Постоянный поиск нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) с минимальным токсичным действием на клетки, находящиеся в процессе постоянного деления, имеет важное значение, особенно это касается костного мозга [1]. При длительном применении НПВП возможны стимуляция иммунной системы и изменение концентрации цитокинов в крови, многие из которых являются факторами или катализаторами дифференцировки клеток костного мозга [2].

Показанием к назначению НПВП является не только воспаление. Достаточно широкое распространение они получили в качестве анальгетиков за свою способность эффективно купировать болевой синдром в послеоперационном периоде, что впоследствии сказывается на частоте и количестве применения опиоидных обезболивающих [1, 3]. Длительное и бесконтрольное применение НПВП отрицательно влияет не только на состояние желудочно-кишечного тракта, печени, почек, но и костного мозга, клетки которого находятся в состоянии постоянного деления. Наиболее ярким представителем группы НПВП является диклофенак натрия, который обладает выраженным противовоспалительным эффектом и наиболее часто применяется врачами в клинической практике для лечения патологий воспалительного характера (например, ревматоидного артрита, артроза суставов, анкилозирующего спондилоартрита, гинекологической, неврологической патологии, а также в качестве анальгетика после травм) [2, 4, 5].

Гистологически состояние костного мозга после длительного применения диклофенака натрия оценивают как неблагоприятное, происходит уменьшение количества гемопоэтических клеток, в результате чего развивается панцитопения, анемия, повышается риск инфекций [6, 7].

Биотрансформация диклофенака натрия происходит преимущественно в гепатоцитах, выведение осуществляется на 60–65% с мочой и 30–35% с желчью через желудочно- кишечный тракт [8, 9]. В костном мозге под действием диклофенака натрия наблюдается нейтропения, агранулоцитоз, снижение количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, происходит изменение количественных показателей цитокинов [10]. Последние представляют собой небольшого размера белки, основная задача которых состоит в передаче сигнала между клетками посредством специфических рецепторов. Механизм передачи сигнала у цитокинов происходит таким же путем, как и у некоторых белковых гормонов. Отличие состоит в том, что вырабатываются цитокины многими клетками организма, а не какими-то конкретными, в отличие от гормонов, и действуют на расстоянии или локально — паракринно или аутокринно [11, 12]. Принято разделять цитокины на провоспалительные (интерлейкин-1 (IL1β) и фактор некроза опухолей (TNFα)) и противовоспалительные. Синтез IL1β осуществляют миелоидные клетки как ответ на действие паттернов, ассоциированных с патогенами или повреждением. Влияние IL1β на организм связано с индукцией синтеза других цитокинов, отвечающих за воспаление, в частности TNFα и IL6 (отвечает за дифференцировку клеток костного мозга), под его влиянием происходит стимуляция клеток предшественников мегакариоцитарного ростка, пре-В-лимфоцитов [13].

TNFα получил свое название за способность приводить некоторые опухолевые клетки к геморрагическому некрозу, что давало надежду на излечение от онкологии. Дальнейшими исследованиями было установлено, что TNFα способствует прогрессированию новообразований и их метастазированию [14]. Выработка TNFα осуществляется иммунными клетками, в основном моноцитами и макрофагами, под его влиянием происходят пролиферация и дифференцировка нейтрофилов и макрофагов, их ускоренный выход в кровоток. При воспалении или стрессе цитокин приводит к угнетению образования эритроцитов и лимфоцитов, повышается выработка миелоидных клеток [15]. При непосредственном участии TNFα происходит повышение концентрации IL1 и других цитокинов, при проникновении инфекции в организм он приводит лейкоциты в активное состояние [16]. В зависимости от внутреннего состояния организма TNFα обладает провоспалительными и противовоспалительными свойствами и играет ведущую роль в цитокиновом шторме при COVID-19 [17–21]. Важное значение цитокины играют в патогенезе воспалительных заболеваний (ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилоартрита и др.), при которых широко применяют НПВП на протяжении длительного времени [22, 23].

Несмотря на то что атопический дерматит манифестирует преимущественно локальными поражениями кожи, современные концепции рассматривают его как системную патологию, протекающую с вовлечением центральных органов иммунопоэза. Избыточная продукция периферических медиаторов воспаления способна дистанционно модулировать функциональное состояние костного мозга. В частности, хронический воспалительный сигнал приводит к гиперстимуляции пула наиболее ранних гемопоэтических стволовых клеток и предшественников — LSK-клеток (Lin‒Scamin–c-Kit–), сдвигая их дифференцировку в сторону миелопоэза и усугубляя системный цитокиновый дисбаланс (включая гиперпродукцию IL1β и TNFα).

Представляет особый интерес изучение эффектов диклофенака натрия в данной модели. Являясь неселективным ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ-1 и ЦОГ-2), диклофенак блокирует синтез простагландинов, которые признаны важными регуляторами как барьерных свойств кожи, так и костномозгового микроокружения. Применение диклофенака натрия в настоящем исследовании рассматривается нами как патогенетический инструмент, позволяющий определить вклад ЦОГ-зависимых механизмов в реализацию системного ответа костного мозга (его клеточности и пула LSK-клеток) при кожной патологии.

Целью исследования было оценить влияние диклофенака натрия в дозе 1,5 и 3 мг/кг на клеточность костного мозга, процентное соотношение недифференцированных бластов и концентрацию провоспалительных цитокинов (IL1β и TNFα) у мышей с экспериментальным дерматитом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная часть работы была выполнена на базе ФГБОУ ВО ЛГМУ имени Свт. Луки Минздрава России в соответствии с требованиями Рекомендации Коллегии Евразийской экономической комиссии «Руководство по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований от 14.11.2023 № 33», а также с соблюдением принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в научных целях [24, 25].

Экспериментальная модель

Для проведения исследования были отобраны 64 самца мышей линии BALB/c возрастом 6 недель, массой 18–25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 22 ± 2 °C, относительной влажности 50–60% и 12-часовом световом цикле, с неограниченным доступом к пище и воде.

Распределение животных по группам осуществляли методом простой рандомизации с использованием генератора случайных чисел. Оценку морфологических и биохимических показателей проводил исследователь, не осведомленный о принадлежности животных к экспериментальным группам (слепой анализ, blinded assessment). Случайным образом животные были разделены на пять экспериментальных групп: первая — контроль (n = 12), (животные не подвергались моделированию дерматита и не получали действующее вещество); во второй (n = 10) был смоделирован экспериментальный дерматит, животные не получали действующее вещество; в третьей (n = 16) на фоне дерматита получали диклофенак натрия в дозе 1,5 мг/кг; в четвертой (n = 16) на фоне дерматита получали диклофенак натрия в дозе 3 мг/кг; в пятой группе (n = 10) вводили диклофенак натрия в дозе 3 мг/кг с целью оценки прямого токсического действия действующего вещества на костный мозг.

Подбор доз проводили из расчета менее выраженного миелосупрессивного действия, оказываемого диклофенаком натрия (Solopharm, Россия) в дозе 1,5 мг/кг и компенсаторной реакцией бластных клеток в сравнении с высокой дозой 3 мг/кг [1, 2, 4, 5]. Действующее вещество вводили внутримышечно в область четырехглавой мышцы бедра 2 раза в сутки с интервалом 12 ч (8.00 и 20.00) в течение 96 ч. Выбор дозировок был обусловлен также необходимостью сравнения умеренного и выраженного фармакологического эффекта, и оценки дозозависимости. Контрольная группа получала физиологический раствор натрия хлорида в эквивалентном объеме.

В качестве воспалительного процесса был выбран экспериментальный контактный дерматит, как быстро воспроизводимая валидированная модель локального иммуновоспалительного ответа, сопровождающегося изменением цитокинового профиля. Дерматит моделировали на дорсальной поверхности кожи после эпиляции волосяного покрова. Индукцию первичного повреждения кожного барьера проводили путем нанесения 10% раствора додецилсульфата натрия («ЭкоТек», Россия), который обеспечивал деструкцию липидного слоя рогового эпидермиса и повышение проницаемости кожи. Первичную воспалительную реакцию оценивали в первые 24–48 ч после нанесения. Для поддержания и хронизации воспалительного процесса использовали аллерген Dermatophagoides farinae Biostir-AD (Biostir Inc., Япония) в виде косметической мази на основе клеща домашней пыли, который наносили в дозе 100 мг, на участки поврежденной кожи 2–3 раза в неделю на протяжении 7–14 дней. Оценочными критериями формирования дерматита служили признаки воспалительного процесса — гиперемия, отек, локальное повышение температуры, шелушение и зуд, которые регистрировали на 7–10 сутки эксперимента.

По завершении экспериментального периода животных подвергали эвтаназии под общей анестезией с использованием ингаляционного изофлурана в смеси с кислородом. Выбор данного анестетика был обусловлен его минимальным влиянием на показатели цитокинового профиля по сравнению с инъекционными средствами. После достижения адекватной глубины анестезии проводили декапитацию с последующим асептическим извлечением бедренных костей. Костный мозг выделяли путем механического разрушения кости с последующим получением суспензии клеток. В полученном материале определяли общее количество клеток в 1 мл, количество недифференцированных клеток, концентрацию провоспалительных цитокинов — интерлейкина-1β (IL1β) и фактора некроза опухолей α (TNFα).

Продолжительность введения препарата была ограничена 96 ч в связи с наблюдаемым увеличением летальности животных при более длительном воздействии, что учитывалось как ограничение модели и соответствовало этическим требованиям минимизации страдания экспериментальных животных.

Для количественной оценки популяции недифференцированных клеток костного мозга использовали метод проточной цитометрии. Клетки окрашивали с использованием панели моноклональных антител к маркерам Lin– Sca-1+ c-Kit+ (LSK), позволяющим идентифицировать гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (BD Biosciences, США). Результаты выражали в процентах от общего числа ядросодержащих клеток [26–27].

Иммуномагнитная сепарация клеток

Для дополнительного обогащения популяции клеток- предшественников применяли метод иммуномагнитной сепарации с использованием коммерческих наборов (Miltenyi Biotec, Германия). Полученную фракцию использовали для повышения точности последующего анализа клеточных характеристик. Следует отметить, что иммуномагнитную сепарацию применяли как вспомогательный метод и не использовали в качестве основного способа количественной оценки популяции недифференцированных клеток [28–30].

Определение концентрации цитокинов

Концентрации интерлейкина-1β (IL1β) и фактора некроза опухолей-α (TNFα) в гомогенате костного мозга определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов (R&D Systems, США). В работе использовали коммерческие видоспецифичные тест-системы серии Quantikine ELISA Kits (R&D Systems, США): набор Mouse IL1 beta/IL1F2 (Cat. No. MLB00C) и набор Mouse TNFalpha (Cat. No. MTA00B) в соответствии с инструкциями производителя. Чувствительность метода составляла менее 5 пг/мл. Измерения проводили в дупликатах с построением калибровочных кривых. Результаты выражали в пг/мл.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism 9. Проверку нормальности распределения выполняли с помощью теста Шапиро–Уилка. Для сравнения более двух групп применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с пост-хок-тестом Тьюки. При ненормальном распределении использовали критерий Краскела–Уоллиса с тестом Данна. Данные представлены как M ± SD. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Дополнительно рассчитывали 95%-е доверительные интервалы и effect size (η²). Статистическую обработку результатов, полученных в ходе эксперимента, построение графиков и диаграмм выполняли с использованием программы Statistica10 (StatSoft Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе проведенного исследования было выявлено дозозависимое влияние диклофенака натрия на клеточность костного мозга, популяцию недифференцированных клеток (Lin– Sca-1+ c-Kit+, LSK) и концентрации провоспалительных цитокинов.

В группе животных с дерматитом без лечения выявлено статистически значимое снижение общего количества клеток костного мозга по сравнению с интактной группой (p < 0,05), что отражает угнетение гемопоэза на фоне системного воспалительного процесса.

Введение диклофенака натрия сопровождалось дальнейшим снижением клеточности. При применении дозы 1,5 мг/кг уменьшение показателя носило умеренный характер (p < 0,05 по сравнению с интактной группой), тогда как в группе на фоне введения 3 мг/кг диклофенака натрия отмечалось более выраженное снижение как относительно интактной группы, так и группы дерматита без лечения (p < 0,01), что свидетельствует о дозозависимом миелосупрессивном эффекте препарата. Результаты оценки клеточного состава костного мозга представлены в табл. 1.

Количество недифференцированных клеток в группе с воспалением повышалось в 1,15 раза (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой. В группе на фоне воспаления с введением 1,5 мг/кг диклофенака натрия рост наблюдался в 2,55 раза (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой, в 2,21 раза (p < 0,05) в сравнении с группой с изолированным воспалением. В группе с дерматитом и введением 3 мг/кг диклофенака наблюдали снижение недифференцированных клеток на 60% (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой и на 65,3% (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита. В группе, где вводили только 3 мг/кг диклофенака натрия, показатель клеточности снизился на 20% (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой, на 30,5% (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита, на 68,7% (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита на фоне введения 1,5 мг/кг, вырос в 2 раза (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита на фоне введения 3 мг/кг действующего вещества.

При исследовании концентрации цитокинов в группе дерматита наблюдали повышение содержания IL1β и TNFα. В группе с дерматитом на фоне введения 1,5 мг/кг диклофенака натрия концентрация исследуемых цитокинов также имела четкую тенденцию в сторону повышения в сравнении с показателями контрольной группы. В группе с дерматитом на фоне введения 3 мг/кг действующего вещества рост был более значительным для концентрации IL1β, что составило максимальное значение, TNFα оставался на относительно высоком уровне. В группе, где вводили только диклофенак в дозе 3 мг/кг, концентрация IL1β и TNFα по своим значениям приближалась к показателям контрольной группы. Изменения концентраций цитокинов представлены в табл. 2.

Анализ концентрации IL1β показал повышение его уровня в группе с дерматитом в 1,08 раза (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой. В группе дерматита на фоне введения 1,5 мг/кг раствора диклофенака натрия наблюдали рост в 1,03 раза (p < 0,05) по отношению к контрольной группе и снижение концентрации на 3,7% (p < 0,05) в сравнении с группой изолированного дерматита. В группе дерматита на фоне введения 3 мг/кг действующего вещества концентрация цитокина выросла максимально, достигая своего пикового значения, в 1,16 раза (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой и в 1,07 раза (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита. В группе, получавшей 3 мг/кг действующего вещества, концентрация IL1β не изменилась по отношению к контрольной группе, снизилась на 7,3% (p < 0,05) в сравнении с группой изолированного дерматита, на 3,8% (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита на фоне введения 1,5 мг/кг диклофенака и на 14,1% (p < 0,05) по отношению к группе дерматита на фоне введения 3 мг/кг действующего вещества.

Концентрация TNFα в группе изолированного дерматита выросла в 1,06 раза (p < 0,05) по отношению к контрольной группе. В группе дерматита на фоне введения 1,5 мг действующего вещества наблюдали рост в 1,23 раза (p < 0,05) в сравнении с контрольной группой на 1,16 раза (p < 0,05) в сравнении с группой дерматита. В группе дерматита на фоне введения 3 мг/кг действующего вещества концентрация TNFα выросла в 1,13 раза (p < 0,05) по отношению к интактной группе и в 1,06 раза (p < 0,05) в сравнении с показателями группы с изолированным дерматитом. В группе, получавшей только 3 мг/кг, наблюдали рост концентрации на 1,09 раза (p < 0,05) по отношению к интактной группе и в 1,02 раза (p < 0,05) по отношению к группе изолированного дерматита, снижение показателя на 11,9% (p < 0,05) по отношению к группе с дерматитом и введением 1,5 мг/мг действующего вещества и на 3,6% (p < 0,05) в сравнении с группой с дерматитом на фоне введения 3 мг/кг диклофенака натрия.

Динамику изменения исследуемых показателей костного мозга во всех исследуемых группах возможно представить при помощи графического изображения (рис. 1–рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Диклофенак натрия оказывает выраженное дозозависимое влияние на гемопоэз и цитокиновый профиль костного мозга в условиях воспалительного процесса [1, 11]. В ходе проведенного исследования у животных с дерматитом было выявлено снижение общей клеточности костного мозга, что согласуется с данными о супрессивном влиянии системного воспаления на гемопоэз [2]. Анализ популяции LSK-клеток показал, что в группе с изолированным дерматитом их доля существенно не отличалась от интактных значений, но все-таки была выше. Это дает возможность предположить активацию гемопоэза на фоне воспалительного процесса, а также сохранении базового пула стволовых клеток на ранних этапах воспалительного ответа.

В группе с дерматитом на фоне введения диклофенака в дозе 1,5 мг/кг снижается общее количество клеток, что дает представление о некоторой токсичности действующего вещества на отдельные группы клеток [4, 5]. Вместе с тем отмечалось достоверное увеличение доли Lin−Sca-1+ c-Kit+ клеток (p < 0,05), что может свидетельствовать о компенсаторной активации гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток на фоне попадания диклофенака натрия в организм.

В то же время введение действующего вещества в дозе 3,0 мг/кг на протяжении 96 ч сопровождалось значительным снижением показателя клеток в 1 мл суспензии костного мозга и процентной доли LSK-клеток по сравнению с группой, которая получала 1,5 мг/кг, так и с контрольными группами (p < 0,01), что указывает на угнетение пролиферативного потенциала костного мозга. Аналогичная тенденция наблюдалась и в группе животных, получавших диклофенак без моделирования дерматита, что свидетельствует о прямом токсическом воздействии препарата [7, 8].

В группе, получавшей только 3 мг/кг диклофенака, отмечалось снижение клеточности костного мозга, но в сравнении с группой с дерматитом на фоне введения такой же дозы действующего вещества показатель был на более высоком уровне, что дает возможность говорить о токсическом действии действующего вещества, которое на фоне воспаления при применении препарата в высоких дозах только усиливается. Подобные изменения наблюдаются и в отношении процентной доли LSK-клеток, что также свидетельствует о наличии прямого миелотоксического действия диклофенака натрия, не связанного исключительно с воспалительным процессом.

Применение диклофенака натрия отражается и на показателях цитокинового профиля IL1β и TNFα. В группе на фоне изолированного воспаления возрастает уровень TNFα, который на фоне дерматита проявляет провоспалительные свойства и приводит к повышению IL1β. В группе на фоне дерматита с введением 1,5 мг/кг

диклофенака натрия концентрация IL1β снижается, что обусловлено противовоспалительными свойствами диклофенака натрия. Возрастает концентрация TNFα, который при таких условиях способен проявлять противовоспалительные свойства, подобные изменения могут свидетельствовать о компенсаторной активации иммунорегуляторных механизмов на фоне умеренного воздействия препарата [29].

В группе с дерматитом на фоне введения 3 мг/кг диклофенака концентрация IL1β достигает своего максимального значения и превышает аналогичные показатели во всех остальных группах, приводя только к прогрессированию воспалительного процесса в организме. Концентрация TNFα снизилась по отношению к показателям группы животных с дерматитом на фоне введения 1,5 мг/кг действующего вещества, оставаясь стабильно высокой по отношению к группам контроля и дерматита. Подобные изменения могут указывать на провоспалительные свойства TNFα, усиление провоспалительного ответа и развитие дозозависимого токсического эффекта диклофенака натрия [5].

В группе с дерматитом на фоне введения 3 мг/кг концентрация IL1β не изменилась в сравнении с контрольной группой, что может свидетельствовать о прямом влиянии диклофенака натрия на цитокиновый профиль костного мозга. Концентрация TNFα остается на высоком уровне, в сравнении с контрольной группой и группой на фоне изолированного дерматита, но она ниже, чем у животных, которые получали диклофенак натрия на фоне воспалительного процесса.

Ограничение исследования

Следует отметить, что интерпретация изменений уровня TNFα требует осторожности, поскольку данный цитокин обладает плейотропными эффектами и способен участвовать как в активации, так и в регуляции воспалительного процесса. В настоящем исследовании повышение его концентрации в сочетании с увеличением уровня IL1β и выраженным снижением клеточности костного мозга, вероятно, отражает усиление воспалительного и цитотоксического воздействия препарата [14, 15, 18].

ВЫВОДЫ

В результате проведенного экспериментального исследования диклофенак натрия оказывал дозозависимое влияние на клеточный состав костного мозга, популяцию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (LSK) и цитокиновый профиль в условиях экспериментального дерматита и при изолированном его применении. Применение диклофенака натрия в дозе 1,5 мг/кг приводило к токсическим изменениям, которые проявлялись снижением общей клеточности костного мозга при одновременном увеличении доли LSK-клеток, что может отражать компенсаторную активацию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Введение диклофенака натрия в дозе 3 мг/кг имело наиболее выраженные последствия, которые проявлялись в наиболее выраженном угнетении гемопоэза: количество клеток и LSK-клеток костного мозга снижалось на фоне одновременного роста концентрации провоспалительных цитокинов, что указывает на развитие миелотоксического и провоспалительного эффекта высокой дозы препарата. Полученные данные подтверждают, что высокая доза диклофенака натрия оказывает выраженное негативное влияние на костный мозг и усиливает воспалительный ответ, тогда как низкая доза сопровождается менее выраженными изменениями и признаками компенсаторной активации стволовых клеток. Перспективы дальнейших исследований связаны с изучением длительного воздействия диклофенака натрия, расширением спектра исследуемых цитокинов и включением молекулярных маркеров регуляции гемопоэза, включая микроРНК, с целью более точной оценки механизмов его влияния и потенциального клинического значения.