Статья размещена в открытом доступе и распространяется на условиях лицензии Creative Commons Attribution (CC BY).
МЕТОД
Детекция Salmonella enterica петлевой изотермальной амплификацией ДНК с использованием флуоресцентно меченого петлевого праймера
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
2 Детская городская клиническая больница № 9 им. Г. Н. Сперанского, Москва, Россия
3 Институт трансляционной медицины и биотехнологий, Сеченовский университет, Москва, Россия
Для корреспонденции: Максим Леонидович Филипенко
ул. Проспект Лаврентьева, д. 8, г. Новосибирск, 630090, Россия; moc.liamg@oknepiliflm
Финансирование: исследование поддержано в рамках государственного задания ИХБФМ СО РАН № 125012300671-8.
Вклад авторов: Д. В. Шамовская, М. А. Смертина, Е. А. Храпов — оптимизация и валидация LAMP на клинических образцах; М. А. Гордукова, Е. В. Галеева — сбор клинических образцов и данных пациентов; И. П. Оскорбин — планирование экспериментов LAMP; У. А. Боярских — дизайн праймеров LAMP; М. Л. Филипенко — идея исследования, написание и редактирование статьи.
Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом ИХБФМ СО РАН (протокол № 4 от 25 мая 2022 г.), этическим комитетом при ГБУЗ «ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского ДЗМ» (протокол № 44 от 19 апреля 2022 г.). Пациенты подписали добровольное информированное согласие.
Сальмонеллез остается одной из ведущих причин бактериальных кишечных инфекций человека и животных. Молекулярная диагностика радикально трансформировала диагностический ландшафт сальмонеллезной инфекции, однако остается времени- и ресурсозатратной. Изотермическая амплификация ДНК, например, петлевая изотермальная амплификация (LAMP), выполняемая при постоянной температуре, является основой разработки быстрых диагностических тестов, которые могут быть адаптированы к формату point-of-care (PoC) и выполнены в условиях ограниченных ресурсов и вдали от централизованных лабораторий. Целью исследования было разработать и валидировать новый метод детекции Salmonella enterica в образцах кала человека методом LAMP, в котором мониторинг результатов амплификации достигается с помощью петлевого флуоресцентномеченного праймера, несущего также внутренний гаситель флуоресценции. Предложенный метод имеет предел обнаружения (LoD 95%) 250 копий на реакцию, чувствительность 86,84% (95% ДИ: 71,91–95,59%) и специфичность — 96,49% (95% ДИ: 87,89–99,57%) относительно qPCR, а также показал большую устойчивость к ингибиторам амплификации ДНК в образцах фекалий. Введение разных флуоресцентных меток в петлевые праймеры для FLP-LAMP с разными мишенями потенциально обеспечивает возможность мультиплексирования и одновременного выявления нескольких патогенов, что увеличивает диагностические возможности изотермальной амплификации.
Ключевые слова: флуоресцентный зонд, LAMP, Salmonella enterica, петлевой флуоресцентный праймер, аналитическая валидация, ингибиторы ДНК