По некоторым данным, выкидыши в первом триместре чаще всего являются следствием естественного отбора, число эмбрионов с хромосомными аномалиями достигает 60–80% [1]. У пациенток с привычным невынашиванием структурные аномалии кариотипа встречаются в 10 раз чаще, чем в популяции, и составляют 2,4%. В стандартный набор кариотипирования эмбриона входит определение синдрома Дауна, Патау, Эдвардса, Тернера, Клайнфелтера. При наличии в анамнезе у пациентов более двух самопроизвольных абортов проводят медикогенетическое консультирование, которое включает цитогенетическое исследование супругов с объяснениями, что найдено в гениалогии и цитогенетике, оценку степени риска для последующих рождений ребенка с аномалиями развития, разъяснения о необходимости пренатальной диагностики (в том числе исследование хориона), а в тяжелых случаях использование донорских клеток. Во всех случаях мертворождения необходимы цитогенетическое исследование эмбриона, хориона, определение транслокаций у родителей.

Отбор хорионических ворсин в пренатальном тесте, который включает взятие образца ткани из плаценты для кариотипирования и выявления специфических генетических или биохимических отклонений у нерожденного ребенка, используют наиболее часто в акушерской практике [2]. Согласно анализу транскриптома, 65% (n = 13 074) всех белков человека (n = 20 090) экспрессируются в плаценте, и 288 из этих генов показывают повышенную экспрессию в плаценте по сравнению с другими типами тканей. В отличие от традиционных биохимических подходов, в которые отслеживают один или несколько конкретных белков, протеомика, в частности LC-MS/MS, является эффективным методом для распознавания измененной экспрессии белков, а также белков, участвующих в патогенезе заболеваний. В последние годы достигнуты большие успехи в массспектрометрической идентификации дифференциально регулируемых белков, биомаркеров, модификации белков и полиморфизмов в различных тканях человека и так называемых «отсутствующих белков» [3].

Отсутствующий белок — это неподтвержденная генетическая последовательность, для которой белок еще не обнаружен [4]. Согласно международному проекту Human Proteome Project (HUPO), в настоящее время имеется 1343 отсутствующих белка без аннотированной функции, предсказанной биоинформатическим анализом или экспериментально изученной. Сложность обнаружения отсутствующих белков может быть связана не только с их низкой распространенностью во многих тканях, но и с их экспрессией только в нескольких типах клеток в человеческом организме.

Рибосомные гены кодируют рибосомные РНК (18S, 28S и 5,8S рРНК), входящие в состав белоксинтезирующих органелл цитоплазмы — рибосом, и собраны в рибосомном повторе (рДНК), представленном в геномах эукариот большим числом копий. Количество повторов рДНК в диплоидных геномах человека варьирует в пределах 200–711 копий [5]. Кластеры тандемных повторов рДНК разного размера локализованы в коротких плечах пяти пар акроцентрических хромосом и формируют ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом. Количество копий рДНК у человека (параметр R) задается комбинацией пяти пар родительских акроцентрических хромосом. Все копии рДНК в клетке делятся на потенциально активные и неактивные. Как правило, количество активных копий рДНК пропорционально количеству неактивных копий и составляет примерно 30–40% от общего числа копий. Чем больше в геноме копий рДНК, тем больше и активных копий, которые транскрибируются и обеспечивают нужное количество рРНК для биогенеза рибосом [6].

Ранее было показано, что уровень биогенеза рибосом, который зависит от числа копий рДНК в геноме, может влиять на процессы зачатия и течения беременности. Анализ доли нежизнеспособных зигот в выборках супружеских пар с нормальной плодовитостью, с бесплодием и с невынашиванием показал, что зиготические потери в выборке здоровых пар значимо ниже, чем в выборках с репродуктивными нарушениями. Следовательно, зиготический отбор по геномной дозе активных копий рДНК может быть в числе факторов, определяющих репродуктивные нарушения у некоторых пар. Иными словами, очень низкое и очень высокое содержание рДНК в геноме эмбриона потенциально может препятствовать нормальному процессу эмбриогенеза [7]. Другое исследование показало, что при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) успешность процедуры зависит от общего числа копий рДНК в геноме женщины [8]. Женщины с низким количеством копий рДНК имели меньшие шансы для наступления беременности при процедуре ЭКО. Одна из гипотез, объясняющая этот факт, предполагала, что женщины с низким числом копий рДНК передают эмбриону более низкое их число, которого недостаточно для успешного эмбриогенеза.

Таким образом, уровень и наличие либо отсутствие специфических протеом в хорионе должны соответствовать определенному количеству различных форм ДНК в составе внеклеточной ДНК.

Цель исследования — идентифицировать малораспространенные белки и определить рДНК в геноме матери и плода в процессе эмбриогенеза.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с мая по июль 2023 г. на базе ГБУЗ Центр планирования семьи и репродукции ДЗМ выполнено сплошное проспективное исследование пациенток с невынашиванием. Исключали наблюдения, в которых не удалось получить все три биологические среды за первые 3 ч. Критерии включения: неразвивающаяся беременность неясного генеза; тератогенный эффект; прерывание беременности (аборт) по собственному желанию. Критерии исключения: другие акушерские осложнения.

В исследование вошли 45 пациенток, которые были разделены на три группы. 25 (группа I) пациенток были госпитализированы по поводу неразвивающейся беременности сроком 5–13 недель. У пяти из них была зарегистрирована анэмбриония, у остальных 20 — неразвивающаяся беременность неясного генеза, кроме того у этих пациенток при УЗИ обнаружено несоответствие антропометрических данных мертвых эмбрионов с гестационным возрастом (в малых сроках отсутствовало сердцебиение, а при сроках свыше 7 недель выявлено снижение копчико-теменного размера на 3–5 недель). У пяти пациенток (группа II) было проведено прерывание беременности после консультации с генетиком и проведения консилиума по медицинским показаниям (тератогенные эффекты) на сроке 13–21 неделя. Контрольной группой (группа III) служили 15 здоровых пациенток, у которых не было проблем с репродуктивной функцией, сделавших искусственное прерывание беременности по собственному желанию (артифициальный аборт) на сроке 8–11 недель.

У всех обследуемых в процессе операции отбирали ткань хориона и/или эмбриона (образец Э) и ткань децидуальной оболочки (образец Д). Кроме того, перед операцией у женщин брали кровь из кубитальной вены (образец К).

Белки хориона пациенток при замершей беременности и после артифициальных абортов исследовали с помощью тандемной масс-спектрометрии с электроспрейной ионизацией (LC-MS/MS), как описано ранее [9]. Пробоподготовка ворсин хориона для последующего протеомного анализа включала экстракцию белков с помощью лизирующего буфера на основе 2% SDS (додецилсульфат натрия), обработку ультразвуком, процедуру 1DE-гель концентрирования для удаления SDS [9]. Содержание белка в экстрактах ворсин хориона определяли с помощью бицинхониновой кислоты в качестве стандарта [10].

Восстановление, алкилирование с йодацетамидом и триптический гидролиз в геле проводили, как описано ранее [11]. Смесь пептидов анализировали с использованием хроматографической системы Ultimate 3000 nanoflow HPLC (Dionex, США), интегрированной с массспектрометром Orbitrap Q Exactive HF (Thermo Scientific, США) и с источником электростатической ионизации

Nanospray Flex ion source (Thermo Scientific, США) [9].

Масс-спектры в формате «.raw» конвертировали в соответствующие mgf-файлы с помощью программы ProteoWizard MS Convert v. 3.0.6867 (http://proteowizard. sourceforge.net). Файлы были импортированы в платформу SearchGUI (v. 3.3.17) [12] и проанализированы с помощью поисковых алгоритмов X!Tandem и MS-GF+ по базе данных SwissProt (v. 2.22.2022, формат FASTA) для вида Homo sapiens. Поиск проводили по базе данных инвертированных и случайных последовательностей аминокислот (decoy). Интегратор PeptideShaker [13] использовали для получения файлов электронных таблиц Excel с результатами идентификации белков.

Для определения относительного содержания белков, идентифицированных в хорионе, использовали нормированный спектральный количественный фактор NSAF, обладающий высокой воспроизводимостью [14].

Из образцов К, Э и Д выделяли ДНК методом экстракции органическими растворителями. Раствор, содержащий 0,04 M ЭДТА, 2% лаурилсаркозилата натрия и 150 мкг/мл РНКазы A (Sigma, США), добавляли к образцам на 45 мин при 37 °C, обрабатывали протеиназой K (200 мкг/мл, Promega, США) в течение 24 ч при 37 °C, экстрагировали равными объемами смеси фенол/ хлороформ/изоамиловый спирт (25 : 24 : 1), фенола и смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24 : 1). ДНК осаждали добавлением 1/10 объема 3 M ацетата натрия (pH 5,2) и 2,5 объемов ледяного этилового спирта. Фенол стабилизировали 8-гидроксихинолином. ДНК собирали путем центрифугирования при 10 000 G в течение 15 мин при 4 °C, промывали 70%-м этанолом (об./об.), высушивали и растворяли в воде.

Определение копийности рибосомных генов: в ДНК определяли число копий рДНК методом нерадиоактивной количественной гибридизации NQH [5]. Для выявления рДНК человека (образец GenBank № U13369) использовали смесь зондов к рДНК олиго(18S) биотин-CTGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC и олиго (28S) биотин-TATCGGTCTCGTGCCGGTATTTAGCCTTAG.

Денатурированную ДНК наносили на фильтр (Optitran BA-S85, GE Healthcare, США) в количестве 4–6 точек на каждый образец. Стандартные образцы геномной ДНК (50 нг/мл) с известным содержанием рДНК наносили на тот же фильтр, чтобы построить калибровочную кривую зависимости интенсивности сигнала от числа копий рДНК. ДНК фага лямбда (50 нг/мл) также наносили на тот же фильтр, чтобы контролировать уровень шума. Затем фильтр прогревали при 80 °C в вакууме в течение 1,5 ч. После завершения гибридизации мембранный фильтр обрабатывали конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой (Sigma, США) и помещали в раствор субстратов для щелочной фосфатазы (бромхлор-индолил-фосфат/нитро-блю-тетразолиум, BCIP/NBТ). Затем фильтр промывали водой, высушивали в темноте и сканировали. Для количественного определения рДНК использовали программу «Imager 6», позволяющую вычислять интегральную интенсивность сигнала от каждой точки. Сигналы от всех точек, соответствующих одному и тому же образцу, суммировали и вычисляли среднее арифметическое и среднеквадратическую ошибку каждого образца.

Принципы расчета размера выборки не применяли. Методы статистического анализа данных: описательная статистика для количественных переменных представлена в формате среднего, медиан и разброса значений. Сравнение выборок попарно проводили с помощью рангового критерия Манна–Уитни (U-критерий) (р). Этот критерий наиболее соответствует нашей задаче, в связи с небольшим размером выборок в исследовании, при этом критерий допустимо применять при сравнении двух групп при наличии в каждой не менее трех разных значений признака. Для расчета применили программу StatPlus2007 (http://www.analystsoft.com/). Различия признавали статистически значимыми при p < 0,05. При прогнозировании замершей беременности у пациенток использовали количество копий рДНК в геноме эмбрионов. В связи с тем что размер выборки был ограничен, наши результаты носят предварительный и описательный характер.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бесплодие стало глобальной проблемой здравоохранения: число людей, страдающих от этого заболевания, растет с каждым годом. Процедура ЭКО открывает большие перспективы для лечения бесплодия. Однако регуляция раннего эмбрионального развития сложна, и в ней происходит ряд процессов, в том числе переход от матери к зиготе. Раннее эмбриональное развитие человека могут осложнять геномные ошибки, возникающие после оплодотворения. Ядерные аномалии, встречающиеся у эмбрионов человека, особенно полученных в результате ЭКО, связаны с повреждением ДНК, анеуплоидией и снижением потенциала развития. Во время раннего эмбрионального развития транскрипция и экспрессия определенных генов в зародыше претерпевают ряд изменений [15].

Сравнительный протеомный анализ

Многокопийные гены, кодирующие рРНК рибосом (рДНК), определяют биогенез рибосом, а значит, и уровень биосинтеза белка в организме, особенно на ранних стадиях эмбрионального развития [16, 17]. Сравнительный протеомный анализ может дать новое представление о биологических путях, лежащих в основе патогенеза самопроизвольного выкидыша. Поэтому на первом этапе исследования методом панорамной масс-спектрометрии нами была проведена оценка изменений белкового профиля хориона человека при замершей беременности. Среди идентифицированных белков были выявлены гликопротеины, специфичные для беременности (PSG; табл. 1). PSG человека представляют собой группу молекул, почти исключительно экспрессируемых плацентарными трофобластами (ворсинами хориона) во время беременности. Десять кодирующих белок и тесно связанных генов PSG человека (PSG1–PSG9 и PSG11) образуют подгруппу семейства генов карциноэмбриональных антигенов CEA [18] (https://www. proteinatlas.org/humanproteome/tissue/placenta), важного опухолевого маркера для колоректальных и некоторых других карцином [19]. Нам удалось идентифицировать всех членов подгруппы семейства СЕА (табл. 1). Кроме того, при замершей беременности обнаружено заметное снижение содержания (оцененное по значениям NSAF) таких гликопротеинов, как PSG3 и PSG2, гликопротеины PSG7 и PSG4 не были детектированы в ткани хориона. Снижение PSG7 во время пренатального развития может приводить к потере беременности [20, 21]. Таким

образом, наши данные о том, что низкие уровни PSG связаны с плохими исходами беременности, согласуются с результатами других авторов [18].

Кроме того, в образцах хориона после абортов выявлена альфа-L-фукозидаза, которая играет важную роль в адгезии клеток во время прикрепления и отсоединения плодных оболочек [22]. Мы также обнаружили снижение экспрессии белка ретикулона-4 (RTN4) при гибели эмбрионов, который участвует в процессе апоптоза (GO: 0006915). Дефицит RTN4 может привести к таким фенотипам, как «аномальная морфология слоя трофобласта», «задержка роста эмбриона», «уменьшение размера плода» и «эмбриональная летальность» [23].

При гибели эмбрионов в образцах хориона белки PSG8, PSG7, PSG4 не определялись, Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 6 (Q00889, PSG6) отличалcя очень низким содержанием по отношению к контролю (табл. 1).

Кроме того, при замершей беременности в ворсинах хориона мы обнаружили снижение по сравнению с контрольными образцами хориона содержания таких белков, как Coactosin-like protein (COTL1), Protein canopy homolog 2 (CNPY2), Sideroflexin-3 (SFXN3), Prohibitin-2 (PHB2) и Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 (HAPLN1). Например, HAPLN1 необходим для образования агрегатов хрящевых протеогликанов, имеющих широкий спектр биологических функций. Отсутствие HAPLN1 приводит к перинатальной летальности, сопровождающейся тяжелой хондродисплазией [24] и пороками развития сердца [25].

Таким образом, сравнительный протеомный анализ позволил установить перечень низкопредставленных специфичных для развития беременности белков, характеризующихся значительными изменениями содержания (снижение и/или отсутствие) в раннем эмбриональном развитии при самопроизвольном выкидыше.

Генетические исследования

Как известно, уровень биосинтеза белка в организме определяется биогенезом рибосом, многокопийными генами, кодирующими рРНК рибосом (рДНК), что является одной из характеристик адаптационных возможностей человека. В связи с этим на следующем этапе проводили определение рДНК в геноме матери и плода в процессе эмбриогенеза. В табл. 2 представлены экспериментальные данные, отражающие число копий рДНК (параметр R) в ДНК лейкоцитов крови, децидуальной оболочки и в ДНК эмбрионов.

Группа I (рисунок) — неразвивающаяся беременность (№ 1–25) или предполагаемое (визуально) отсутствие эмбриона (№ 20–25). Образцы ДНК, выделенной из клеток крови и из ткани Д одной и той же женщины, не различались по содержанию рДНК (p > 0,05). Этот факт подтверждает ранее полученные данные об одинаковом содержании рДНК в различных тканях одного и того же организма [26].

Геномы эмбрионов (ткань Э) значительно отличались от геномов матерей (ткани К и Д) по числу копий рДНК. Интересно отметить, что отличия были зафиксированы для пяти случаев (№ 20–25), когда визуально эмбрион не определялся. По-видимому, остановка деления клеток произошла на раннем сроке беременности. Среди материнских клеток, скорее всего, присутствуют и клетки другого организма. Возможно, содержание рДНК в этих клетках еще более низкое.

По соотношению содержания рДНК в геноме эмбриона и в клетках матери все эмбрионы в группе I четко разделились на две подгруппы. В подгруппе Ia (n = 20) параметр R(Э) был в 1,4–3,3 раза ниже (среднее — 1,7 раза; p < 0,001), чем R(К или Д). В подгруппе Iб (n = 5) параметр R(Э) был в 1,7–2 раза выше (среднее — 1,8 раза; p = 0,02), чем R(К). Таким образом, остановка эмбриогенеза ассоциирована либо со слишком низким, либо со слишком высоким содержанием рДНК в геноме эмбриона по сравнению с геномом женщины.

Группа II — прерывание беременности по медицинским показаниям (энцефалоцеле, признаки рудиментарного поражения нижней конечности, ЦНС-акрания, синдром Эдвардса и сращение легочной артерии и аорты у плода). В этой группе геном у 4 эмбрионов содержал больше копий рДНК, чем в группе Ia (р = 0,01). Различия между группами IIК и IIЭ были недостоверны. Только один образец ДНК эмбриона отличался от ДНК лейкоцитов женщины более низким содержанием рДНК.

Для групп здоровой и замершей беременности наиболее значимые результаты получены только для эмбрионов (рисунок), при этом пороговое значение повторов рДНК составляло 322, при более низких значениях рДНК в наших наблюдениях происходила гибель эмбрионов.

Анализ изложенных данных позволяет сделать следующие выводы

В тканях хориона при гибели эмбрионов происходят глубокие нарушения состава белка и наличия генов, участвующих в развитии беременности. Так, низкие уровни PSG были связаны с плохими исходами беременности. В частности, в хорионе при замершей беременности не был зафиксирован специфический для беременности бета-1-гликопротеин 7 (PSG7), снижение которого во время пренатального развития может приводить к потере беременности.

Мы также обнаружили снижение экспрессии белка ретикулона-4 (RTN4) при гибели эмбрионов, который участвует в процессе апоптоза (GO: 0006915). Дефицит RTN4 может привести к таким фенотипам, как «аномальная морфология слоя трофобласта», «задержка роста эмбриона», «уменьшение размера плода» и «эмбриональная летальность» [23].

Содержание рДНК одинаково в клетках крови и в клетках децидуальной оболочки одного и того же женского организма.

Определены пороговые значения повторов рДНК в тканях эмбрионов (322), после снижения которых происходило прерывание беременности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Замершая беременность ассоциирована с выраженным дисбалансом по содержанию рДНК в геномах эмбриона и матери. В большинстве случаев геном эмбриона содержит достоверно меньше копий рДНК, чем геном матери и геномы других эмбрионов, развитие которых не прерывалось самопроизвольно. Очень низкое содержание рДНК в геноме, по-видимому, ассоциировано с низким количеством рибосом, что не может обеспечить приемлемый для развития конкретно данного эмбриона уровень синтеза белка. Ранее было показано, что низкое число копий рДНК в геноме человека (менее 300 копий) ассоциировано с более низкой продолжительностью жизни и с развитием деменции в пожилом возрасте [7, 27]. Моногенное заболевание муковисцидоз, вызванное мутацией в гене CFTR, ассоциировано с большим количеством копий рДНК в геноме больного.

Мультифакториальное заболевание шизофрения также ассоциировано с увеличенным уровнем рДНК в геноме больного [27, 28]. По-видимому, малое количество рДНК в геноме не позволяет реализоваться геному с генетической патологией, эмбриогенез останавливается на ранней стадии. Только пять хромосом в геноме человека содержат рДНК, кодирующую рибосомную РНК, из которой при участии определенных белков собирается рибосома — молекулярная машина, синтезирующая все белки нашего организма [17, 29]. Очень высокое содержание рДНК в геноме эмбриона по сравнению с материнским геномом также негативно сказывается на процессе эмбриогенеза.

Возможны два объяснения этому факту. Во-первых, высокий уровень биогенеза рибосом, обусловленный большим количеством копий рДНК в геноме эмбриона, требует от материнского организма большого количества питательных веществ. Если геном матери содержит низкое количество копий рДНК, то он не сможет реализовать потребности эмбриона. Во-вторых, геномы с большим числом копий рДНК могут содержать мутации, которые блокируют эмбриогенез на более поздних стадиях, но позволяют развиться зародышу на ранней стадии. Геномы с малым количеством рДНК и наличием этой генетической патологии отторгаются уже на ранней стадии эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

Определение содержания бета-1-гликопротеинов, специфичных для беременности PSG8 (Pregnancyspecific beta-1-glycoprotein 8), PSG7 (Putative pregnancyspecific beta-1-glycoprotein 7), PSG6 (Pregnancyspecific beta-1-glycoprotein 6) и PSG4 (Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4), может быть полезным для пренатального прогнозирования развития беременности. Неразвивающаяся беременность в большинстве случаев (в 16 из 20 исследованных) ассоциирована с низким содержанием рДНК в ДНК эмбриона по сравнению с контрольной группой (нормальная беременность). Низкий показатель R отражает неспособность клеток обеспечить приемлемый для развития эмбриона уровень биогенеза рибосом. Определение специфических белков в ворсинах хориона и числа копий рДНК в геномах потенциальных родителей с последующим моделированием числа копий рДНК у эмбриона может помочь в установлении причин бесплодия у супружеских пар и прогнозировании развития существующей беременности.