Регулирование всех фармакокинетических параметров лекарственного средства (всасывания, распределения, выведения и биотрансформации), обеспечение селективного действия на целевые органы и мишени наряду с безопасностью и минимизацией нежелательных реакций и побочных эффектов являются главными задачами фармацевтической отрасли. Одним из трендов на сегодняшний день является применение наноструктурных компонентов, в частности, для направленной доставки лекарственных средств (ЛС) в заданную область организма, органа или клетки. В законодательстве Российской Федерации отсутствуют понятия «нанопрепаратов» или «нанолекарств», фактически к ним относят лекарственные препараты (ЛП), представляющие собой или содержащие в своем составе наночастицы. Преимущественно данное определение используют в отношении форм ЛС на основе липосом и мицелл, в этих случаях наноструктуры выполняют функции транспорта активного вещества внутри организма, пролонгации всасывания, повышения стабильности и т. д., или для ЛС, обладающих наноструктурой в связи с физико-химическими особенностями действующих веществ (например, препараты железа для лечения анемии могут содержать атомы железа (III), стабилизированного углеводным комплексом, что определяет их наноколлоидную структуру). В настоящее время мы разрабатываем руководство по оценке качества и исследованию лекарственных средств на основе липосом, мицелл и содержащих наночастицы.

Особенности состава нанопрепаратов обусловливают индивидуальные подходы к оценке их качества. Например, отдельные специфические показатели липосомных препаратов (размер наночастиц, морфология поверхности, поверхностный заряд) определяют их качество, поскольку могут оказывать большое влияние на следующие фармакокинетические и фармакодинамические свойства in vivo:

• скорость высвобождения действующего вещества из липосом, что может влиять на фармакокинетику (ФК) и фармакодинамику (ФД) и, таким образом, на профиль безопасности и эффективности ЛП;
• биологическую доступность активного вещества, заключенного в липосому, его биотрансформацию и выведение.
  ФК инкапсулированного вещества зависит от ФК носителя, которая обусловлена физико-химическими свойствами материала наночастицы, также следует учитывать взаимодействия между компонентами наночастицы, действующим веществом и биологической средой организма.

К нанопрепаратам авторы относят препараты, содержащие дендримеры, нанокристаллы, мицеллы, липосомы, а также полимерные наночастицы. В настоящее время липосомы — одни из наиболее изученных наночастиц, которые можно рассматривать как эффективные средства доставки различных ЛП. За последние годы мировая фармацевтическая промышленность выпустила более 20 липосомных препаратов, которые применяют преимущественно в онкологии (Dauno Xome (Gilead, NeXstar), Doxil (Alza, Sequus), Сaelух (Schering-Plough), Муосet (Elan, ТLС)) или в лечении грибковых инфекций (AmBisome, ABELSET (Gilead, NeXstar)) [1]. Учитывая особенности транспорта, транслокацию через гистогематические барьеры, клеточные мембраны и метаболические трансформации, липосомные фармакологические препараты обладают уникальными свойствами, связанными, прежде всего, с особенностями их ФК.
В статье обобщены и проанализированы данные по применению различных типов липосом для доставки ЛП, а также определены особенности оценки качества липосомных нанопрепаратов.

Разновидности липосом и их применение в фармации

Липосомы — везикулярные структуры, содержимое которых ограничено липидной мембраной, образуемой амфифильными молекулами. В последнее время липосомы превратились из простой модели, имитирующей клеточные мембраны, в объект активных научных исследований и практического применения [2]. Главная цель использования липосом в качестве носителей ЛП заключается в селективном накоплении действующих веществ в патологических очагах (опухолях, воспаленных тканях), что связано с такой способностью липосом, как пассивное нацеливание: размер пор между капиллярами в очагах воспаления или в опухолях (210–1000 нм) значительно превышает размер пор в нормальных тканях и органах (около 40 нм). Таким образом, липосомы размером менее 200 нм не могут выйти из кровотока нигде, кроме как в зонах воспаления (исключение составляет мозг, в котором, как правило, опухоль имеет меньшие поры,
равные 7–100 нм [3, 4]), а у активного вещества, заключенного в липосомы, меньше возможности достичь органов, где оно может оказать токсическое действие. Так, например, липосомный доксорубицин проявляет в 2–3 раза меньшую токсичность по сравнению с раствором препарата [5].

В случае направленного липосомного транспорта применение антител к эндотелиальным белкам-мишеням, селективным для сосудов различных органов, позволяет многократно повысить адресность наноконтейнерной доставки биологически активных веществ и ДНК
[6–9].

К настоящему времени описаны липосомные препараты самых разнообразных фармакологических средств, рентгенологических и сцинтиграфических трейсеров, токсинов, пептидов, белков и нуклеиновых кислот. Подавляющее большинство работ подобного рода проводили с противоопухолевыми препаратами (чаще всего, с антрациклиновыми) [8]. Наиболее часто в исследованиях по доставке лекарств использовали следующие пять типов липосом, отличающихся составом и действием in vivo: простые липосомы; стерически стабилизированные липосомы; направленные липосомы (иммунолипосомы); катионные липосомы; липосомы, чувствительные к физическим и химическим стимулам, таким как температура, свет и изменения значения pH [2, 10] (табл. 1).

Особую роль липосомы стали играть в связи с появлением нового поколения препаратов, получаемых методами биотехнологии и генной инженерии, таких как рекомбинантные белки, пептиды (биотехнологические ЛП), а также препараты на основе нуклеиновых кислот (генотерапевтические ЛП) в связи с чувствительностью указанных препаратов к химическому и ферментативному гидролизу [8, 39–41]. В случае генотерапии in vivo липосомные наноконтейнеры могут содержать плазмиду с последовательностью терапевтического гена, антисенс олигонуклеотиды или малые интерферирующие РНК [42–44]. Объем липосом позволяет включать в них гены различного размера [45]. Как и в случае с цитостатическими препаратами и парамагнитными контрастами, адресность доставки может быть достигнута с помощью векторных молекул, ковалентно пришитых к наружной поверхности липосом.

При использовании липосом в качестве ДНК-вакцин они удерживают антиген в своей капсуле и выполняют двойную функцию, выступая в качестве носителя антигена вакцины и иммуномодулятора [46, 47]. В одной из работ в качестве ДНК-вакцины использовали последовательность S-антигена вируса гепатита В (pRc/CMV HBS), заключенного в катионные липосомы [47]. Мыши Balb/c были вакцинированы внутримышечно дважды на 0 и 21-й дни 10 мкг плазмидной ДНК на мышь. Уровни определяемых цитокинов в селезенке иммунизированных липосомным препаратом мышей после введения нативного HBsAg был в 4 раза выше уровня цитокинов у интактных мышей и животных, вакцинированных ДНК, что свидетельствует о возможности использования данной липосомной конструкции для вакцинации против гепатита В.

Для загрузки ДНК можно применять липосомы как с нейтрально заряженной наружной поверхностью, так и катионные или анионные липосомы. Преимуществом нейтральных липосом является то, что они гораздо дольше циркулируют в кровотоке, чем заряженные, обладают меньшей токсичностью и неспецифической сорбцией в органах и тканях. Однако их гораздо сложнее загрузить ДНК. При пассивной загрузке (т. е. при простом эмульгировании липидных компонентов в присутствии ДНК) в липосомы попадает лишь 10% от общего количества ДНК, при использовании специальных приемов степень загрузки возможно увеличить до 40% и выше, однако при использовании этих приемов, как правило, получаются липосомы крупного размера [45]. Высокая степень загрузки ДНК является основным преимуществом заряженных липосом. Недостатками катионных и анионных липосом является более высокая, чем у неполярных липосом, токсичность и неспецифическое проникновение в органы и ткани.

Особенности контроля качества производства и готовых липосомных форм ЛП

Основные этапы технологического процесса получения липосомных форм ЛП и контролируемые параметры следующие [48]:

1) получение липидной пленки и ее диспергирование/ деградация. Контролируемые параметры: количество остаточных органических растворителей в липидной пленке, процент включения активного вещества и размер липосом после диспергирования липидной пленки, стабильность, значение рН;
2) получение липосом заданного размера, отделение невключенного активного вещества, стерилизация методом фильтрации. Контролируемые параметры: количество включенного активного вещества и размер липосом, концентрация липидных компонентов, стабильность, значение рН;
3) лиофилизация. Контролируемые параметры: остаточная влажность, стабильность и процент включения ЛП в липосомы после регидратации лиофилизата.

Из перечисленных этапов технологического процесса можно заключить, что критические точки контроля качества липосомного препарата связаны с определением его значимых физико-химических свойств, поэтому при подаче досье для государственной регистрации липосомных форм ЛП необходимо изучить следующие общие параметры (рисунок).

Одним из основных параметров, оказывающих влияние на ФК и ФД липосомных форм ЛП, является поведение активного вещества в физиологическом окружении, поэтому необходимо разработать надежные валидированные методы оценки высвобождения активного вещества in vitro для следующих целей:
– мониторинг имитации высвобождения действующего вещества из липосом в организме. При наличии оснований допустимо испытание на «вытекание» in vitro в релевантной среде при различных условиях (например, в диапазоне температур и значений pH);
– мониторинг стабильности при хранении для обеспечения постоянства серий;
– исследование стабильности и процесса приготовления в предполагаемых условиях применения.

В табл. 2 в качестве примера представлены основные показатели качества и параметры для паспортизации липосом [49, 50], используемых для доставки ДНК терапевтических генов.

Авторы полагают, что в зависимости от конкретной функции липосом (например, модификации распределения действующего вещества путем инкапсуляции в целях улучшения профиля безопасности) при разработке препарата следует также оценивать следующие дополнительные параметры:

– поддержание целостности липосомной готовой формы в плазме;
– характеристика процесса фазового перехода липидного бислоя (температура и энтальпия переходов);
– определение поверхностного заряда липосом;
– pH внутренней камеры липосом, наполняемых по градиенту pH;
– если значимо, установление характеристик физического состояния активного вещества внутри липосомы (например, в случае доксорубицина — образование осадка);
– распределение активного вещества (например, на поверхности липосом, в бислое, внутренней среде и т. д.);
– в отношении конъюгированных (например, пегилированных) липосомных препаратов: качество и чистота пегилированного исходного материала, молекулярная масса конъюгированного липида и распределение по размеру (дисперсность), расположение ПЭГ на поверхности, стабильность конъюгата.

Необходимо определить перечень испытаний, которым планируется подвергать каждую серию липосомного препарата рутинно. Данный перечень должен основываться на параметрах, использованных для характеристики препарата в соответствии с вышеописанными требованиями.

Нормативно-правовое регулирование липосомных препаратов в мире

Примеры требований мировых регуляторных органов к производству, контролю качества, проведению доклинических и клинических исследований липосомных форм ЛП приведены в документах, представленных в табл. 3.

ВЫВОДЫ

Липосомные системы доставки позволяют разработчику изменять и контролировать параметры всасывания и высвобождения действующего вещества. Лекарственные формы на основе липосом, как правило, отличаются меньшей токсичностью, возможностью адресной доставки лекарственного средства и меньшим риском развития нежелательных реакций. Использование инновационных препаратов, содержащих липосомы, конъюгированные с антителами, позволяет максимально точно определить локус высвобождения активного компонента. Однако увеличение сложности структуры препарата неизбежно приводит к увеличению числа критических точек производства, а также к расширению списка параметров, подлежащих контролю, которые являются показателями качества. Наряду с использованием классических методов контроля качества, оценивают также физико-химические свойства липосомной фракции: форму, размер и заряд частиц; эффективность конъюгации маркеров; равномерность распределения действующего вещества. Ключевые методы оценки параметров липосом основаны на оптических эффектах: динамическое и лазерное светорассеяние, электронная микроскопия.