Сальмонеллез — одна из наиболее распространенных антропозоонозных инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями рода Salmonella, преимущественно подвидом enterica [1]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно регистрируется 93–200 млн случаев сальмонеллеза, провоцирующего острый гастроэнтерит, около 155 000 случаев заканчиваются летальным исходом по всему миру [2]. Таким образом, сальмонеллез является серьезной проблемой общественного здравоохранения в развитых и развивающихся странах.

Диагностика сальмонеллеза подразумевает анализ эпидемиологических и эпизоотологических данных, клинических признаков и патоморфологических изменений, на основании которых можно поставить предварительный диагноз. Окончательно диагноз ставят на основании лабораторных диагностических методов. Прижизненная диагностика сальмонеллеза предполагает использование серологических, молекулярно-генетических и микробиологических методов.

На сегодняшний день в клинической практике для выявления сальмонеллеза «золотым стандартом» является микробиологический способ, а именно бактериологический посев отобранного у пациента материала на селективные питательные среды (например, среду Раппапорта–Василиадиса) [3]. Основные недостатки метода — длительность анализа (48–96 ч), ограничивающая своевременное назначение специфической терапии, а также низкая чувствительность метода при применении антибиотиков пациентом до сбора образца. Микробиологические исследования требуют специализированного помещения, оборудования, высококвалифицированного персонала, обладают низкой производительностью, не позволяя проводить массовый скрининг и эпидемиологический мониторинг.

К экспресс-методам диагностики можно отнести использование аллель-специфичной риал-тайм ПЦР, ИФА (иммуноферментный анализ). Метод количественной АС-ПЦР позволяет существенно сократить время диагностики (до 2–4 ч) и повысить аналитическую чувствительность до 1–10 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл) [4]. Мишени для АС-ПЦР — гены invA, ttr, bcfD и другие консервативные последовательности, специфичные для Salmonella [5]. Однако применение метода ограничено во многих регионах из-за дорогостоящего оборудования (термоциклер реального времени), недостаточной квалификации персонала в КДЛ и довольно высокой стоимости анализа.

Решением для PoC-диагностики (point-of-care diagnostics) стали методы изотермальной амплификации, в частности LAMP (loop-mediated isothermal amplification), разработанная Notomi et al. Диагностика методом LAMP позволяет проводить амплификацию ДНК при постоянной температуре 60–65 °C без необходимости циклического изменения температуры, что свойственно PCR. Для анализа используют термостабильную ДНК-полимеразу (например, большой фрагмент ДНК-полимеразы I из Geobacillus stearothermophilus) и высокоспецифичный набор из четырех (реже шести) праймеров, распознающих шесть (или восемь) различных участков целевой ДНК. Это обеспечивает исключительно высокую специфичность амплификации целевого участка ДНК [6]. LAMP обладает рядом преимуществ перед PCR/qPCR: высокую специфичность благодаря использованию шести специфичных последовательностей вместо двух; быстроту (20–30 мин); высокую устойчивость к ингибиторам амплификации, содержащимся в клинических образцах; отсутствие необходимости в дорогостоящем оборудовании [7]. Различные модификации LAMP активно применяют в разработке «бесприборных» тестов или интегрируют в портативные устройства формата point-of-care для использования в полевых условиях [8].

Для визуализации и мониторинга результатов LAMP предложены различные методы [9]: турбидиметрия, основанная на регистрации помутнения реакционной смеси при образовании магний-пирофосфатного осадка; колориметрические тесты, использующие изменение цвета красителей (pH-зависимые, pH-индикаторы) при изменении концентрации пирофосфата и pH реакционной среды; интеркалирующие флуоресцентные красители (SYTO, SYBR GreenI и др.), которые встраиваются в двухцепочечную ДНК и генерируют флуоресцентный сигнал; различные модификации олигонуклеотидов и их комплексов, несущих флуоресцентные метки (праймерызонды, молекулярные маячки, гибридизационные зонды).

Последний подход, а именно использование модифицированных флуоресцентно меченых олигонуклеотидов, представляет наибольший интерес, так как имеет потенциал для мультиплексирования и одновременного выявления нескольких мишеней или контрольных локусов в одной реакции благодаря применению нескольких флуоресцентных зондов с разными типами красителей (FAM, HEX, ROX, Cy5) [8]. Несмотря на это, использование петлевых флуоресцентно меченых праймеров с внутренним гасителем в LAMP остается малоизученным направлением.

Целью настоящей работы было разработать и валидировать новый метод генерации флуоресцентного сигнала при проведении LAMP с использованием петлевого флуоресцентно меченого праймера, несущего также внутренний гаситель флуоресценции (quencher), на модели диагностической амплификации фрагмента гена bcfD Salmonella enterica. Предполагалось, что применение петлевых праймеров-зондов обеспечит надежный мониторинг амплификации в реальном времени, сопоставимый с методом интеркалирующих красителей, при этом открывая возможности для будущего мультиплексирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка контрольного материала

Фрагмент гена bcfD размером 211 нуклеотидов (NC_003197, Salmonella enterica subsp. Enterica) амплифицировали на геномной ДНК Salmonella с использованием праймеров bcfD-F3 и bcfD-B3 и клонировали в вектор с помощью набора Quick-TA («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. Структуру плазмидных клонов подтверждали секвенированием по Сэнгеру с использованием набора BigDye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, США) на генетическом анализаторе ABI 3730 (Applied Biosystems, США) в лаборатории молекулярной диагностики ИХБФМ СО РАН.

Контрольную плазмиду (pBCFD) линеаризовали рестриктазой BamHI и измеряли концентрацию с помощью набора Spectra Q BR («Сесана», Россия). Линеаризованную плазмиду разводили серийно в диапазоне 10⁰–10⁶ копий в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), РНК дрожжей 2,5 мкг/мл и 0,01% NaN₃. Количество копий в разведениях определяли методом цифровой ПЦР (ddPCR) на системе QX200™ Droplet Digital™ PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, США) согласно инструкции производителя с праймерами Slm1 и Slm2 (600 нМ) и флуоресцентно меченым зондом Slm-PF (200 нМ).

LAMP

Стандартные LAMP-реакции объемом 20 мкл содержали: 1× буфер для полимеразы Gss-Sto (40 мМ Tris-HCl pH 8,9; 10 мМ (NH₄)₂SO₄; 10 мМ KCl; 8 мМ MgSO₄; 2,5% DMSO; 0,1% Triton X-100), 1,5 мМ каждого dNTP, 0,4 мкМ внешних праймеров (F3/B3), 0,3 мкМ петлевых праймеров (LF/LB), 1,6 мкМ внутренних праймеров (FIP/BIP), матрицу ДНК и три единицы полимеразы Gss-Sto (ИХБФМ СО РАН). Для мониторинга флуоресценции использовали либо флуоресцентно меченые петлевые праймеры (SLB-LB1F, SLB-LB2F, SLF-LB1H), либо интеркалирующий краситель SYTO-13 в концентрации 0,5 мкМ. LAMP-реакции проводили в термоциклере CFX96 Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, США) по следующей программе: 120 циклов амплификации при 60 °C с регистрацией флуоресценции в канале HEX/FAM каждые 15-30 с. Для контроля специфичности применяли электрофорез в 1,8%-м агарозном геле для проверки характерного рисунка LAMPампликонов или их отсутствия в отрицательном контроле (данные не приведены). Результаты амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold) — времени до пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, установленной на уровне среднего значения + три стандартных отклонения от отрицательного контроля.

ПЦР в режиме реального времени (qPCR)

ПЦР-реакции объемом 20 мкл содержали: 1× ПЦР-буфер (64 мМ Tris-HCl pH 8,9; 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 0,05% Tween-20; 3 мМ MgCl₂; 0,002% NaN₃), 0,6 мкМ праймеров (прямой и обратный) и 0,15 мкМ флуоресцентно меченого зонда (табл. 1), 2 единицы Taq-полимеразы (СибЭнзим, Россия) и матрицу ДНК. Программа включала: активацию Taqполимеразы при 96 °C в течение 15 мин; далее 45 циклов: денатурация при 95 °C (10 с); отжиг и удлинение при 60 °C (40 с) с регистрацией флуоресценции в каналах FAM и Cy5. Результаты обрабатывали в программе CFX Manager (Bio-Rad).

Оценка предела обнаружения (LoD), клинической чувствительности и специфичности

Предел обнаружения (LoD 95%) оценивали путем варьирования концентрации контрольной плазмиды: 65, 125, 250, 500 и 1000 копий на реакцию, с 20 техническими повторами для каждой концентрации. LoD95% определяли как концентрацию ДНК, при которой позитивная реакция (Tt отрицательного контроля — Tt образца > 10 мин) наблюдалась в ≥ 95% технических реплик.

Клиническую чувствительность и специфичность теста оценивали на 95 образцах ДНК из кала детей, собранных в ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского. В качестве «золотого» стандарта использовали qPCR, направленную на ген bcfD. Образцы считали положительными по qPCR, если значение Cq (cycle quantification) было менее 34, что соответствовало установленному для этой системы LoD 95% ≤ 12,5 копий на реакцию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн и оптимизация петлевого флуоресцентно меченого праймера

Разработка метода визуализации результатов LAMP с использованием флуоресцентно меченых петлевых праймеров была основана на ранее опубликованной и хорошо охарактеризованной системе олигонуклеотидных праймеров для LAMP, специфичных к фрагменту гена bcfD. Мы применили концепцию, проверенную в Taqman зондах, которые генерируют флуоресцентный сигнал не за счет ферментативного гидролиза, а за счет гибридизации [10]. В свободном состоянии Taqman зонд образует трехмерную структуру, сближающую флуорофор и гаситель флуоресценции (quencher), что приводит к гашению флуоресцентного сигнала (FRETэффект). При гибридизации зонда с комплементарной последовательностью мишени зонд становится линейным, расстояние между флуорофором и гасителем увеличивается, что приводит к восстановлению флуоресценции.

На основе этого принципа мы синтезировали серию петлевых флуоресцентно-меченных праймеров-зондов для LAMP (табл. 1). Каждый олигонуклеотид содержал: 1) флуорофор (FAM или HEX) на 5′-конце; 2) свободный для элонгации 3'-конец; 3) внутренний гаситель BHQ1, введенный через остаток тимина (T-BHQ1), расположенный вблизи 3'-конца.

Дизайн проводили на основе структур «классических» петлевых праймеров bcfD-LF и bcfD-LB. Для трех олигонуклеотидов варьировали расстояние между флуорофором и гасителем: на 5'-конец олигонуклеотида SLB-LB1F добавили 5 остатков дезоксиаденозина (5 dA), а на 5'-конец SLF-LB1H — 5 остатков дезокситимидина (5 dT) для увеличения дистанции FRET-пары. Третий вариант (SLB-LB2F) содержал флуорофор, помещенный непосредственно на нативный 5′-конец олигонуклеотида без удлинения.

Сравнение различных петлевых флуоресцентных праймеров-зондов

При замене классического петлевого праймера (LF или LB) на флуоресцентно меченый петлевой праймер-зонд (в концентрации 0,3 мкМ) в LAMP-реакции с матрицей pBCFD (3000 копий на реакцию) генерировалась четкая кривая нарастания флуоресценции, зависящая от типа синтезированного олигонуклеотида (рис. 1). Все три варианта петлевых праймеров-зондов демонстрировали способность к генерации флуоресцентного сигнала при встраивании в растущий ампликон. 

Значения амплитуды разгорания флуоресцентного сигнала были схожими при использовании различных флуоресцентно меченых петлевых праймеров-зондов, однако олигонуклеотид с удлиненной дистанцией между флуорофором и гасителем (SLB-LB1F) демонстрировал большую амплитуду сигнала (~35–40% от базовой флуоресценции), хотя разница кажется незначительной. Как и ожидалось, при использовании интеркалирующего красителя SYTO-13 значение Tt (время до пересечения порога) было существенно меньше (~9–10 мин) по сравнению с петлевыми флуоресцентно мечеными праймерами-зондами (~16–19 мин), что объясняется большим количеством молекул красителя, связывающихся с ампликоном.

Увеличение концентрации петлевого флуоресцентно меченого праймера-зонда SLF-LB1H с 0,3 до 0,6 мкМ не влияло существенно на параметр Tt, но существенно улучшало амплитуду разгорания флуоресцентного сигнала с ~10–15% до 15–35% от базовой флуоресценции смеси до амплификации (рис. 2). Дальнейшее увеличение концентрации не приводило к заметному увеличению амплитуды, поэтому оптимальной концентрацией была принята 0,6 мкМ для всех последующих экспериментов. Далее для экспериментов использовали петлевой праймер-зонд SLF-LB1H в концентрации 150 нМ.

Определение предела обнаружения

Предел обнаружения (LoD95%) является ключевым аналитическим параметром, определяющим минимальное количество целевой ДНК, которое можно надежно выявить с использованием диагностического теста. Мы оценили LoD для обеих систем визуализации, титруя ДНК-матрицу в диапазоне 65, 125, 250, 500 и 1000 копий на реакцию. Для каждой концентрации проводили 20 технических повторов.

Для системы bcfD-LAMP-SLF-LB1H LoD 95% составил 250 копий/реакция (19 из 20 повторов позитивны, Tt = 20,67 ± 2,60 мин). Для сравнения, при использовании интеркалирующего красителя SYTO-13 LoD был несколько ниже: 125 копий/реакция (20 из 20 повторов, Tt = 17,78 ± 2,07 мин), что соответствует примерно двукратному различию в чувствительности между двумя методами визуализации.

Критическим параметром проведения диагностического LAMP является его продолжительность, так как время амплификации строго ограничено риском образования побочных продуктов в отрицательных контролях (NTC, no template control). Слишком длительная инкубация повышает риск ложноположительных результатов и, как следствие, неправильной клинической интерпретации. Учитывая, что нарастание флуоресценции в отрицательных контролях не наблюдалось до 60 мин и более, а наибольшее значение Tt для позитивных образцов при концентрации матрицы, равной LoD95%, не превышало 25 мин для bcfD-LAMP-SLFLB1H, продолжительность проведения диагностического LAMP была установлена в 30 мин.

Тестирование на клинических образцах

Для определения клинической чувствительности и специфичности метода bcfD-LAMP-SLF-LB1H анализировали 95 образцов ДНК из кала детей. В качестве золотого стандарта использовали qPCR, также направленную на ген bcfD с установленным ранее LoD 95% ≤ 12,5 копий/реакция (Cq ~ 34). Образцы считали положительными по qPCR, если Cq был менее 34.

Клиническая чувствительность LAMP-SLF-LB1H составила 86,84% (95% ДИ: 71,91–95,59%), а специфичность 96,49% (95% ДИ: 87,89–99,57%) (табл. 2 и табл. 3). Для сравнения, при использовании интеркалирующего красителя SYTO-13 чувствительность была выше (94,74%), но специфичность существенно не отличалась. Коэффициент каппа Коэна, статистический показатель согласованности между двумя классификационными системами, составил 0,844 (95% ДИ: 0,734–0,955) для LAMP-SLF-LB1H в сравнении с qPCR, что соответствует «хорошей» согласованности. Для LAMP-SYTO13 коэффициент каппа был выше: 0,912 (95% ДИ: 0,828–0,996), что указывает на «хорошую» согласованность.

Анализ дискордантных результатов и устойчивость к ингибиторам

Основной причиной несовпадения результатов между LAMP-SLF-LB1H и qPCR явилось различие в их LoD: у метода с петлевыми флуоресцентно мечеными праймерами он выше (т. е. чувствительность ниже), чем у qPCR. Анализ дискордантных образцов (положительные по qPCR, отрицательные по LAMP) показал, что их Cq находился в диапазоне 31–33, близком к пороговому значению 34. Возможно, что эти образцы содержали погранично низкие количества целевой ДНК.

Для изучения причин дискордантности два образца, позитивных по LAMP-SLF-LB1H, но негативных по первичному анализу qPCR, повторно анализировали на qPCR после пятикратного разбавления образцов ДНК. Разбавление применяют для снижения концентрации ингибиторов амплификации, которые могут присутствовать в образцах кала. После разбавления оба образца давали позитивный результат с пограничными значениями Cq (32–33), что дополнительно свидетельствует о большей устойчивости LAMP-SLF-LB1H к ингибиторам амплификации ДНК, содержащимся в фекальных образцах. Этот результат согласуется с известным свойством LAMP проявлять повышенную устойчивость к различным ингибиторам, включая гемоглобин, билирубин, гемоцидин и другие компоненты кала.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Интерес к методам изотермической амплификации, таким как LAMP, неуклонно растет в связи с их потенциалом для децентрализованной диагностики. К настоящему времени предложено несколько подходов генерации флуоресцентного сигнала в LAMP с использованием различных модифицированных олигонуклеотидов [11]. К ним относятся: молекулярные маячки (molecular beacons), гибридизирующиеся с ампликоном и изменяющие конформацию; гибридизирующиеся зонды (TaqManlike probes), функционирующие на основе гибридизации без расщепления; интеркалирующие красители (SYBR Green, SYTO), выстраивающиеся в двухцепочечную ДНК; флуоресцентные нуклеотиды (FL-dNTPs), встраиваемые непосредственно в ампликон при синтезе.

В нашем исследовании мы разработали и оценили LAMPтест с флуоресцентной детекцией сигнала, использующий петлевые флуоресцентно меченые праймеры-зонды, которые непосредственно встраиваются в растущий ампликон. Принципиальное преимущество этого подхода состоит в том, что каждая молекула встроенного в ампликон праймера-зонда генерирует флуоресцентный сигнал, пропорциональный количеству образовавшегося продукта. При встраивании петлевого флуоресцентно меченого праймера в конкатемеры ампликона олигонуклеотид становится линейным, значительно увеличивается расстояние между флуорофором (5'-конец) и гасителем (T-BHQ1), что приводит к восстановлению флуоресценции. Увеличение расстояния между флуорофором и гасителем путем добавления дополнительных нуклеотидов (5 dA или 5 dT) обеспечивает повышение амплитуды флуоресцентного сигнала, хотя эффект был умеренным.

Наиболее близким аналогом нашей системы является FLOS-LAMP (fluorescence of loop primer upon selfdequenching) [12, 13]. В данном подходе флуоресцентный краситель вводится внутрь 3’-области петлевого праймера в определенном нуклеотидном контексте, что вызывает его гашение в несвязанном состоянии, а при включении в двойную спираль ампликона увеличение флуоресценции. Надо отметить, что наш вариант дизайна праймера значительно проще.

На контрольных образцах с известной концентрацией ДНК LAMP-SLF-LB1H продемонстрировал LoD95% 250 копий/реакция, что в два раза выше, чем у LAMPSYTO13 (125 копий/реакция). Это различие ожидаемо, так как с ампликоном связывается гораздо больше молекул интеркалирующего красителя и генерирует больший флуоресцентный сигнал. Тем не менее, LoD95% 250 копий/ реакция для LAMP-SLF-LB1H остается приемлемым для клинической диагностики, так как типичные нагрузки Salmonella в образцах кала пациентов с острым гастроэнтеритом значительно превышают эту величину [14]. Более того, дальнейшая более тщательная оптимизация условий амплификации может обеспечить увеличение чувствительности и сокращения времени теста. На панели из 95 клинических образцов ДНК из кала LAMP-SLF-LB1H достигал чувствительности 86,84% и специфичности 96,49% при сравнении с qPCR как золотым стандартом. Дискордантные результаты (n = 5 образцов, позитивных по qPCR, но негативных по LAMP-SLF-LB1H) содержали ДНК с Cq 31–33, граничащими с порогом позитивности (Cq = 34), что объясняет различие в результатах и отражает просто разницу в чувствительности двух методов. Интересно, что два образца, которые были позитивны по LAMP-SLFLB1H, но первично негативны по qPCR, дали позитивный результат при повторном анализе после разбавления, что свидетельствует о наличии ингибиторов амплификации. Изотермическая амплификация, включая LAMP, известна своей повышенной устойчивостью к различным ингибиторам амплификации ДНК, присутствующим в клинических образцах [7]. Также ДНК-полимераза Gss-Sto, содержащая ДНК-связывающий домен, проявляет большую толерантность к ингибиторам по сравнению с нативными ферментами [15]. Наблюдение о большей резистентности к ингибиторам LAMP-SLF-LB1H по сравнению с qPCR согласуется с литературой и имеет практическое значение для клинического применения, так как позволяет снизить требования к подготовке образцов и использовать менее трудоемкие протоколы экстракции ДНК. Безусловно, это должно быть показано более тщательно на большей выборке.

Потенциальное преимущество использования петлевых флуоресцентно меченых праймеров состоит в возможности применения праймеров с различными флуорофорами (FAM, HEX, ROX, Cy5) для одновременного выявления нескольких мишеней в одной LAMP-реакции. Это особенно важно для диагностики смешанных инфекций или для разработки панельных тестов, выявляющих несколько возбудителей (например, Salmonella, Shigella, Vibrio). Потенциальная мультиплексная LAMP-система с флуоресцентными петлевыми праймерами может стать основой для разработки надежной point-of-care диагностической платформы для быстрого выявления множественных патогенов [16, 17].

Следует отметить несколько ограничений настоящего исследования. Это относительно небольшой размер клинической панели для надежной валидации диагностического теста. Кроме того, хотя ген bcfD считается специфичным для Salmonella, необходимо провести перекрестное тестирование на других близкородственных энтеробактериях и кишечных патогенах. Исследование проведено с использованием качественного оборудования (CFX96 Touch, Bio-Rad), что может не отражать реальные условия применения PoC-тестов. К тому же, мы пока намеренно отказались от интенсивной оптимизации теста для оценки устойчивости воспроизведения нашей концепции в рутинных условиях LAMP.

Несмотря на эти ограничения, полученные результаты демонстрируют потенциал петлевых флуоресцентно меченых праймеров как системы визуализации для LAMP. Метод может быть адаптирован к портативным флуоресцентным приборам для использования в PoC-диагностике. Возможность использования различных флуорофоров открывает перспективы для разработки мультиплексных тестов и интеграции в устройства для молекулярной диагностики в условиях ограниченных ресурсов.

ВЫВОДЫ

Нами разработан и валидирован новый дизайн LAMP с использованием петлевого флуоресцентно меченого праймера-зонда, генерирующего флуоресцентный сигнал в режиме реального времени для детекции Salmonella enterica на основе гена bcfD.

Метод обеспечивает приемлемые аналитические характеристики: LoD95% = 250 копий/реакция, чувствительность 86,84% (95% ДИ: 71,91–95,59%) и специфичность 96,49% (95% ДИ: 87,89–99,57%) при сравнении с qPCR. Использование петлевых флуоресцентно меченых праймеров с различными флуорофорами открывает перспективы разработки мультиплексной LAMP для одновременного выявления нескольких патогенов в одной реакции.