Сахарный диабет 2-го типа (СД2) является самой распространенной эндокринной патологией обмена веществ в мире [1]. За последние 20 лет число больных СД в мире увеличилось почти в 4 раза со 151 млн в 2000 г. до 589 млн человек в 2025 г. Более 8,2 млн больных СД2 проживают в Российской Федерации [2].

Известно, что СД2 — один из ведущих факторов риска развития мозгового инсульта и инфаркта миокарда, а также основная причина потери зрения, нетравматических ампутаций и развития терминальных стадий почечной недостаточности [3]. Диабетическая нефропатия (ДНФ) — это клинический синдром, характеризующийся постоянной альбуминурией и прогрессирующим снижением функции почек [4]. Механизмы развития ДНФ очень сложны, и, несмотря на десятилетия интенсивных исследований, патогенез этого осложнения до сих пор полностью не изучен [5–7]. Известно, что многочисленные пути и процессы, такие как окислительный стресс, активация ренин-ангиотензин- альдостероновой системы, митоген-активируемых протеинкиназ, образование конечных продуктов гликозилирования, избыточная продукция факторов роста соединительной ткани и провоспалительных цитокинов способствуют возникновению и прогрессированию поражения почек при СД2 [8].

Недавно проведенные генетические и биохимические исследования у людей и на животных подтвердили необходимость слаженной работы ферментов репарации для выживания клеток в условиях окислительного стресса [9–12]. Избыточная продукция активных форм кислорода на фоне перегрузки нутриентами у пациентов с избыточной массой тела и ожирением способна нанести значительный ущерб любым клеточным макромолекулам, особенно ДНК: подсчитано, что в среднем за 24 ч на одну клетку человеческого организма приходится 10 000 повреждений ДНК, причем окислительное повреждение ДНК превалирует [13]. Структуры всех четырех азотистых оснований ДНК восприимчивы к окислительному повреждению при воздействии активных форм кислорода, при этом идентифицировано более ста различных типов окислительных повреждений оснований, включая продукты с разрывом гетероциклов и образованием окисленных ароматических производных [14–15]. Изменение структуры азотистых оснований в результате окислительного повреждения меняет их способность образовывать водородные связи с основанием-партнером при синтезе комплементарной цепи, что служит основным источником мутаций и причиной нарушения экспрессии генов [16].

В большинстве случаев механизмы репарации ДНК, включая эксцизионную репарацию оснований, эксцизионную репарацию нуклеотидов, прямую реверсивную репарацию, репарацию ошибочных спариваний, гомологичную рекомбинацию, исправляют возникшее повреждение и поддерживают гомеостаз клетки [17]. Эксцизионная репарация оснований наиболее эффективна именно при восстановлении эндогенных окислительных повреждений пуринов или пиримидинов ДНК и протекает с использованием ДНК-гликозилаз, таких как mutY ДНК-гликозилаза MUTYH, nth-подобная ДНК-гликозилаза 1 NTHL1, 8-оксогуанин-ДНК- гликозилаза OGG1 или nei-подобная ДНК-гликозилаза 1 NEIL1, распознающих аберрантное азотистое основание и вырезающих его [18].

Из четырех азотистых оснований ДНК гуанин чаще других подвергается окислению [19]. Фермент 8-оксогуанин- ДНК-гликозилаза OGG1 обладает способностью удалять 8-оксогуанин и 2,6-диамино-4-гидрокси-5-N-метилформамидопиримидин, являясь частью сложной системы репарации окислительных повреждений гуанина в составе ДНК [20–21]. В экспериментальной работе показано снижение эффективности процессов репарации при СД2, что приводит к старению клеток, активации воспаления, и в конечном счете, к фиброзу почек и легких [22]. Генетически детерминированный дефект элиминации аберрантного гуанина у носителей rs1052133 гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы ассоциируется с СД2 у американцев мексиканского происхождения [23] и японцев [24], однако в целом исследования роли генов репарации окислительных повреждений ДНК в развитии СД2 и его осложнений немногочисленны, противоречивы, не имеют системного охвата, выполнены на малых выборках и плохо воспроизводимы в репликативных исследованиях.

Цель настоящего исследования — провести анализ ассоциаций пяти полиморфных вариантов rs2072668, rs1052133, rs293795, rs2304277, rs6443265 гена OGG1 с риском развития ДНФ у пациентов с СД2.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Характеристика обследованных лиц

Исследование выполнено в соответствии с международными рекомендациями STREGA (STrengthening the REporting of Genetic Association Studies) на этнически гомогенной выборке (1461 человек) неродственных жителей Центральной России (преимущественно уроженцев Курской области) славянского происхождения. В исследование включен 1461 пациент с СД2 (486 мужчин и 975 женщин), получавший стационарное лечение в эндокринологическом отделении ОБУЗ Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи. Диагноз СД2 устанавливали на основе критериев ВОЗ [25]. Критерии включения в группу больных: наличие верифицированного врачом диагноза болезни, подтвержденного клиническими и лабораторно- инструментальными методами; возраст старше 35 лет, наличие письменного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения из основной выборки: выраженная степень декомпенсации СД2 или кома; наличие иммуноопосредованного или идиопатического СД 1-го типа; наличие гестационного СД; наличие специфических типов СД, таких как MODY; заболевания экзокринной части поджелудочной железы — панкреатит, травма или панкреатэктомия, опухоли поджелудочной железы; муковисцидоз, гемохроматоз, фиброкалькулезная панкреатопатия; эндокринопатии (акромегалия, синдром Кушинга, глюкагонома, феохромоцитома, гипертиреоз, соматостатинома, альдостерома); наследственные болезни, сочетающиеся с СД (синдром Дауна, атаксия Фридрейха, хорея Гентингтона, синдром Клайнфельтера, синдром Лоренса- Муна-Бидля, миотоническая дистрофия, порфирия, синдром Прадера-Вилли, синдром Тернера); факт манифестации заболевания в возрасте до 35 лет; отсутствие письменного информированного согласия на участие в проекте. У 577 больных СД2 (110 мужчин и 467 женщин) была диагностирована ДНФ. Клинико- лабораторные характеристики участников исследования представлены в табл. 1.

Пациенты с ДНФ имели более высокие значения индекса массы тела, глюкозы крови натощак и более длительный стаж СД2. Cкорость клубочковой фильтрации (СКФ), рассчитанная по формуле CKD-EPI, в этой группе больных была значимо ниже, чем у пациентов с СД2, не страдающих ДНФ (p < 0,0001).

Выделение ДНК и генотипирование

У всех участников исследования проводили забор 5 мл венозной крови натощак в вакуумные пробирки Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Геномную ДНК 1461 образца крови пациентов с СД2 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ выделяли колоночным методом с использованием наборов реагентов Biolabmix (Россия). Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280 = 1,5–2,0.

Отбор однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в гене ДНК-гликозилазы OGG1 проводили с использованием геномного браузера Ensembl (https://www.ensembl.org/index. html) и биоинформатических инструментов веб-сервера SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov/), включая GenePipe, FuncPred и TagSNP, ресурса atSNP (http://atsnp.biostat.wisc. edu/) и на основании оценки гаплотипической структуры гена (отбор tagSNPs, r2 ≥ 0,8), частоты минорного аллеля (MAF > 5%) в европейских популяциях проекта HapMap, параметров, необходимых для наиболее полного охвата вариабельности гена и включения функционально значимых полиморфных локусов, имеющих регуляторный потенциал и способных влиять на связывание транскрипционных факторов и микроРНК, сплайсинг и/или активность белкового продукта гена OGG1. Все пять отобранных вариантов rs2072668, rs1052133, rs293795, rs2304277, rs6443265 влияли на аффинность транскрипционных факторов в соответствующих участках ДНК, rs1052133 и rs293795 расположены в сайтах связывания микроРНК. SNP rs2072668 (C>G) является вариантом сплайсинга полипиримидинового тракта, rs1052133 (C>G) — миссенс- вариант, приводящий к замене серина на цистеин в 326 положении белка, rs293795 (A>G) и rs6443265 (T>C) расположены в интронах гена OGG1, rs2304277 (G>A) — в некодирующем транскрипт экзоне OGG1.

Для дизайна праймеров использовали программу

Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Последовательности аллель-специфичных флуоресцентно- меченых зондов были подобраны на основе нуклеотидной последовательности гена OGG1 (https://www.ensembl.org/ Homo_sapiens/Gene/Sequence?db=core; g = ENSG00000114026; r = 3:9749944-9788219). Праймеры и зонды, представленные в табл. 2, синтезированы компанией «Синтол» (Россия).

Общий объем реакционной смеси составил 14,25 мкл. При этом к 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 («Евроген», Россия; массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера («Биолабмикс», Россия), 0,2 мкл смеси дНТФ («Евроген», Россия; концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы («Биолабмикс», Россия) с горячим стартом (концентрация 5 Ед/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США) при следующем режиме: 10 мин при 95 °С, амплификация 38 циклов, включающая 15 с при 95 °С, 30 с при t = 53 °С и 60 с при подобранной экспериментально температуре отжига, индивидуальной для каждого SNP (табл. 2).

Идентификацию референсного и минорного аллелей изучаемых SNP проводили на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX соответственно. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей. На рисунок представлен пример детекции генотипов по локусу rs2304277 гена OGG1: генотипы rs2304277-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs2304277-G/A — зеленым, генотипы rs2304277-A/A — синим цветом, черным ромбом показан отрицательный контроль.

Концентрации глюкозы, гликированного гемоглобина, креатинина, триглицеридов, общего холестерина и его подфракций определяли наборами фирмы «Диакон-ДС» на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Clima MC-15 (RAL, Испания). Для функционального аннотирования вариантов ДНК использовали онлайн- ресурсы GTEx Portal (https://www.gtexportal.org/home/), atSNP (http://atsnp.biostat.wisc.edu/), Gene Ontology  Resource (https://geneontology.org/), mQTLdb [https://www. mqtldb.org/] и VannoPortal (http://www.mulinlab.org/vportal/ index.html).

Статистическая обработка данных

Анализ ассоциаций изучаемых SNP и гаплотипов с риском ДНФ выполняли методом логистической регрессии с поправкой на пол, возраст и ИМТ с помощью программы SNPStats [26], анализ ассоциаций диплотипов OGG1 с ДНФ, а также расчет количественных показателей проводили с помощью программы STATISTICA v10.0. (StatSoft, США). Ассоциацию считали значимой при p < 0,05. Для проверки нормальности распределения биохимических показателей использовали критерий Колмогорова– Смирнова. Переменные, имеющие нормальное распределение, были описаны с использованием среднего значения и стандартного отклонения. В качестве теста статистической значимости использовали тест Стьюдента. Показатели с ненормальным распределением описывали с использованием медианы (Мedian), первого (Q1) и третьего (Q₃) квартилей, в виде: Мedian [Q₁; Q₃]. В качестве теста статистической значимости в таких случаях применяли критерий Манна–Уитни. Обнаруженные отличия групп считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованные SNP находились в соответствии с равновесием Харди–Вайнберга (p > 0,05). Результаты анализа ассоциаций полиморфных вариантов гена OGG1 с ДНФ представлены в табл. 3. Генотип rs293795-G/G (OR = 1,97, 95% CI = 1,23-3,16, p = 0,007) OGG1 ассоциировался с повышенным риском ДНФ на фоне СД2 независимо от пола, возраста и индекса массы тела пациентов.

На следующем этапе был выполнен анализ ассоциаций парных комбинаций генотипов (диплотипов) OGG1 с предрасположенностью к ДНФ, статистически значимые результаты которого представлены в табл. 4.

Установлено, что носительство генотипа G/G rs293795 ассоциировалось с повышенным риском ДНФ в сочетании с генотипами rs2072668-C/C (OR = 1,68, 95% CI = 1,10–2,56, p = 0,015), rs1052133-C/C (OR = 1,64, 95% CI = 1,07–2,51, p = 0,021), rs2304277-G/G (OR = 1,68, 95% CI = 1,10–2,56, p = 0,015) и rs6443265-C/C (OR = 1,64, 95% CI =1 ,06–2,54, p = 0,025). Гетерозиготный генотип rs293795-A/G также детерминировал риск ДНФ в комбинации с генотипами rs2072668-C/G (OR = 1,48, 95% CI = 1,06–2,08, p = 0,022) и rs1052133-C/G (OR = 1,42, 95% CI = 1,01–1,99, p = 0,043), тогда как сочетание гомозиготного по референсному аллелю генотипа rs293795-A/A с генотипом rs6443265- T/C обладало протективным эффектом в отношении ДНФ: OR = 0,67, 95% CI = 0,49–0,92, p = 0,013 (табл. 4).

Анализ неравновесия по сцеплению (LD) изучаемых локусов гена OGG1 (табл. 5) показал, что rs293795 находился в положительном неравновесии по сцеплению с rs6443265 (D = 0,1561, D` = 0,9541, p < 2 × 10<sup>–16</sup>). В то же время rs293795 находился в отрицательном неравновесии по сцеплению с rs2072668 (D = –0,0514, D`= 0,9990, p < 2 × 10^–16), rs1052133 (D = –0,0512, D` = 0,9989, p < 2 × 10<sup>–16</sup>) и с rs2304277 (D = –0,0406, D` = 0,9982, p < 2 × 10^–16).

Гаплотипический анализ гена OGG1 позволил выявить пять частых гаплотипов (табл. 6). Гаплотип Н2 rs2072668C-rs1052133C-rs293795G-rs2304277G-rs6443265C, имеющий в своем составе минорный аллель rs293795-G, ассоциировался с повышенным риском ДНФ: OR = 1,30, 95% CI = 1,06–1,60, p = 0,012.

Кроме того, были установлены 12 редких гаплотипов OGG1 с частотой менее 1%: Н6 CCGGT, Н7 GGAGC, Н8 GGAAC, Н9 GCAAT, Н10 CGAGC, Н11 CCGAT, Н12 GCAGT, Н13 CGAAT, Н14 GGGGT, Н15 CCGAC, Н16 CCAAC и Н17 CGGAC, которые (графа «редкие» в табл. 6) на риск ДНФ при СД2 не влияли (p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Восстановление окисленных азотистых оснований ДНК в первую очередь осуществляется посредством пути эксцизионной репарации оснований [18]. Из-за разнообразия размеров и форм повреждений ДНК, вызванных окислительным стрессом, для поддержания геномной стабильности и борьбы с различными модификациями оснований развился разнообразный набор ДНК-гликозилаз. На основе их структурных характеристик ДНК-гликозилазы делят на четыре суперсемейства:
1) урацил-ДНК-гликозилазы (UDG, SMUG1, TDG);
2) гликозилазы спираль-шпилька-спираль (HhH) — NTHL1, OGG1 и MUTYH;
3) 3-метил-пуриновые гликозилазы (MPG);
4) гликозилазы, подобные эндонуклеазе VIII (NEIL) — NEIL1, NEIL2 и NEIL3 [27].

Фермент OGG1 относится ко второму семейству, является β-элиминирующей бифункциональной ДНК- гликозилазой, поскольку обладает и гликозилазной, и лиазной активностью и отвечает за удаление окисленной формой гуанина 8-оксо-7,8-дигидро-2′-дезоксигуанозина (8-oxoG) [28]. Образующийся в результате апуриновый (AP) сайт распознается AP-эндонуклеазой APEX1, инициирующей репарацию путем расщепления сахарофосфатного остова. ДНК-полимераза бета POLB заполняет пробел и, образуя комплекс с белком XRCC1 и ДНК-лигазой 3 LIG3, вставляет нужное комплементарное основание в AP-сайт [9].

Нарушения описанного процесса репарации усугубляют метаболические нарушения, развивающиеся при окислительном стрессе в условиях хронической гипергликемии и способствуют гибели клеток. Так, при иммуногистохимическом исследовании аутопсийного материала поджелудочной железы пациентов с СД2 выявлено, что снижение объемной плотности бета- клеток значимо коррелировало именно с маркерами окислительного повреждения ДНК — 8-oxodG и фосфорилированным по 139-му остатку серина гистоном γH2AX, тогда как ассоциации с маркерами стресса эндоплазматического ретикулума C/EBP-β и нарушения аутофагии P62 отсутствовали [29–30]. Опасность накопления 8-oxoG состоит в том, что он может образовывать пару с цитозином аналогично гуанину, в то время как вращение вокруг его N-гликозидной связи делает возможным образование пары с аденином [31]. Стабильность син-конформации 8-oxoG в дуплексной ДНК приводит к увеличению трансверсионных мутаций G:C → T:A во время последующих раундов репликации. Другое окислительное повреждение гуанина, а именно 2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиримидин (FapyG), возникает в результате фрагментации имидазольного кольца пурина и чаще, чем 8-oxoG, приводит к трансверсии G:C → T:A [32–33]. Обращает на себя внимание факт влияния проокислительного статуса клетки на экспрессию ДНК-гликозилаз: перекись водорода снижает экспрессию OGG1, тогда как N-ацетилцистеин снижает количество продукта окисления 8-oxodG и увеличивает экспрессию фермента OGG1 [34–36].

Согласно клиническим и экспериментальным исследованиям, loss-of-function однонуклеотидные варианты гена OGG1 связаны со снижением генетической стабильности и высоким риском канцерогенеза [21]. В частности, rs1052133 ассоциируется с предрасположенностью к хроническому миелоидному лейкозу [37], rs1052133 и rs2072668 — к раку молочной железы [38–39], rs2304277 — к раку яичников [40]. Полиморфный вариант rs1052133 гена OGG1 ассоциируется с СД2 у американцев мексиканского происхождения [23] и японцев [24]. Дефицит OGG1 у мышей приводит к ожирению, жировому гепатозу, нарушенной толерантности к глюкозе и метаболической дисфункции [41].

Нам не удалось найти данные о вовлеченности rs2072668, rs293795, rs2304277, rs6443265 OGG1 в развитие сахарного диабета и его осложнений в литературе. Выполненное нами исследование установило ассоциации генотипа rs293795-G/G, семи диплотипов rs293795-G/G × rs2072668-C/C, rs293795-G/G × rs1052133-C/C, rs293795- G/G × rs2304277-G/G, rs293795-G/G × rs6443265- C/C, rs293795-A/G × rs2072668-C/G, rs293795-A/G × rs1052133-C/G, rs293795-A/A × rs6443265-T/C и гаплотипа rs2072668C-rs1052133C-rs293795G-rs2304277G-rs6443265C гена OGG1 с предрасположенностью к ДНФ на фоне СД2. Повышенный риск ДНФ был связан с носительством минорного аллеля rs293795-G, который по данным трансриптомного анализа GTEx Portal ассоциируется со снижением экспрессии гена OGG1 (https://www.gtexportal.org/home/). Анализ аффинности транскрипционных факторов в участках SNP (http:// atsnp.biostat.wisc.edu/) показал, что аллель G rs293795 формирует сайты связывания для 25 белков: BCL (p = 0,0021), BHLHE40 (p = 0,0045), CACBP (p = 0,0014), CHD2 (p < 0,0001), E2F1 (p = 0,0046), EGR (p = 0,0018), EGR1 (p = 0,0088), ELF1 (p = 0,0012), MAZ (p = 0,0081), MEIS1 (p = 0,0055), MYC (p = 0,0000029), NFE2 (p < 0,0001), PLAG1 (p = 0,0006), RAD21 (p = 0,0068), REST (p < 0,0001), SREBF (p = 0,002), TATA (p = 0,0077), TBX20 (p = 0,0069), TFAP2 (p = 0,0091), TLX1:NFIC (p = 0,0061), WT1 (p = 0,0021), YY1 (p = 0,0032), ZNF219 (p = 0,00043), ZNF740 (p = 0,0056), ZNF784 (p = 0,0026). Общие термины генных онтологий перечисленных транскрипционных факторов (The Gene Ontology Resource https://geneontology.org/) — регуляция пролиферации мезангиальных клеток метанефральных клубочков (p = 8,97 × 10^–7), положительная регуляция пролиферации клеток, участвующих в развитии почек (p = 3,22 × 10^–5), и отрицательная регуляция экспрессии генов посредством метилирования CpG-островков (p = 1,07 × 10^–4). Ассоциация аллеля rs293795-G с гиперметилированием CpG-островков гена OGG1 (т. е. с низкой транскрипционной активностью гена) у взрослых установлена и в метиломном анализе, результаты которого депонированы в онлайн- базе mQTLdb [42].

По данным проекта VannoPortal (http://www.mulinlab.org/ vportal/index.html) в ткани почек rs293795 служит маркером модификации гистона H3K36me3, участвующей в ответе на повреждения ДНК и сохраняющей репрессивный статус хроматина независимо от ацетилирования гистонов [43]. Другая важная роль H3K36me3 в экспрессии генов заключается в регуляции сплайсинга РНК [44], для чего H3K36me3 образует адаптерную систему с геном MRG15, привлекая таким образом белок, связывающий полипиримидиновый тракт регулятора сплайсинга PTB [45].

ВЫВОДЫ

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о вовлеченности полиморфизма гена репарации окислительных повреждений ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы в развитие диабетической нефропатии у пациентов с СД2. Данные функционального аннотирования ассоциированного с повышенным риском ДНФ полиморфного варианта rs293795 в совокупности указывают на специфичное для ткани почек снижение функции фермента OGG1 у носителей минорного аллеля rs293795-G, что в условиях повышенной нагрузки на систему репарации при гипергликемии и окислительном стрессе может способствовать классическим структурным и функциональным повреждениям сосудов и клубочков, характерным для ДНФ. Проведение дальнейших исследований, в том числе на «животных» моделях СД2, позволит дать системную оценку роли генов ДНК-гликозилаз в инициации и прогрессировании диабетической болезни почек и сформировать тем самым более глубокое понимание патогенеза этого микрососудистого осложнения сахарного диабета.