Болезнь Паркинсона (БП) является вторым по распространенности нейродегенеративным заболеванием после болезни Альцгеймера и представляет собой серьезную медико-социальную проблему вследствие ее прогрессирующего течения и отсутствия методов лечения, способных остановить развитие нейродегенеративного процесса [1]. По современным оценкам, число пациентов с БП продолжает неуклонно увеличиваться во всем мире, что связано как со старением населения, так и с улучшением диагностики заболевания [2]. Основные клинические признаки БП — брадикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя и постуральная неустойчивость. Они проявляются при значительном поражении нервной системы, выражающемся в гибели дофаминергических (ДА-) нейронов черной субстанции и снижении уровня дофамина (ДА) в стриатуме [3].

Патологический процесс начинается задолго до появления первых двигательных нарушений и сопровождается сложными компенсаторными перестройками нейромедиаторных систем [4]. ДА является одним из важнейших нейромедиаторов центральной нервной системы и участвует в регуляции двигательной активности, процессов обучения, мотивации, эмоционального поведения и механизмов подкрепления. Благодаря функционированию нигростриатного пути ДА обеспечивает нормальную работу базальных ганглиев и поддержание двигательного контроля [5].

Однако состояние ДА-системы трудно оценить только по концентрации самого ДА. Важную информацию предоставляет изучение изменения уровней его метаболитов, отражающих различные этапы обмена нейромедиатора. Одним из основных продуктов внутринейронального метаболизма ДА является диоксифенилуксусная кислота (ДОФУК), образующаяся под действием моноаминооксидазы (МАО) [6]. Концентрация ДОФУК отражает активность синтеза и распада ДА и функциональное состояние терминалей ДА-нейронов [7]. 3-Метокситирамин (3-МТ) образуется из ДА, высвобожденного в синаптическую щель. В отличие от ДОФУК, данный метаболит отражает процессы внеклеточного обмена и может служить косвенным маркером высвобождения ДА. Другим важным метаболитом является гомованилиновая кислота (ГВК), представляющая собой конечный продукт катаболизма ДА. Содержание ГВК характеризует суммарный оборот ДА и широко используется как интегральный показатель активности ДА-системы [6, 7]. Важную информацию предоставляет также оценка метаболических коэффициентов, характеризующих определенные особенности оборота ДА и позволяющих лучше оценить воздействие на ДА-систему [8].

Помимо ДА-системы при БП изменения могут происходить и в других моноаминергических системах мозга [4]. Так, особое внимание уделяют серотонинергической системе (5-ГТ-системе) при БП, которая участвует в регуляции настроения, эмоционального состояния, когнитивных функций и сна. Основным метаболитом серотонина (5-ГТ, 5-гидрокситриптамин) является 5-гидроксииндолуксусная кислота (5-ГИУК), концентрация которой отражает интенсивность обмена 5-ГТ [9]. Исследование содержания 5-ГТ и 5-ГИУК позволяет оценить вовлеченность 5-ГТ-системы в патологический процесс и ее возможное участие в компенсаторных реакциях, возникающих при дефиците ДА [9].

Несмотря на значительный прогресс в клинических исследованиях, непосредственное изучение изменения динамики нейрохимических процессов в головном мозге пациентов остается крайне затруднительным. Большинство методов нейровизуализации позволяют оценивать лишь косвенные показатели функционирования нейромедиаторных систем, тогда как прямое определение концентраций нейромедиаторов и их метаболитов в тканях мозга пациентов с БП практически невозможно. Кроме того, изучение ранних стадий БП затруднено вследствие длительного продромального периода БП [10]. В связи с этим особое значение приобретают экспериментальные модели заболевания, позволяющие воспроизводить основные нейрохимические и патоморфологические признаки патологии в контролируемых условиях.

Одними из наиболее широко используемых моделей являются модели на основе введения нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП). МФТП после проникновения в мозг превращается в МФП+, который селективно накапливается в ДА-нейронах нейронах и вызывает их повреждение посредством ингибирования комплекса I дыхательной цепи митохондрий [11]. На сегодняшний день активно используют схемы острых моделей на основе МФТП [12]. Несмотря на их эффективность, они характеризуются быстрым развитием патологического процесса в мозге и не в полной мере воспроизводят медленно прогрессирующий характер БП.

В связи с этим значительный интерес представляют хронические модели БП, основанные на сочетанном введении МФТП и пробенецида. Введение пробенецида приводит к более длительному воздействию МФТП на ДА-систему в мозге за счет снижения его выведения почками [13]. В нашей работе был использован классический протокол десятикратного введения МФТП/ пробенецида мышам [14], но с меньшими разовыми дозировками токсина (12 мг/кг), что дает возможность воспроизводить более ранние этапы патологического процесса. Исходя из этого целью настоящего исследования стала оценка динамики содержания ДА, 5-ГТ и их основных метаболитов в стриатуме мышей с хронической токсической моделью БП, индуцированной введением МФТП в сочетании с пробенецидом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Хроническая модель БП, индуцированная курсовым введением МФТП/пробенецид

Для проведения экспериментов использовали самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 8–10 недель в начале эксперимента и весом 22–25 г. Животных содержали по 7–8 особей в клетке в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и стандартному корму и 12-часовым циклом освещения (включение света в 8:00, выключение в 20:00). Для минимизации неспецифической реакции животных проводили предварительный хендлинг в течение 2 недель. По окончании хендлинга рандомизированно распределяли и формировали группы животных с учетом таких параметров, как длина пройденной дистанции и масса тела животного. Длину пройденной дистанции оценивали с использованием ПО «IC Capture 2.4» (The Imaging Source, LLC, США) [15] и ПО «Минотавр» (ООО «Нейроботикс», РФ).

Животные (n = 120) были разделены на контрольную (NaCl, n = 60) и на экспериментальную (МФТП, n = 60) группы, а затем на подгруппы (n = 10) в зависимости от времени вывода из эксперимента: через неделю, месяц, 1,5 месяца, 2 месяца, 3 месяца и 6 месяцев соответственно.

Для создания хронической модели БП использовали комбинацию МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6тетрагидропиридин) (USP, Sigma-Aldrich, США) и пробенецида (USP, Sigma-Aldrich, США) [14, 16]. Так, экспериментальным животным вводили пробенецид в дозе 250 мг/кг внутрибрюшинно, а через 30 мин — МФТП подкожно в дозе 12 мг/кг. Всего было сделано 10 инъекций через каждые 3,5 дня (рис. 1).

Животным в контрольных группах для каждой временной точки по аналогичной схеме вводили физиологический раствор. Вывод животных из эксперимента контрольных и экспериментальных групп проводили путем цервикальной дислокации через соответствующее время после последней инъекции МФТП/пробенецида: 1 неделя, 1 месяц, 1,5 месяца, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев. Для дальнейшей работы отбирали образцы стриатума от каждого животного, которые замораживали в жидком азоте, и затем хранили при –70 °С.

Определение уровня дофамина, серотонина и их метаболитов в стриатуме

Содержание катехоламинов в стриатуме мышей определяли хроматографически [17]. Гомогенизацию и экстракцию тканей головного мозга проводили в 0,1 М растворе НСlO₄ с добавлением 250 пМ/мл 3,4-дигидроксибензиламина в качестве внутреннего стандарта. Образцы центрифугировали при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °C. Содержание катехоламинов и их метаболитов определяли в супернатанте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ионно-парной хроматографии) с электрохимическим детектированием на жидкостном хроматографе System Gold (Beckman Coulter, Inc., США), оснащенном инжектором Rheodyne 7125 (США) с петлей для образцов объемом 20 мкл. Исследуемые вещества разделяли на обращеннофазовой колонке Nucleodur C18 Gravity, 4,6 × 250 мм, диаметр пор — 5 мкм (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Германия). Подвижная фаза (0,1 М цитратно-фосфатный буфер pH 3,0, содержащий 1,1 мМ октансульфоновой кислоты, 0,1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила) со скоростью потока 1 мл/мин при давлении 200 атм достигалась с помощью насоса System Gold 125 (Beckman Coulter, Inc., США). Измерения проводили с использованием электрохимического детектора EC3000 (RECIPE Chemicals + Instruments GmbH, Германия), оснащенного ячейкой ClinLab ECD, модель Sputnik, с рабочим электродом из стеклоуглерода (+0,85 В) и электродом сравнения Ag/AgCl. Регистрацию образцов и обработку хроматограмм выполняли с помощью программного обеспечения Multichrom v.1.5 (Ampersand, Россия).

По результатам анализа были получены данные об уровнях ДА и его метаболитов — ДОФУК, 3-MT и ГВК, а также 5-ГТ и 5-ГИУК. Кратные изменения показателей для каждого соединения на каждой временной точке рассчитывали как отношение показателя в экспериментальной и контрольной группе с помощью программного обеспечения MS Excel 2016 (Microsoft, США). Данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения. Уровень значимости (p Value, p) рассчитывали с применением непараметрического U-теста Манна–Уитни и использованием пакета программ “Statistica for Windows 8.0” (StatSoft, Inc. (2007), STATISTICA (version 8.0. www. statsoft.com, США). Различия между группами признаны достоверными при значении р < 0,05. Метаболические коэффициенты рассчитывали как отношение ДОФУК к ДА, 3-МТ к ДА, ГВК к ДА, 5-ГТ к 5-ГИУК, соответствующие метаболические коэффициенты в контроле приняты за 100%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценку состояния ДА- и 5-ГT-систем при моделировании БП у мышей проводили на основе анализа изменения уровней ДА и его метаболитов (ДОФУК, 3-МТ, ГВК), а также 5-ГT и 5-ГИУК в стриатуме мышей с хронической моделью БП. Профиль изменений уровней этих метаболитов представлен в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наиболее выраженные нейрохимические изменения ожидаемо наблюдались для ДА-системы и в наибольшей мере касались содержания ДА и его основного метаболита — ДОФУК. Для них была показана сходная динамика изменений на всем протяжении эксперимента за исключением временной точки 1,5 месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида. Так, наиболее выраженное снижение уровней этих соединений наблюдалось через неделю после курса инъекций МФТП/ пробенецида: в 2,8 раза для ДА и в 3,1 раза для ДОФУК. Примечательно, что уровни ДА и ДОФУК оставались сниженными в течение 3 месяцев и восстанавливались до уровня контроля только к 6 месяцам после завершения курса инъекций МФТП/пробенецида (табл. 1).

Для двух других метаболитов ДА (3-МТ и ГВК) не было выявлено столь резких изменений их уровней в ходе моделирования БП. Для ГВК снижение его уровня относительно контроля в стриатуме мышей наблюдали через неделю и 3 месяца после курса инъекций МФТП/ пробенецид, а уровни 3-МТ не отличались от контрольных показателей на всем протяжении регистрации биохимических изменений.

Изменение состояния 5-ГT-системы в стриатуме мышей с хронической токсической моделью БП носило гораздо менее выраженный характер (табл. 1). Статистически значимое повышение уровня 5-ГТ и 5-ГИУК наблюдали через месяц и снижение уровня 5-ГИУК через 3 месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида.

Был также проведен анализ изменения оборота ДА и 5-ГТ в течение всего периода регистрации изменений. Рассчитаны метаболические коэффициенты, отражающие динамику изменений метаболизма 5-ГТ (табл. 2), а также внеклеточные и внутриклеточные особенности метаболизма ДА (табл. 2 и рис. 2). Стоит отметить, что при оценке оборота 5-ГТ не было выявлено его существенных изменений на всем периоде регистрации показателей, за исключением временной точки 3 месяца, на которой было выявлено снижение оборота 5-ГТ на 69,5% относительно контроля.

Как видно из графика, представленного на рис. 2, наиболее выраженное увеличение оборота ДА по сравнению с контролем наблюдалось для 3-МТ/ДА и ГВК/ДА, которое сохранялось до 3 месяцев после курса инъекций МФТП/пробенецида и приходило в норму к 6 месяцам. Для ДОФУК/ДА отмечена иная динамика изменений. Ускорение оборота ДА по этому показателю наблюдалось только через 1,5 месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида и составило 134,98% относительно контроля. На остальных временных точках оборот ДА или не отличался от уровня контроля (2 месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида), или находился незначительно ниже уровня контроля через 1 неделю, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев после курса инъекций МФТП/пробенецид в пределах 20% относительно контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании проведена оценка метаболизма ДА и 5-ГТ в стриатуме мышей с хронической моделью БП, позволяющая проанализировать, в первую очередь, состояние ДА-системы при хроническом моделировании ранних этапов БП. В нашей работе был использован протокол, основанный на известной схеме десятикратного сочетанного введения МФТП с пробенецидом [14], но с применением гораздо меньших разовых доз токсина, которые при остром введении препарата позволяют воспроизводить раннюю симтомную стадию БП [18]. Такой модифицированный протокол классической хронической модели БП дает возможность воспроизводить более ранние этапы патогенеза данного заболевания.

Наиболее значительное падение содержания ДА в стриатуме было выявлено через 1 неделю и 1 месяц после последней инъекции МФТП/пробенецид соответственно на 63,6 и 41,5% по сравнению с контролем (табл. 1, рис. 2), что можно рассматривать как развитие фенотипа ранней клинической или поздней продромальной стадии БП. Подобное снижение уровня главного нейромедиатора ДА-системы в стриатуме пациентов характерно для ранней симптомной стадии БП (стадии 0–1 по шкале Хен–Яра), которое может варьироваться от 45,3% по последним данным [19] до 60–80% в более ранних исследованиях [20]. Также наши данные согласуются с данными, полученными на других моделях, воспроизводящих ранние стадии паркинсон-подобного фенотипа как у грызунов, так и у приматов [18, 21, 22]. Примечательно, что сниженный уровень ДА сохраняется вплоть до 3 месяцев после курса инъекций МФТП/пробенецида и восстанавливается до уровня контроля только к 6 месяцам. Наблюдаемая картина изменений уровня ДА может указывать, с одной стороны, на высокую пластичность нигростриатной системы и способность сохранившихся нейронов частично компенсировать утрату терминалей ДА-нейронов у мышей с МФТП-индуцированным паркинсон-подобным фенотипом [23, 24]. С другой стороны, выявленная динамика медленного подъема уровня ДА может быть обусловлена восстановлением функции ДА-нейронов, подвергшихся дегенеративным процессам [25]. Таким образом, период от одной недели до 3 месяцев после курса инъекций МФТП/пробенецида можно рассматривать в качестве аналога ранней симптомной и поздней досимптомной стадии БП, что открывает возможности для тестирования и разработки терапии.

Изменение содержания ДОФУК в стриатуме во многом повторяло динамику изменения уровней ДА (табл. 1) и характеризовалось падением на протяжении 3 месяцев после курса инъекций МФТП/пробенецида. Известно, что ДОФУК является основным внутринейрональным метаболитом ДА и образуется под действием МАО после его обратного захвата и внутриклеточного метаболизма [7]. Показано, что снижение уровня ДОФУК предшествует гибели ДА-нейронов и является маркером начальных стадий патогенеза БП [26]. Также ДОФУК тесно коррелирует со степенью сохранности ДА-терминалей и может служить чувствительным индикатором функционального состояния нигростриатной системы [27]. Снижение уровня ДОФУК на протяжении 3 месяцев после курса инъекций МФТП/ пробенецида можно рассматривать как одно из ранних проявлений нейродегенерации ДА-системы.

ГВК является конечным продуктом катаболизма ДА, а его уровень отражает суммарную активность метаболизма ДА. Снижение уровня ГВК на ранних сроках после курса инъекций МФТП/пробенецида соответствует периоду максимального дефицита ДА и указывает на дисфункцию ДА-системы в стриатуме. Выявленное снижение уровня ГВК на временной точке 3 месяца может свидетельствовать о том, что несмотря на развитие компенсаторных процессов и постепенное восстановление функционирования ДАсистемы, метаболизм ДА остается нарушенным (табл. 1).

Дополнительную информацию о состоянии ДА-системы представляет анализ метаболических коэффициентов ДОФУК/ДА, 3-МТ/ДА и ГВК/ДА (табл. 2, рис. 2). Данные показатели используют в экспериментальной нейрохимии как маркеры интенсивности разных аспектов оборота ДА [28]. Так, метаболический коэффициент ДОФУК/ДА характеризует внутриклеточный обмен ДА, 3-МТ/ДА — внеклеточный оборот ДА, а ГВК/ДА — суммарный оборот ДА.

Динамика изменения этих показателей в течение первого месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида существенно различается и характеризуется снижением оборота внутриклеточного ДА (по ДОФУК/ДА) (89,34 и 87,12%) и резким усилением внеклеточного оборота ДА, о чем можно судить по увеличению 3-МТ/ДА (228,17 и 176,14%) относительно контроля на временных точках 1 неделя и 1 месяц соответственно (табл. 2, рис. 2). Наши данные согласуются с данными независимых исследований, где показано, что функционирование ДА-системы сопровождается перестройкой метаболизма ДА при БП и изменением функциональной активности сохранившихся нейронов [7]. Полученные нами данные позволяют говорить о том, что снижение оборота ДА внутри клетки может быть связано не со снижением интенсивности метаболизма как таковым, а с тем, что ДА в большей степени сохраняется для рециркуляции и релиза в синаптическую щель и сохранения ДА-передачи. При этом резкое повышение метаболических коэффициентов 3-МТ/ДА и ГВК/ДА указывает на усиление катаболизма ДА вне клетки, то есть при синаптической передаче сигнала, что говорит о развитии нейродегенеративных процессов и нарушении обмена ДА в синаптическом пространстве. Аналогичные изменения описаны как в исследованиях, проводимых на хронической МФТП/ пробенецид-индуцированной модели, так и на других экспериментальных моделях паркинсонизма, где восстановление содержания ДА не сопровождалось полной нормализацией его обмена и рассматривалось как проявление сохраняющейся дисфункции ДА-системы [14, 23]. Отдельно следует рассмотреть временную точку 1,5 месяца, на которой было выявлено существенное повышение всех трех метаболических коэффициентов и, соответственно, наиболее выраженное ускорение оборота ДА как внутри клетки, так и в синаптическом пространстве (табл. 2, рис. 2). Эти данные указывают на развитие выраженных нейродегенеративных изменений. Подобные изменения показателей обмена ДА ранее описаны в работах по моделированию БП, а также в исследованиях пациентов с различными стадиями заболевания [7]. Примечательно, что показатели внеклеточного оборота ДА и совокупного оборота ДА приходят в норму только к 6 месяцам после курса инъекций МФТП/пробенецида, тогда как внутриклеточный оборот ДА остается сниженным (на 19,25% относительно контроля) даже через полгода после завершения курса инъекций МФТП/пробенецид, что может указывать на отсутствие полного восстановления внутриклеточной части оборота ДА.

Изменения 5-ГТ-системы были гораздо менее выражены по сравнению с ДА-системой (табл. 1 и табл. 2). Тем не менее, достоверное повышение содержания 5-ГТ и 5-ГИУК по сравнению с контролем через 1 месяц после курса инъекций МФТП/пробенецида может свидетельствовать о вовлечении 5-ГТ-нейронов в процессы адаптации к дефициту ДА в стриатуме. В настоящее время считается, что 5-ГТсистема способна участвовать в компенсации нарушений ДА-системы посредством усиления активности базальных ганглиев и высвобождении ДА из сохранившихся терминалей [29].

ВЫВОДЫ

Таким образом, следует обратить внимание на следующие особенности изменений, происходящих в стриатуме на ранних этапах формирования паркинсон-подобного фенотипа. Во-первых, полученные данные указывают на снижение совокупного метаболизма дофамина как в терминалях нейронов, так и в синаптическом пространстве, что отражает нейродегенеративное воздействие на эти структуры в течение первого месяца после курса инъекций МФТП/пробенецида. На значительную дисфункцию именно ДА-системы указывает также повышение уровней 5-ГТ и его метаболита для компенсации дефицита ДА в стриатуме. Во-вторых, изменение соотношения ДОФУК/ ДА можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный на сохранение главной функции ДАнейронов — передачу сигнала путем релиза доступного ДА в синаптическую щель, за исключением временной точки 1,5 месяца, когда было выявлено наибольшее проявление действия нейродегенеративных факторов. В-третьих, можно говорить о том, что полученная модель позволяет расширить окно проявления нейродегенеративных изменений до 3 месяцев, что является заметным преимуществом перед острыми и субхроническими моделями и позволяет изучать ранние этапы нейродегенерации в течение существенно более продолжительного промежутка времени. В-четвертых, полученные нами данные в очередной раз демонстрируют сложную картину действия нейродегенеративных и компенсаторных процессов, происходящих на самых ранних этапах нейродегенерации при БП.