Благодаря короткому времени анализа молекулярное профилирование, основанное на методах масс- спектрометрии с прямой ионизацией, является перспективным подходом для ассистирования хирургу в принятии решений в ходе плановых вмешательств в онкологии [1]. Такие интраоперационные методы диагностики основаны на поиске дескрипторов патологического состояния путем сравнения молекулярного профиля, полученного от исследуемой ткани, с профилями, содержащимися в референсной базе данных, включающей патологически измененные и контрольные образцы. При этом особенно важной оказывается задача выбора образцов, накапливаемых в базе данных в качестве неопухолевого контроля. Одним из наиболее распространенных подходов является использование тканей, расположенных вблизи опухоли [2]. Однако в таких образцах также может быть обнаружено некоторое количество опухолевых клеток, кроме того некоторые изменения метаболического профиля ткани наблюдаются и для морфологически здоровых клеток вблизи границы опухоли [1]. Использование в качестве контроля ткани с патологией иной природы также не является оптимальным в метаболических исследованиях из-за комплексного влияния патологического процесса на различные метаболические пути [3]. Возможным решением проблемы доступности контрольных образцов может быть использование аутопсийного материала здоровых тканей. По сравнению с интраоперационной биопсией использование посмертных тканей позволяет также получать образцы из нескольких регионов органа и при необходимости образцы большого объема. Использование посмертных тканей человека в рамках исследовательской аутопсии — одно из важных инструментов исследования этиологии и патогенеза различных заболеваний, особенно в области нейробиологии [4] и онкологии [5]. Однако точность молекулярно-биологических исследований может быть искажена из-за включения образцов с различными посмертными интервалами (ПИ) в общую коллекцию аутопсийного материала человека и труднопредсказуемого влияния ПИ на молекулярный профиль тканей [6, 7].

Смерть организма не приводит немедленно к гибели его клеток. Это иллюстрируется трупным окоченением, при котором скелетные мышцы продолжают метаболизировать АТФ до тех пор, пока все запасы не будут истощены. Продолжение метаболических процессов в клетках погибшего организма является фундаментальной причиной, объясняющей возможность осуществления трансплантации органов и тканей умерших людей [5]. В последнее десятилетие выделилось новое научное направление — танатотранскриптомика, изучающая глобальные изменения экспрессии генов после смерти организма [8]. В масштабном анализе данных проекта GTEx была выявлена ткане- и геноспецифичность экспрессии и деградации мРНК при увеличении ПИ [9]. В тканях органов лабораторных животных было выявлено значительное увеличение транскрипции более тысячи генов, в основном связанных со стрессом, иммунитетом, воспалением и апоптозом, в период до 96 ч после смерти [10]. Изучение процессов деградации в здоровых и патологически измененных тканях важно для того, чтобы отделить истинные, физиологически или патологически обусловленные изменения от артефактов, вызванных процессами, происходящими после смерти. Сравнительный анализ посмертной динамики экспрессии генов показал сближение транскрипционных профилей здоровой и опухолевой ткани печени к ПИ 24 ч на фоне адекватного качества биоматериала и изначальных существенных различий в экспрессии отдельных генов [11]. Таким образом, посмертные изменения в здоровой и опухолевой тканях протекают по-разному, что маскирует изначальные различия, присутствовавшие в живой ткани. Помимо нуклеиновых кислот исследуются также посмертные изменения среди белков [12] и малых молекул — метаболитов [13] и липидов, — в составе которых наиболее быстро отображаются все изменения, происходящие в организме из-за внутренних и внешних факторов.

Липиды являются обязательным компонентом клеточной мембраны и участвуют во многих биологических процессах, например, энергетическом метаболизме, клеточном распознавании, развитии и разрешении воспаления. Липиды просты в обнаружении при помощи высокопроизводительных методов масс-спектрометрии, поэтому поиск липидных маркеров представляется перспективным в области нейродегенеративных и психических заболеваний [14], а также некоторых видов онкологических заболеваний: опухолей гепатобилиарной системы [15], мозга [16] и др. В отличие от нуклеиновых кислот и белков, к настоящему моменту существует ограниченное число работ на тему посмертной стабильности липидного профиля тканей. Судебно- медицинские исследования фокусируются на длительных посмертных интервалах и соответствующих органах и тканях (костях и мышцах) [17, 18]. В систематическом обзоре 2024 г. [19] были рассмотрены липидомные данные для определения ПИ, однако среди работ, посвященных липидному составу органов, есть исследования, проводившиеся только в отношении мышечной и жировой тканей и крови. Отмечено, что до сих пор не существует уравнений, связывающих концентрации липидов с ПИ. Исследование стабильности липидов в уже изъятых образцах головного мозга человека и грызунов показало, что среди соединений, значимо изменяющихся с увеличением ПИ до 48 ч, были выделены только окисленные жирные кислоты [20]. Показано, что варьирование условий хранения изъятых образцов головного мозга крыс в первый час не влияет на липидный профиль [21]. Таким образом, на сегодняшний день остается актуальным изучение посмертной стабильности липидов, полученных из аутопсийного материала раннего посмертного периода (до 72 ч), когда представляется возможность получения аутопсийного материала человека.

Цель данной работы — исследовать изменения липидного состава тканей печени и головного мозга модельного животного в раннем посмертном периоде методом молекулярного профилирования с использованием масс-спектрометрии с прямой ионизацией. Выбор органов интереса обусловлен тем, что для головного мозга наиболее критичны полнота резекции опухоли при минимальном затрагивании здоровых тканей и, следовательно, интраоперационное определение границ. Для опухолей печени обычной практикой является резекция значительных объемов органа, однако определение степени инвазии опухоли может позволить снизить объем резекции без повышения риска рецидива. Также для печени характерны относительная однородность и быстрый метаболизм липидов, что делает ее удобным органом для оценки процессов изменения в липидных профилях тканей после смерти.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на 23 самцах мышей серии Balb/c (вес — 19–22 г, возраст — около 2 месяцев). После поступления из вивария животные проходили карантин в течение 7 дней при естественном освещении и свободном доступе к корму и воде. Для эвтаназии использовали раствор золетила (Zoletil 100, 200 мг/кг), затем животных подвергали дислокации шейных позвонков.

Мыши были случайным образом разделены на две группы с различными температурными условиями хранения тела животного после эвтаназии: группа 1 — хранение при +4 °С до проведения некропсии, группа 2 — хранение при +22 °С первые 4 ч, затем при +4 °С до проведения некропсии (таблица). Условия в группе 2 выбраны в связи со схожестью с условиями проведения аутопсии человека в клинических учреждениях. При вскрытии отбирали образцы тканей объемом порядка 70 мм3 каждый. Образцы помещали в криопробирки, охлаждали в жидком азоте и переносили на хранение при –80 °С.

Масс-спектрометрическое профилирование осуществляли с использованием методики проточной микроэкстракции [22]. Для этого в качестве ионного источника применяли картриджи со встроенным одноразовым электрораспылительным эмиттером. Образец ткани размораживали, из него вырезали три фрагмента объемом от 1 до 2 мм3 (что соответствует трем техническим повторам), которые затем промывали 0,9%-м (масс.) раствором хлорида натрия. Каждый фрагмент помещали в картридж и запечатывали капилляром для ввода растворителя [22]. Картридж подключается к линии подачи растворителя при помощи хроматографических винтов и размещается в изготовленном для этой цели держателе, обеспечивающем трехмерное позиционирование и подачу напряжения от масс-спектрометра. Рабочий раствор, используемый для проточной микроэкстракции липидов, состоял из смеси растворителей: метанол : изопропанол : ацетонитрил : вода в соотношении 3 : 3 : 3 : 1, с добавлением 0,1% (об.) уксусной кислоты. Состав рабочего раствора был выбран как обеспечивающий эффективную ионизацию полярных липидов различных классов [22].

Эксперименты проводили с использованием гибридного масс-спектрометра LTQ XL Orbitrap ETD (ThermoFisher, США) в режиме полного сканирования с m/z 100–2000. Спектры были получены с использованием масс-анализатора высокого разрешения (30 000 FWHM при m/z 400), в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов. Для каждого режима выполняли два технических повтора в рамках одного образца (картриджа).

Оценку изменений в липидном портрете тканей проводили при помощи анализа поведения индивидуальных глицерофосфолипидов и потенциальных продуктов их деградации — лизофосфолипидов и свободных жирных кислот (ЖК). Исследовали зависимость от величины посмертного интервала относительных интенсивностей фосфатидилинозитолов, фосфатидилхолинов, фосфатидил- этаноламинов с жирнокислотными остатками FA 16 : 0, 18 : 0 в первом положении и FA 18 : 2, 20 : 3, 20 : 4, 20 : 5, 22 : 4, 22 : 5, 22 : 6 — во втором как наиболее распространенных липидов в тканях печени и головного мозга [23]. Чтобы обнаружить наличие тренда (монотонной зависимости величины отклика от времени), использовали линейную регрессию.

Для построения матрицы интенсивности пиков, которые могут содержать липиды из списка, каждый скан масс-спектра нормировали на полный ионный ток, в нем выделяли пики с отношением сигнал/шум не менее 2, и в матрицу сохраняли только те пики, интенсивность которых отличалась от нуля как минимум в 25% масс- спектров. После этого отфильтровывали столбцы, значение m/z которых отличалось от теоретического не более чем на 0,05 Да. Таким столбцам присваивали имена соответствующих соединений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для масс-спектрометрических профилей тканей печени и головного мозга в режиме регистрации положительных ионов характерны две группы пиков в диапазонах m/z 450–600 и 750–900, принадлежащие сигналам лизофосфолипидов и глицерофосфолипидов соответственно. В режиме регистрации отрицательных ионов помимо аналогичных групп пиков наблюдается группа пиков в диапазоне m/z 250–350, соответствующая депротонированным ионам свободных ЖК (рис. 1). При увеличении посмертного интервала возрастала относительная представленность в профилях пиков из диапазонов малых масс (до m/z 600).

На рис. 2 показана матрица корреляций Спирмена между липидами и ПИ для образцов ткани печени животных из группы 2 (хранение при +22 °С первые 4 ч, затем при +4 °С). Между уровнями свободных ЖК, лизолипидов и ПИ показана высокая положительная корреляция (коэффициент более 0,6; наибольший коэффициент корреляции для арахидоновой (FA 20 : 4) и докозагексаеновой (FA 22 : 6) кислот: r = 0,75), в то время как корреляция между всеми обозначенными выше величинами и уровнями глицерофосфолипидов была незначительная (модуль коэффициента менее 0,4) или умеренная отрицательная (коэффициент менее –0,5). Для образцов ткани печени животных из группы 1 (хранение при +4 °С) по сравнению с группой 2 корреляция уровней липидов с посмертным интервалом была слабее, но корреляция уровней различных групп липидов между собой оставалась на том же уровне. То же наблюдается для образцов головного мозга животных из группы 2. Для образцов головного мозга животных из группы 1 значительной корреляции с ПИ (модуль коэффициента более 0,5) не было выявлено для каких-либо липидов из списка; из различных классов липидов показана высокая положительная корреляция (коэффициент более 0,7) уровней свободных ЖК между собой.

Среди лизолипидов, относительная интенсивность которых возрастает с увеличением ПИ, присутствуют лизофосфолипиды с остатками жирных кислот, характерных для sn-1 и sn-2 положения в глицерофосфолипидах. Относительные интенсивности 1- и 2-лизофосфолипидов одного порядка, но на порядок ниже, чем относительные интенсивности фосфолипидов — возможных предшественников соответствующих лизолипидов (рис. 3). Поэтому относительные интенсивности фосфолипидов значимо не меняются с увеличением ПИ.

Для образцов ткани печени относительная интенсивность свободных жирных кислот FA 16 : 0, FA 16 : 1, FA 18 : 0, FA 18 : 1, FA 18 : 2, FA 20 : 3, FA 20 : 4, FA 22 : 4, FA 22 : 5, FA 22 : 6 растет с увеличением ПИ. Для образцов тканей животных из группы 1 (хранение тела при +4 °С) значимый рост начинается с ПИ 36–48 ч для всех ЖК, кроме FA 22 : 5, FA 22 : 6, у которых рост начинается с ПИ 16 ч. Для образцов, полученных от животных из группы 2 (хранение тела при +22 °С первые 4 ч, затем при +4 °С), значимый рост начинается с ПИ 10 ч. Для обеих групп динамика изменений была одинакова между FA16 : 0 и FA 18 : 0; FA 22 : 4, FA 22 : 5, FA 22 : 6 внутри группы (рис. 4).

Для образцов головного мозга относительная интенсивность всех названных выше жирных кислот не меняется со временем хранения, за исключением FA 20 : 4 и FA 22 : 4, FA 22 : 5, FA 22 : 6 — их относительная интенсивность достигает максимума при ПИ 2–8 ч.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Повышение относительной представленности в профилях пиков из диапазонов малых масс (до m/z 600) при увеличении ПИ свидетельствует о гидролизе глицерофосфолипидов с образованием лизолипидов и свободных жирных кислот. Однако уровень возможных предшественников остается, в целом неизменным. Изменения относительных интенсивностей лизолипидов и свободных жирных кислот в печени более выражены, чем в мозге, а в группе 2 (хранение тела животного при +22 °С первые 4 ч, затем при +4 °С), как и ожидалось, более выражены, чем в группе 1 (хранение тела животного при +4 °С). Это согласуется с данными о лучшей посмертной стабильности тканей мозга [24] и может быть связано с высоким содержанием липаз в нормальной паренхиме печени.

Характерной особенностью являются относительные интенсивности полиненасыщенных жирных кислот, превышающие насыщенные. В литературных данных [23] представленность в липидах ткани печени ЖК с 16 и 18 атомами углерода составляет порядка 25 и 45% соответственно, арахидоновой — 13%, а докозагексаеновой кислоты — менее 5%. При этом в полученных данных молекулярного профилирования арахидоновой и докозагексаеновой кислот высвобождается больше, чем ЖК, характерных для sn-1 положения в фосфолипидах. ДГК, в отличие от жирных кислот с 16-ю и 18-ю атомами углерода, не является распространенным компонентом триглицеридов, что позволяет сделать вывод о том, что источник ее высвобождения при деградации ткани — именно фосфолипиды. Посмертные изменения в липидном профиле могут быть связаны с неспецифической деградацией липидов, а также с ферментативной активностью фосфолипаз в клетках, подвергающихся стрессу из-за гибели организма: PLA2 для высвобождения ПНЖК для дальнейшего синтеза эйкозаноидов и докозаноидов [25], PLA1 для выработки лизофосфолипидных медиаторов [26].

Посмертная деградация фосфолипидов с образованием лизофосфолипидов лишь незначительно влияет на уровень исходного липида, а величина этого изменения может быть сравнима, либо лишь незначительно превышать естественную биологическую вариабельность концентрации соответствующего фосфолипида. В то же время количество лизофосфолипида изменяется значимо по сравнению с исходным количеством, что делает набор лизофосфолипидов комплексным маркером посмертного интервала. Относительные интенсивности свободных ЖК, в свою очередь, оказываются сравнимы, или даже на порядок превышают интенсивности фосфолипидов. Это может быть связано с разнообразием источников высвобождения жирных кислот в процессе посмертной деградации тканей. Таким образом, высокая активность фосфолипаз в тканях печени, по сравнению с тканями головного мозга, приводит к выявлению ряда маркеров посмертной деградации, связанных именно с ферментативной активностью, а не спонтанной, неспецифической, деградацией липидов, при которой не происходит значимого увеличения концентраций узкого набора продуктов катаболизма липидов.

Исследование процессов посмертной деградации полярных липидов тканей здоровых животных показало, что и лизофосфолипиды, и свободные жирные кислоты не могут, в общем случае, быть использованы как молекулярные маркеры для построения диагностических моделей на базе коллекций аутопсийного материала. Значимое изменение содержания лизофосфолипидов и свободных жирных кислот в процессе посмертной деградации тканей будет препятствовать построению достоверных диагностических моделей, а немонотонность этих изменений существенно затрудняет корректировку данных даже с учетом использования достоверной информации о степени посмертной деградации по данным о сохранности РНК [27]. В то же время фосфолипиды клеточных мембран не претерпевают статистически значимых изменений концентраций в тканях в раннем посмертном периоде, поэтому они сохраняют потенциал, как биомаркеры, подходящие для выявления с использованием не только биопсийного, но и аутопсийного материала. Таким образом, использование аутопсийного материала для анализа патологий относительно стабильных органов, таких как головной мозг, — потенциально пригодное решение, поскольку основными маркерами, позволяющими классифицировать биопсийный материал как опухолевый или здоровый, являются именно фосфолипиды, а не лизофосфолипиды и жирные кислоты [16]. Однако для построения диагностических моделей, предназначенных для определения наличия опухолевых клеток в образцах относительно быстро деградирующих внутренних органов, таких как печень, аутопсийный материал, вероятно, ограниченно пригоден и требует контроля ПИ.

Ограничение исследования

Следует отметить, что использование тканей печени грызунов, динамика метаболизма липидов в гепатоцитах которых отличается от таковой для человека, не позволяет в данный момент делать вывод о максимальной величине посмертного интервала для аутопсийных образцов человека, пригодных для исследования липидного профиля тканей печени.

ВЫВОДЫ

Для липидных профилей головного мозга показан рост представленности лизофосфолипидов и свободных жирных кислот в профиле с увеличением посмертного интервала, в то же время такой зависимости не обнаружено для большинства глицерофосфолипидов. Это позволяет предположить возможность использования аутопсийного материала мозга с посмертным интервалом вплоть до 72 ч для исследования молекулярных механизмов развития патологического процесса или построения диагностических моделей в онкологии на основе панели фосфолипидов. Для ткани печени, несмотря на морфологическую сохранность, на молекулярном уровне была показана низкая стабильность: начиная с 3–8 ч появляются значительные изменения в липидных профилях. Это делает аутопсийный материал печени менее пригодным для молекулярно-биологических исследований патогенеза, однако оставляет возможность выявлять маркеры деградации, например, для улучшенной оценки развития повреждения органа при трансплантации от посмертного донора.