного вывода требуется проведение дополнительного исследования корреляции между снижением уровня интерфероновой подписи и улучшения состояния пациентов с ССД при терапии антителами к рецептору интерферона. Для анализа интерфероновой сигнатуры методом RT-PCR c использованием предложенных генов можно рекомендовать использование периферической крови пациентов с ССД, так как данный биоматериал более доступен, менее инвазивен и более воспроизводим при потенциально сопоставимой информативности с образцами кожи.