Рис. 1. Конструирование и характеристика рекомбинантных вирусов гриппа A, экспрессирующих IL1β. А. Схемы геномных конструкций химерного геномного сегмента NS рекомбинантных вирусов IL1b_2A_NS124 и NS124_SS_IL1b. Б. Электрофореграмма продуктов амплификации геномного сегмента NS рекомбинантных штаммов. МM — маркер молекулярного веса; Е1 — первый эмбриональный пассаж; Е5 — пятый эмбриональный пассаж; pl — контрольная плазмида. В. Репродуктивные свойства рекомбинантных вирусных штаммов в системе 10-дневных РКЭ и культуре клеток MDCK. Представлены результаты оценки инфекционной активности пятого эмбрионального пассажа, средний титр log10ЭИД50 (ТИД50) ± С.О. Г. Эффективность инфицирования клеток А549 рекомбинантными вирусными штаммами. Представлен средний процент инфицированных клеток для трех повторов ± С.О. Д. Количественное определение уровня IL1β в аллантоисной жидкости и клеточном супернатанте клеток MDCK, зараженных рекомбинантными вирусными штаммами, методом ИФА. Е. Удельная биологическая активность IL1β. Расчетное количество биологически активной формы IL1β, определенной в пролиферативном тесте с использованием репортерной системы HEK-Blue IL1β, в перерасчете на 1 пг IL1β, детектируемого методом ИФА. Ж. Репрезентативные изображения клеток A549, полученные методом флуоресцентной микроскопии. Серым цветом показаны результаты окрашивания белка NS1, выявленного с использованием Alexa Fluor 488 (488/509 нм). Увеличение ×40.

Рис. 2. Активация экспрессии внутриклеточных сенсоров (А), противовирусных белков (Б) и цитокинов (В) в клетках А549 в ответ на заражение рекомбинантными штаммами вируса гриппа, экспрессирующими IL1β. Относительная экспрессия матричной РНК (мРНК) представлена в виде средних значений для трех биологических повторов (столбики) и индивидуальных значений для каждого измерения (точки). Для оценки статистической значимости различий в нормализованных значениях ΔCt использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, тест Тьюки — для множественных сравнений (* — p < 0,05; * * — p < 0,01; * * * — p < 0,001; * * * * — p < 0,0001)

Рис. 3. Оценка безопасности рекомбинантных гриппозных штаммов, экспрессирующих IL1β, при интраназальном введении мышам. А. Схема эксперимента. Б. Динамика массы тела животных (n = 5 в группе) после интраназального введения рекомбинантных вирусов. В. Оценка вирусной нагрузки в тканях легких мышей на 3-й и 5-й дни после интраназального введения рекомбинантных вирусных штаммов, экспрессирующих IL1β. Столбики обозначают среднее значение показателя для группы (n = 4) ± С.О., точки — индивидуальные значения показателя для каждого животного. Для оценки статистической значимости различий среднегрупповых значений использовали двухфакторный дисперсионный анализ, тест Даннета — для множественных сравнений с группой контроля PR8 wt (* * * * — p < 0,0001).