Применение живых аттенуированных гриппозных векторов требует тонкого баланса между снижением вирулентности штамма и сохранением его иммуногенности. Одним из возможных путей достижения этого баланса является направленное модулирование иммунного ответа за счет экспрессии иммуномодулирующих молекул в составе генома гриппозного вектора для усиления защитного ответа без снижения вирулентности штамма.

Аттенуированные штаммы вируса гриппа с модифицированным белком NS1 являются перспективной платформой для разработки живой гриппозной вакцины с широким спектром защитной эффективности, а также для создания векторов доставки целевых антигенов [1]. Вирусы с укороченным NS1-белком способны к эффективной репликации в производственных субстратах, обладая при этом аттенуированным фенотипом в иммунокомпетентных системах [2]. Аттенуация таких штаммов обусловлена тем, что вирусы с укороченным неструктурным белком NS1 не способны подавлять врожденный иммунный ответ хозяина, за счет утраты С-концевого эффекторного домена, опосредующего взаимодействие с клеточными факторами иммунной регуляции и процессинга мРНК [3]. Однако сохранение РНК-связывающего домена в N-концевом участке белка NS1 может обуславливать сохранение иммуносупрессивной активности таких вирусов за счет ограничения процессинга и созревания ключевых медиаторов инфламмасомо-зависимой сигнализации — интерлейкина-1β (IL1β) и интерлейкина 18 (IL18) [4]. Поскольку эти цитокины играют важнейшую роль в формировании эффективного иммунного ответа, в случае гриппозного штамма, имеющего белок NS1, укороченный до 124 аминокислот, может наблюдаться ограничение иммуностимулирующего потенциала такого штамма. В связи с этим дальнейшая оптимизация безопасности и иммуногенности таких гриппозных векторов является актуальной задачей.

Один из перспективных подходов к повышению иммуногенности аттенуированных штаммов — встраивание в вирусный геном дополнительных трансгенов, которые кодируют иммуномодулирующие факторы, способные обеспечить направленную активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа.

Особый интерес в контексте усиления противогриппозного иммунного ответа представляют цитокины семейства интерлейкина-1, способные усиливать как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ при совместном интраназальном введении с антигеном [5]. Ранее было показано, что интраназальное введение IL1β в комбинации с гриппозным антигеном индуцирует формирование Т-резидентных клеток памяти, которые играют ключевую роль в формировании перекрестной защиты против гетерологичных штаммов вируса гриппа [6]. Экспрессия биологически активной молекулы IL1β рекомбинантным аттенуированным штаммом вируса гриппа может способствовать усилению специфического иммунного ответа на гриппозные антигены, обеспечивая эффективную защиту широкого спектра действия.

Цель исследования — сконструировать и получить рекомбинантные аттенуированные вирусы гриппа, имеющие укороченный до 124 аминокислот белок NS1 и экспрессирующие IL1β человека, и провести сравнительный анализ их репликативных свойств, иммуностимулирующей активности и профиля безопасности in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмидные конструкции

Для сборки рекомбинантных штаммов были получены две различные по конструкции плазмиды, кодирующие последовательности химерного геномного сегмента NS, со вставкой последовательности активной формы IL1β [7]. Для рекомбинантного штамма IL1b_2A_NS124 плазмида была получена на основе ранее сконструированной плазмиды pHW-PR8-sF-NS [8]: последовательность IL1β с сигнальным пептидом IgGκ, синтезированная de novo («Евроген», Россия) была встроена в N-концевую часть химерного полипротеина, включавшего в себя трансген, за которым следовали последовательности укороченного до 124 аминокислот NS1 и NS2/NEP, разделенные сайтами 2A, экспрессия NEP при этом обеспечивалась за счет сайта 2A без сплайсинга. Для рекомбинантного штамма NS124_SS_IL1b в плазмиде последовательность трансгена с сигнальным пептидом IgGκ была вставлена после последовательности укороченного до 124 аминокислот белка NS1 через кассету перекрывающихся стоп-старт кодонов, обеспечивающих реинициацию трансляции. Плазмиды, кодирующие последовательности остальных внутренних и поверхностных белков вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (A/PR/8/34), были получены из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева».

Культуры клеток

Клетки MDCK (#FR‐58; IRR, США) культивировали в среде АльфаМЕМ («Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки SC‐biol («Биолот», Россия). Клетки A549 (CCL-185; АТСС, США) и НЕК293 (ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева») культивировали в среде DMEM/F12 («Биолот», Россия) c добавлением 10% сыворотки SC‐biol («Биолот», Россия).

Получение рекомбинантных вирусов

Рекомбинантные вирусные штаммы были получены методом трансфекции ко-культуры клеток MDCK/HEK293 набором из восьми плазмид, кодирующих геномные сегменты вируса гриппа. В качестве трансфекционного агента использовали реагент GenJect39 («Молекта», Россия). Последующие этапы пассирования рекомбинантных вирусных штаммов проводили в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (ОАО «Птицефабрика Синявинская», пос. Приладожский, Россия) при температуре 34 °C. Гриппозный вектор (NS124), имеющий укороченный до 124 аминокислот белок NS1 без вставки трансгена, был получен из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России (лаборатория векторных вакцин).

Определение инфекционной активности

Инфекционную активность рекомбинантных вирусных штаммов определяли методом предельных разведений в системе РКЭ и культуре клеток MDCK [8]. Для определения 50%-й инфекционной дозы был использован метод Рида и Менча, титр выражали в log₁₀ ЭИД₅₀ (ТИД₅₀)/мл.

Определение длины химерного сегмента NS методом ОТ-ПЦР

Вирусную РНК выделяли набором реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen, Нидерланды). Генетический материал амплифицировали набором реагентов БиоМастер ОТПЦР–Экстра («Биолабмикс», Россия) и праймеров, специфичных к сегменту NS [9]. Амплификацию проводили с использованием сенсорного термоциклера GenTier 96E PCR Cycler (TianLong, China). Анализ длины ПЦР продукта проводили методом электрофореза в 1%-м агарозном геле с использованием ×1 ТАЕ буфера.

Количественное определение IL1β

Для получения образцов 10-дневные РКЭ (суточный монослой клеток MDCK) инфицировали рекомбинантными вирусными штаммами или пустым вектором NS124 в дозе 2 × 10⁵ ЭИД₅₀ (1,0 ТИД₅₀/кл.), образцы отбирали через 48 ч (24 ч) инкубирования при температуре 34 °С (37 °С, 5% CO₂). Уровень IL1β в пробах оценивали количественно методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Interleukin-1 beta-EIA-BEST («Вектор-Бест», Россия).

Измерение биологической активности IL1β

Биологическую активность IL1β определяли методом клеточного пролиферационного теста, основанного на стимуляции пролиферации IL1-зависимой линии клеток D10.G4.1 в присутствии субоптимальной концентрации конканавалина А. Клетки культивировали в среде RPMI1640 и вносили в 96-луночные планшеты вместе с серийными разведениями стандартного образца (WHO IL1β) и исследуемых проб. После инкубации в течение 72 ч при температуре 37 °C, 5% CO₂ пролиферацию оценивали по оптической плотности с использованием XTT-теста. Активность образцов рассчитывали по калибровочной кривой относительно международного стандарта и выражали в МЕ/мл.

Количественная оценка инфицированных клеток

Определение доли инфицированных клеток проводили методом проточной цитометрии. Суточный монослой клеток А549 заражали рекомбинантными штаммами или пустым вектором в дозе 1,0 ТИД₅₀/кл. в трех независимых повторах для каждого вируса и инкубировали в течение 20 ч в среде, содержащей 2% сыворотки. В качестве отрицательного контроля использовали незараженные клетки (КК). Количество зараженных клеток в процентах считали с помощью проточного цитометра, окрашивая клетки набором Zombie Aqua Fixable Viability Kit и FITCмечеными антителами к NP вируса гриппа. Сбор данных осуществляли на проточном цитометре CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, США), анализ проводили с использованием программного обеспечения Kaluza Analysis v2 (Beckman Coulter, США).

Иммунофлуоресценция

Клетки MDCK заражали рекомбинантными штаммами или пустым вектором в дозе 1,0 ТИД₅₀/клетку и инкубировали в течение 20 ч в среде, содержащей 2% сыворотки. Для детекции белка NS1 вируса гриппа А в пермобилизованных Triton X-100 клетках использовали поликлональную сыворотку мыши и конъюгат goat-anti mouse Alexa488 (Abcam, Великобритания). Визуализацию клеток методом флуоресцентной микроскопии проводили с использованием Cytell Imaging System (Image Solutions, Великобритания).

Оценка экспрессии методом ОТ-ПЦР

Для оценки экспрессии генов врожденного иммунного ответа суточный монослой клеток А549 заражали рекомбинантными вирусными штаммами или пустым вектором в дозе 1,0 ТИД₅₀/кл. (по четыре повтора). Через 24 ч из клеток проводили экстракцию тотальной РНК с использованием набора ExtractRNA («Евроген», Россия). РНК обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКазы RQ1 (Promega, США). Реакцию ОТ проводили с использованием 1 мкг РНК, 0,5 мкг праймеров oligo-dT16 (DNA synthesis, Россия) и набора RNAscribe RT (BioLabMix, Россия). Для проведения ПЦР использовали набор BioMaster HS-ПЦР (BioLabMix, Россия) и последовательности праймеров и зондов, разработанные ранее [10]. Значения Ct были нормализованы по отношению к гену GAPDH (ген домашнего хозяйства). Относительную экспрессию рассчитывали методом ΔΔCt, принимая за единицу экспрессию целевых генов в незараженных клетках.

Лабораторные животные

Самки нелинейных мышей CD1 в возрасте 6–8 недель были приобретены в питомнике лабораторных животных «Рапполово» (Филиал НИЦ «Курчатовский институт» ПИЯФ ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская область, Россия).

Безопасность рекомбинантных векторов при интраназальном введении мышам

Вирусные штаммы вводили мышам интраназально под легкой эфирной анестезией в объеме 30 мкл с использованием механического дозатора. Рекомбинантные штаммы и пустой вектор вводили животным в дозе 5,5 log₁₀ ЭИД₅₀, вирус A/Puerto Rico/8/34, обладающий полноразмерным геном NS (PR8 wt), — в дозе 3,5 log₁₀ ЭИД₅₀.

Статистическая обработка

Статистический анализ и графическая визуализация были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc., США). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (С.О.). Для межгруппового сравнения использовали дисперсионный анализ с последующим применением теста множественного сравнения Тьюки или непараметрического теста Краскела–Уоллиса, как указано в подписях к рисункам. Значение р < 0,05 считали статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Конструирование и характеристика аттенуированных гриппозных вирусов, экспрессирующих IL1β человека

Рекомбинантные штаммы вируса гриппа, экспрессирующие IL1β, были получены на основе штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), содержащего укороченный до 124 аминокислот белок NS1 [11]. Для сборки вирусов использовали два варианта плазмиды, кодирующие модифицированный ген NS. В первом случае последовательность трансгена была вставлена после последовательности, кодирующей первые 124 аминокислоты белка NS1 вируса гриппа (NS124_SS_IL1b). Во втором варианте последовательность трансгена с сигнальным пептидом IgGκ была вставлена перед последовательностью, кодирующей вирусный белок NS124, и была отделена от него сайтом 2А, обеспечивающим ко-трансляционное разделение белков (IL1b_2A_NS124) (рис. 1А).

Для оценки генетической стабильности сохранения гетерологичной вставки в геномном сегменте NS рекомбинантные вирусные штаммы культивировали на протяжении пяти последовательных пассажей в системе РКЭ и оценивали стабильность сохранения вставки трансгена методом ОТ-ПЦР. Оба вирусных вектора были генетически стабильны, результаты ОТ-ПЦР демонстрировали соответствие длины геномного сегмента NS рекомбинантных штаммов контрольным плазмидам на всех пассажах (рис. 1Б).

Репродуктивная активность рекомбинантных штаммов в системе РКЭ и на культуре клеток MDCK была сходна. Ростовые характеристики штамма NS124_SS_IL1b не отличались от показателей исходного гриппозного штамма с укороченным белком NS1, не несущего трансген, инфекционный титр достигал 8,0 (9,0) log₁₀ ТИД50 (ЭИД50)/мл и был достоверно выше (на 1–1,5 log10), чем у рекомбинантного штамма IL1b_2A_NS124, экспрессирующего IL1β перед белком NS1 (рис. 1В). При этом способность инфицировать пермиссивную культуру у обоих рекомбинантных штаммов была сопоставима и не отличалась от исходного вируса без вставки. При заражении клеточного монослоя штаммами NS124_SS_ IL1b, IL1b_2A_NS124 и NS124 в дозе 1,0 инфекционных единиц на клетку, доля зараженных клеток составила 83 ± 3,5%, 75 ± 8,0% и 81 ± 4,0% соответственно (рис. 1Г).

Экспрессию цитокина определяли количественно с помощью ИФА в аллантоисной жидкости и супернатанте зараженных клеток MDCK. Экспрессия IL1β на культуре клеток и в эмбрионах была многократно выше для штамма IL1b_2A_NS124 (38 000 ± 2000 пг/мл; 28,0 ± 2,0 пг/мл), чем у штамма NS124_SS_IL1b (6400 ± 51 пг/мл; 1,4 ± 0,21 пг/мл) (рис. 1Д). Для интерлейкин-содержащих проб аллантоиса была определена удельная биологическая активность цитокина с помощью репортерной системы HEK-Blue IL1β. Для штамма NS124_SS_IL1b доля биологически активной формы была выше (10,0 ± 2,61 МЕ/пг), чем для IL1b_2A_NS124, у которого она составляла 2,8 ± 0,56 МЕ/пг (рис. 1Е). Тем не менее, общее количество биологически активной формы IL1β было выше у штамма IL1b_2A_ NS124, по сравнению с NS124_SS_IL1b.

Методом иммунофлюоресценции было продемонстрировано, что вставка трансгена перед последовательностью белка NS1 у штамма IL1b_2A_NS124 не препятствовала экспрессии вирусного белка NS1 в зараженных клетках (рис. 1Ж).

Активация генов врожденного иммунного ответа рекомбинантными штаммами

Для рекомбинантных штаммов, экспрессирующих IL1β человека, на клетках линии А549 была проведена оценка активации экспрессии генов внутриклеточных сенсоров RIG-I и MDA5, противовирусных белков MxA и OAS1 и цитокинов IL1β, IL6, IL18, TNFa, IL4 и IL10 в ответ на инфицирование по сравнению с исходным гриппозным вектором, не имеющим вставки трансгена.

В целом рекомбинантные гриппозные штаммы IL1b_2A_NS124 и NS124_SS_IL1b демонстрировали схожие транскрипционные профили практически по всем исследованным генам. При этом данные профили статистически значимо отличались от таковых, индуцируемых пустым вектором NS124.

Инфицирование рекомбинантными конструкциями сопровождалось повышением экспрессии IL1β, уровень которого превышал контрольные значения более чем в 100 раз. Была также показана выраженная индукция экспрессии гена IL6 (повышение более, чем в 10 раз) и гена TNFα (повышение в 3–4 раза) на достоверно более высоком уровне, чем при заражении клеток пустым вектором NS124.

Инфицирование клеток обоими рекомбинантными штаммами, так же как и пустым вектором, приводило к индукции экспрессии IL4. Уровень мРНК IL4 в случае штамма NS124_SS_IL1b был выше, однако статистически значимых отличий от двух других штаммов показано не было. Транскрипт IL10 был обнаружен только в случае заражения клеток рекомбинантным штаммом IL1b_2A_NS124.

При анализе компонентов системы распознавания патогенов в ответ на инфицирование клеток обоими рекомбинантными штаммами показано статистически значимое повышение уровней мРНК внутриклеточных сенсоров RIG-I и MDA5 относительно пустого вектора, что может указывать на усиление сигнальных путей, инициирующих врожденный противовирусный ответ.

В отношении интерферон-стимулируемых генов (ISG) было показано, что все гриппозные штаммы, независимо от наличия трансгена, активировали экспрессию генов MxA и OAS1, что согласуется с известной способностью вирусов гриппа с укороченным белком NS1 индуцировать интерфероновый ответ. Для штаммов, несущих вставку IL1β, показан достоверно более высокий уровень относительной экспрессии гена OAS1. В то время как уровень активации гена MxA не зависел от наличия в геноме вируса вставки, кодирующей IL1β, и был сопоставим для всех вирусных штаммов.

Безопасность рекомбинантных гриппозных штаммов при интраназальном введении мышам

Поскольку сконструированные рекомбинантные векторы, экспрессирующие IL1β, потенциально могут быть использованы для разработки вакцинных препаратов, одним из основных параметров являются их безопасность и сохранение аттенуированного фенотипа, обусловленного укорочением белка NS1 до 124 аминокислот. В связи с этим была проанализирована безопасность рекомбинантных штаммов по таким показателям, как снижение массы тела, летальность и вирусовыделение инфекционного вируса из респираторного тракта животных (рис. 3А).

У животных, получивших оба рекомбинантных штамма, показано незначительное снижение массы тела, сопоставимое с показателями в группе животных, получивших пустой вектор (рис. 3Б). Летальность не была зафиксирована ни в одной из групп животных, получавших штаммы с укороченным NS1-белком, в то время как в группе вируса дикого типа к 7-му дню исследования летальность составила 100%. Уровень репликации рекомбинантных штаммов в тканях легких был низкий, сопоставимый с показателями для пустого вектора. Инфекционный титр вируса для обоих штаммов был достоверно ниже (в 104 раз) по сравнению с вирусом гриппа дикого типа (рис. 3В).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В представленной работе были сконструированы рекомбинантные вирусы гриппа на основе аттенуированного вируса с укороченным белком NS1, экспрессирующие IL1β человека, отличающиеся локализацией трансгена. Показано, что встраивание трансгена в геном вируса приводит к дополнительной активации генов врожденного иммунного ответа, а положение вставки относительно открытой рамки считывания белка NS1 влияет на репродуктивные свойства штамма и уровень экспрессии целевого белка. При этом оба штамма сохраняли аттенуированный фенотип, поскольку экспрессия IL1β не компенсировала дефект белка NS1 в подавлении иммунного ответа хозяина.

Оба полученных рекомбинантных штамма были генетически стабильны, что является важным параметром для производственных штаммов, однако различались по ростовым характеристикам. Штамм NS124_SS_IL1b сохранял ростовые характеристики, сопоставимые с пустым вектором, в то время как репликативные свойства штамма IL1b_2A_NS124 были ниже на 1,0–1,5 log₁₀. Снижение ростовых свойств штамма IL1b_2A_NS124 может быть обусловлено ко-трансляционной экспрессией трансгена, поскольку в данной конструкции синтез IL1β и белка NS1 происходит как единый полипротеин с последующим расщеплением по сайту 2А, что может создавать стерические препятствия или влиять на кинетику сборки вирионов. При этом было показано, что встраивание трансгена не препятствовало инфицированию пермиссивных клеток, а также не снижало уровня экспрессии самого белка NS1.

Показано, что порядок встраивания трансгена в геном гриппозного вектора имеет важное значение для уровня экспрессии последнего [12]. Более высокий уровень продукции IL1β был показан для штамма IL1b_2A_ NS124. Полученные результаты могут объясняться тем, что в конструкции штамма IL1b_2A_NS124 трансген располагается перед последовательностью белка NS1, в результате чего может обеспечиваться его более эффективная трансляция, обусловленная ранним доступом к рибосоме и отсутствием вторичных структур, связанных с вирусной РНК. Несмотря на то что удельная биологическая активность IL1β (МЕ/пг) была выше в случае штамма NS124_SS_IL1b, общее количество функционально активного цитокина было больше для штамма IL1b_2A_NS124. Это позволяет предположить, что положение вставки трансгена может влиять не только на количественную продукцию белка, но и на посттрансляционные модификации и процессинг зрелой формы IL1β [8].

Анализ уровня экспрессии генов врожденного иммунного ответа на клетках А549 в ответ на инфицирование рекомбинантными штаммами показал качественно схожие профили активации для обеих конструкций, которые при этом достоверно отличались от показателей, в ответ на инфицирование пустым вектором NS124. Инфицирование клеток рекомбинантными штаммами NS124_SS_IL1b и IL1b_2A_NS124 приводило к повышению уровней мРНК внутриклеточных сенсоров RIG-I и MDA5, что согласуется с концепцией перекрестного взаимодействия между воспалительными сигнальными путями и системой распознавания патогенов. Активация RIG-I/MDA5 пути может усиливать положительную обратную связь, улучшающую способность клеток детектировать генетический материал вируса и инициировать каскад интерферонового ответа [13]. Активация экспрессии интерферон-стимулируемых генов в ответ на заражение рекомбинантными штаммами, экспрессирующими IL1β, и пустым вектором NS124, была различна. Так, все штаммы, в том числе и пустой вектор, активировали экспрессию MxA на сопоставимом уровне, что отражает известную способность вирусов с укороченным белком NS1 индуцировать интерфероновый ответ. Уровень экспрессии OAS1 был достоверно выше для конструкций, экспрессирующих IL1β. Данное отличие демонстрирует, что IL1β способен избирательно модулировать определенные ветви ISG-ответа, возможно через сигнальные пути, ассоциированные с NF-kB или MAPK, которые являются мишенями для сигналинга рецептора IL1 [14]. Дополнительное усиление экспрессии OAS1 может иметь физиологическое значение, поскольку белок OAS1 непосредственно участвует в деградации вирусной РНК через активацию рибонуклеазы L, что может более эффективно ограничивать репликацию вируса на ранних стадиях инфекции, обеспечивая вирусу аттенуированный фенотип [15].

Поскольку IL1β является не только иммуностимулятором, но и пирогенным фактором, необходимо было оценить сохранение аттенуированного фенотипа рекомбинантных штаммов с целью определения возможности их использования в качестве живых вакцинных штаммов. В ходе исследования было показано, что встраивание IL1β в качестве трансгена в гриппозный вектор NS124 не нарушает аттенуированный фенотип, обусловленный делецией белка NS1. В респираторном тракте мышей оба рекомбинантных штамма NS124_SS_IL1b и IL1b_2A_NS124 демонстрировали низкий уровень репликации, схожий с пустым вектором и достоверно более низкий, чем у вируса дикого типа. Несмотря на ограниченную репликацию, обусловленную делецией NS1, добавление IL1β, как показано в экспериментах in vivo, потенциирует активацию врожденного иммунитета, это позволяет предположить, что даже при низкой вирусной нагрузке экспрессия трансгена может обеспечить усиление адаптивного иммунного ответа без повышения реактогенности, ассоциированной с высокой репликацией живых вирусов. Для подтверждения данного предположения будут проведены исследования иммуногенности и протективной активности рекомбинантных штаммов in vivo. В целом, полученные нами данные согласуются с более ранними исследованиями, показавшими эффективность встраивания цитокинов (IL15, IL2 или CXCL10) в геном вируса гриппа с целью усиления иммуногенности [16–18].

ВЫВОДЫ

Полученные данные свидетельствуют, что встраивание иммуномодулирующей молекулы IL1β в геном аттенуированного вируса гриппа способно модулировать врожденный иммунный ответ и является возможной стратегией для создания живых вакцинных кандидатов с усиленной иммуногенностью без ущерба для их безопасного профиля. Однако в силу ограничений модели in vitro для определения клинической значимости и безопасности данного подхода необходима его дальнейшая апробация на животных моделях с оценкой воспроизводимости эффекта.