Сезонный аллергический риноконъюнктивит (САР), или поллиноз, — одно из наиболее распространенных аллергических заболеваний. В странах Европы его распространенность достигает, по разным оценкам, 17–28% от популяции [1]. Значительная часть пациентов с поллинозом (8–16% от всего населения) сенсибилизирована к пыльце деревьев, и наиболее распространенным аллергеном является пыльца березы [2]. САР, как и другие аллергические заболевания, у большинства больных имеет хроническое течение, с высокой вероятностью развития сопутствующих патологий, таких как астма и пищевая аллергия. При этом наиболее широко применяемые терапевтические средства направлены лишь на облегчение тяжести симптомов заболевания (антигистаминные и глюкокортикостероидные препараты, стабилизаторы мембран тучных клеток). Аллергенспецифичная иммунотерапия — единственный современный подход к лечению САР, направленный на долгосрочное изменение хронического течения заболевания. Она требует длительного курса лечения, тщательного соблюдения пациентами режима, и лишь у части пациентов приводит к полному исчезновению симптомов [3]. В силу этого, разработка новых терапевтических подходов, направленных на предотвращение хронического течения САР, является крайне актуальной задачей.
Рациональный дизайн таких подходов требует глубокого понимания механизмов поддержания иммунологической памяти, обусловливающей хроническое течение аллергии. Ряд недавних неудачных клинических испытаний методов терапии аллергического ринита демонстрируют недостаточность имеющихся сведений об этих механизмах [4, 5]. Фундаментальные исследования, направленные на более глубокое изучение механизмов сохранения иммунологической памяти, обусловливающей хроническое течение аллергии, являются необходимым базисом как для разработки новых терапевтических подходов для лечения САР, так и для совершенствования существующих.

Известно, что одним из ключевых агентов в развитии аллергического ответа является аллергенспецифичный иммуноглобулин класса E (IgE). Однако клеточные субпопуляции, продуцирующие IgE при аллергическом рините, остаются слабо охарактеризованными — не ясны их локализация, длительность существования, необходимые факторы для их поддержания. С использованием мышиной модели пищевой аллергии недавно было показано, что вскоре после сенсибилизации IgE-секретирующие плазматические клетки могут быть обнаружены в костном мозге и имеют ограниченный период жизни (до года) [6]. Антитела класса IgE при этом могут сохраняться до 100 дней связанными на мембранах тучных клеток. Показано также, что, по крайней мере, часть долгосрочной иммунологической памяти, обусловливающей хроническое течение аллергии, обеспечена субпопуляцией IgG1+ аллергенспецифических B-лимфоцитов памяти, служащей «резервуаром», из которого пополняется популяция IgE- продуцентов в случае контакта организма с аллергеном [6, 7].
Целью данной работы было более детальное, по сравнению с ранее проведенными исследованиями [8–10], изучение динамики сывороточного уровня IgE у пациентов с аллергией на березовую пыльцу в зависимости от интенсивности контакта пациента с аллергеном, обусловленной уровнем аллергена в воздухе. В рамках исследования мы стремились ответить на вопрос, в какой момент времени относительно контакта с аллергеном, может происходить пополнение IgE-секретирующей фракции клеток, и охарактеризовать представленность и связь с другими изотипами и субпопуляцией В-клеток памяти клонов IgE-секретирующих плазмобластов и плазматических клеток периферической крови пациентов на фоне сезонного обострения заболевания.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Выборка пациентов и сбор образцов сыворотки

Исследуемая группа включала трех пациентов (22, 22 и 28 лет). Критерии включения пациентов в исследование: 1) пациенты обоих полов; 2) наличие ранее клинически установленного диагноза «сезонный аллергический ринит на березовую пыльцу»; 3) отсутствие диагноза «бронхиальная астма»; 4) отсутствие других хронических воспалительных, аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний. Критерии исключения:
1) прохождение пациентом курса аллергенспецифической иммунотерапии до или в период проведения исследования; 2) прохождение вакцинации в период проведения исследования. Забор образцов венозной крови производили в медицинских лабораториях и медицинским персоналом сети КДЛ «ИНВИТРО» с использованием пробирок Vacuette Serum Gel Z и Vacuette K3EDTA (BD Biosciences; США). Дальнейшую экспериментальную работу проводили в условиях научно-исследовательской лаборатории ИБХ РАН.
Сбор образцов сыворотки крови для измерения уровня общего IgE и уровня специфичных к пыльце березы и ольхи IgE проводили, начиная с марта по май 2019 г. с интервалом в две недели (суммарно 6 образцов для каждого донора). Для одного из доноров (28 лет) были дополнительно собраны образцы сыворотки в марте и мае 2017, а также в марте и мае 2018 г.

Иммуноферментный анализ

Выделение сыворотки осуществляли в соответствии с протоколом производителя пробирок (BD Biosciences; США). Иммуноферментный анализ для определения уровня общего IgE и уровня специфичных к пыльце березы и ольхи IgE проводили при помощи коммерчески доступных наборов для ИФА (Алкор Био; Россия) согласно протоколу производителя. Измерение оптической плотности проводили с помощью планшетного ридера Hidex Sense (Hidex Oy; Финляндия). Для каждого образца сыворотки выполняли ИФА в двух независимых повторах.

Выделение субпопуляций B-лимфоцитов памяти, плазмобластов и плазматических клеток

Для одного из доноров (28 лет) в трех временных точках (март и май 2017, март 2018) были получены образцы трех клеточных субпопуляций B-клеточного происхождения — B-лимфоцитов памяти, плазмобластов и плазматических клеток периферической крови.
Из образца цельной крови донора выделяли фракцию мононуклеарных клеток периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла на центрифуге Eppendorf 5804 при 310 g в течение 20 мин (Eppendorf; Германия). Далее клетки окрашивали при помощи набора флуоресцентно-меченых антител к мембранным маркерам человека: anti-CD19-APC, anti-CD20-VioBlue, anti-CD27-VioBright FITC, anti-CD138-PE-Vio770 (Myltenyi Biotec; США), после чего при помощи флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (BD FacsAria III, BD Biosciences; США) были выделены целевые субпопуляции B-клеточного происхождения: B-лимфоциты памяти (CD19+ CD20+ CD27+), плазмобласты (CD20– CD19+ CD27++ CD138–) и плазматические клетки (CD20– CD19 Low/– CD27+ CD138+). Для каждой временной точки собирали по два образца B-лимфоцитов памяти (по 50 000 клеток), плазмобластов и плазматических клеток (по 1000 и по 500 клеток соответственно).

Секвенирование и анализ репертуаров B-клеточных рецепторов

Подготовку библиотек кДНК тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgH) проводили в соответствии с опубликованным ранее протоколом [11], используя ряд модификаций. На этапе обратной транскрипции вводили адаптер с уникальным молекулярным идентификатором (UMI) и баркодом образца (табл. 1). Дальнейшую амплификацию проводили в два этапа с использованием праймеров, описанных в табл. 1. Секвенирование проводили на приборе Illumina Hiseq 2000/2500 (Illumina; США), парное чтение длиной 310 + 310 нуклеотидов.
Разделение общего массива секвенирования по соответствующим образцам и сборку консенсусных последовательностей на основе уникальных молекулярных идентификаторов проводили при помощи программы MIGEC [12]. Аннотацию V-, D- , J- и C-сегментов, определение уникальных клональных последовательностей IGH (клонотипов) и оценку уровня гипермутаций проводили с использованием программы MIXCR [13]. Для сборки клональных последовательностей IGH использовали чтения, соответствующие последовательностям кДНК IGH, прочитанных как минимум дважды на основе результатов анализа последовательностей молекулярных баркодов. При этом в качестве клонотипа рассматривали нуклеотидную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулинов, начиная от каркасного участка 1 (FR1) V-сегмента до конца J-сегмента, с учетом изотипа антитела, определяемого по 5'-фрагменту С-сегмента длиной 15–16 нуклеотидов. Анализ репертуаров, статистическую обработку результатов и регрессионный анализ проводили с использованием языка программирования R [14], иллюстрации подготовлены с использованием пакета ggplot2 [15]. Клональные группы определяли при помощи программы Change-O [16] по следующим критериям: в одну клональную группу входили все последовательности с одинаковой длиной CDR3 и V-сегментом IGH, и отличавшиеся не более чем на 15% по нуклеотидной последовательности CDR3 IGH. Филогенетический анализ проводили с использованием программы MEGA 7 [17] (филогенетические деревья максимального правдоподобия, эволюционная модель GTR).

Регрессионный анализ

Для проверки гипотезы о наличии согласованной динамики сывороточного уровня sIgE к березовой пыльце и уровня пыльцы березы в воздухе была разработана регрессионная модель. Исходные данные для построения модели представлены в табл. 2. Уравнение регрессии:

sIgE_level = b + k1 × pollen_level + k2 × donorMRK + k3 × donorLK,

где sIgE_level — зависимая переменная, сывороточный уровень аллергенспецифичного IgE к аллергенам березовой пыльцы; pollen_level — переменная-предиктор, средний уровень пыльцы березы в воздухе (класс) в течение двух недель перед забором соответствующего образца крови для измерения сывороточного уровня IgE; donorMRK — искусственная переменная-предиктор, принимающая значения 1 (донор MRK) и 0 (донор не MRK); donorLK — искусственная переменная-предиктор, принимающая значения 1 (донор LK) и 0 (донор не LK); b — свободный член уравнения регрессии, отражающий базальный уровень зависимой переменной, характерный для донора MS; k1, k2, k3 — коэффициенты уравнения регрессии (k1 отражает изменение зависимой переменной при изменении уровня пыльцы в воздухе на 1 класс пыления; k2 отражает разницу базального уровня специфичного IgE к березовой пыльце между донорами MRK и MS; k3 отражает разницу базального уровня специфичного IgE к березовой пыльце между донорами LK и MS.

Рассчитанные коэффициенты: b = 207,813 (p < 0,01); k2= – 194,4 (p < 0,01); k1 = 6,474 (p < 0,05); k3= – 208,15 (p < 0,01). Скорректированный R2 = 0,98; p < 0,01; F-тест.

Аналогично разработана регрессионная модель для анализа согласованности динамики сывороточного уровня общего IgE с уровнем пыльцы березы в воздухе. В качестве зависимой переменной выбран сывороточный уровень общего IgE, в качестве переменных-предикторов — те же переменные, что и для ранее описанной модели для sIgE. Для данной модели (зависимая переменная — сывороточный уровень общего IgE) получены следующие значения коэффициентов:

b = 1299,05 (p < 0,01); k2 = –1056,4 (p < 0,01); k1= 51,45 (p < 0,05); k3= –1313,65 (p < 0.01). Скорректированный R2 = 0,95; p < 0,01; F-тест.

Данные пыльцевого мониторинга

Данные пыльцевого мониторинга в г. Москве получены из открытых источников («Аллергофон»). Соответствие класса пыления количеству зерен пыльцы на кубический метр воздуха представлено в табл. 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Повышение сывороточного уровня общего и специфичного к пыльце березы IgE происходит согласованно с повышением уровня пыльцы березы в воздухе

Сывороточный уровень общего и аллергенспецифичного к пыльце березы IgE был измерен в шести временных точках до и после начала сезона пыления березы. Абсолютные значения сывороточных уровней как специфичного (рис. 1А), так и общего IgE (рис. 1Б) значительно различаются между пациентами, при этом индивидуальные различия существенно превосходят различия между временными точками того же донора. У всех доноров наблюдается рост абсолютных значений sIgE к пыльце березы и общего IgE от точки 1 к точке 6. Уровень специфичного к аллергенам березы IgE коррелирует с уровнем общего IgE для каждого донора и превышает референсный уровень во всех временных точках (рис. 1).
Степень изменения уровня sIgE к березовой пыльце и общего IgE на протяжении исследуемого периода существенно меньше различий в сывороточном уровне общего и специфичного IgE между донорами (коэффициент вариации между всеми точками соответствующего донора для sIgE к березе: MS — 0,130, MRK — 0,228, LK — 0,282; для IgE общего: MS — 0,189, MRK — 0,154, LK — 0,485); наименьший коэффициент вариации между донорами для sIgE — 1,39; для общего IgE — 1,17). В связи с этим, для исследования значений в динамике уровни sIgE к березовой пыльце и общего IgE в каждой последующей временной точке были рассмотрены относительно базовых уровней sIgE и общего IgE для этого донора, т. е. до начала пыления березы (точка 1). Каждое измерение общего IgE и sIgE к пыльце березы было нормировано на соответствующие значения общего IgE и sIgE к пыльце березы в первой временной точке для каждого донора.

В соответствии с ранее опубликованными данными по сезонной динамике сывороточного уровня IgE, специфичного к другим пыльцевым аллергенам [8–10], в нашем исследовании также можно наблюдать значительное увеличение уровня sIgE к пыльце березы между временной точкой вне сезона (точка 1) и в пик сезона пыления (точка 6) березы. При этом обнаружена согласованная динамика сывороточного уровня sIgE к березе и уровня березовой пыльцы в воздухе (рис. 2). Наибольший прирост в уровне sIgE происходит в период пика пыления березы, между точками 3 и 5: для донора LK он составил 90,7%, для MRK — 63,7%, для MS — 36,9%.
Для статистической проверки гипотезы о связанности уровня пыльцы березы в воздухе и сывороточного уровня аллергенспецифичного IgE к пыльце березы была построена линейная регрессионная модель. В соответствии с моделью высокая доля дисперсии зависимой переменной (уровень sIgE) обусловлена выбранными предикторами (скорректированный R2 = 0,98), т. е. уровнем пыльцы в воздухе и идентификатором донора, что позволяет учесть значительные различия в абсолютном уровне sIgE между донорами. При этом все коэффициенты статистически достоверно не равны 0 (p < 0,05 для всех коэффициентов), и коэффициент при переменной-предикторе, отражающей уровень пыльцы березы, больше 0 (k1 = 6,47), что служит статистическим подтверждением согласованности изменения уровня sIgE в сыворотке с изменением уровня пыльцы березы в воздухе. Аналогично, регрессионная модель для уровня общего IgE также демонстрирует согласованность повышения уровня общего IgE с концентрацией аллергена в воздухе (скорректированный R2 = 0,95; p < 0,05 для каждого из коэффициентов).

Стоит отметить, что относительно небольшое, по сравнению с максимально достигнутым за весь период наблюдения, повышение уровня sIgE к пыльце березы происходит в промежутке до начала или при невысокой концентрации пыльцы березы (точки 1–3). Это можно объяснить случайными колебаниями уровня sIgE к пыльце березы (для двух из трех доноров повышение абсолютного уровня между точками 1–2 и 2–3 не превышает 1 МЕ/мл) или более ранним контактом пациента с пыльцой березы, до того как повышение уровня пыльцы в воздухе было зарегистрировано станциями пыльцевого мониторинга. Такое повышение sIgE к березовой пыльце может быть обусловлено также кросс-реактивностью sIgE к пыльце березы в отношении антигенов из пыльцы ольхи из-за высокой степени гомологии антигенов [2] и предшествования пыления ольхи сезону цветения березы. Для оценки вклада кросс-реактивных IgE мы провели измерение уровня sIgE к пыльце ольхи для всех собранных образцов сыворотки (рис. 3). У всех исследованных доноров уровень sIgE к пыльце ольхи оказался в большей степени согласован с изменением уровня пыльцы березы в воздухе, чем пыльцы ольхи. Наибольший прирост уровня sIgE к пыльце ольхи наблюдали между точками 4 и 5 в момент наибольшего прироста уровня пыльцы березы в воздухе, но не в момент наибольшего прироста уровня пыльцы ольхи в воздухе между точками 1 и 2. На основе этого можно предположить высокую степень кросс- реактивности sIgE к березовой пыльце в отношении антигенов пыльцы ольхи у всех исследованных доноров.
Между точками 1 и 2 для двух доноров (MRK, LK) небольшой рост уровня sIgE к березовой пыльце (< 1 МЕ/мл) сопровождало снижение уровня sIgE к пыльце ольхи. Таким образом, показанное для доноров MRK и LK незначительное повышение уровня sIgE к березовой пыльце не может быть объяснено кросс-реактивностью sIgE к пыльце ольхи. У донора MS наблюдали рост sIgE к ольхе между точками 1 и 2, что может объяснять повышение уровня sIgE к березовой пыльце до начала сезона пыления березы.

Представленность IgE-экспрессирующих клеток в субпопуляциях B-клеточного происхождения в периферической крови сравнительно низка и возрастает на фоне сезонного обострения аллергии

Основываясь на данных, полученных с использованием мышиной модели пищевой аллергии, можно предположить, что увеличение сывороточного уровня sIgE к пыльце березы и общего IgE связано с увеличением числа IgE- продуцирующих клеток в организме. Чтобы оценить сезонную динамику представленности IgE+-клеток в субпопуляциях B-клеточного ряда (B-лимфоцитов памяти, плазмобластов, плазматических клеток), для одного из доноров было проведено исследование клональных репертуаров тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGH) клеток периферической крови в трех временных точках («1_2017», «3_2018» — точки вне сезона пыления березы, «2_2017» — на пике сезона).
В результате секвенирования суммарно для всех трех временных точек было получено 50 550 291 прочтений, представляющих 1 616 747 уникальных молекулярных событий (молекул кДНК IGH, вошедших в анализ). Для дальнейшего анализа с целью исключения большинства ошибок в определении клональной последовательности использовали молекулярные события, для которых получено два или более прочтений. Всего было определено 116 437 клонотипов IGH (клонотип определяют как уникальную нуклеотидную последовательность IGH от каркасного региона (FR1) V-сегмента до конца J-сегмента с учетом изотипа антитела). Среди обнаруженных IgE клонотипы представляли исключительно малую долю (~0,01%). Для сравнения: доля IgM клонотипов составила 48,4%, IgD — 14%, IgG — 17,4%, IgA — 19,8%.
Все IGE+-клонотипы были обнаружены в репертуарах тяжелых цепей иммуноглобулинов B-лимфоцитов памяти, плазмобластов и долгоживущих плазматических клеток исключительно в образцах, полученных в период сезона пыления березы (рис. 4). При этом число клеток в образце каждой субпопуляции не различается между временными точками. Полученный результат свидетельствует о повышении представленности IGE+-клеток в периферической крови пациента в сезон цветения березы.

Преимущество использованной технологии подготовки библиотек кДНК тяжелых цепей иммуноглобулинов в возможности оценки числа гипермутаций по всей длине последовательности IGH, начиная с региона FR1 и заканчивая началом константного участка. Для каждого клонотипа было определено число гипермутаций в зависимости от изотипа данной IGH. Ожидаемо, что наименьший уровень гипермутаций был детектирован среди IgD- и IgM-последовательностей (медиана — 2,3 и 3,7 п.о. на 100 п.о. последовательности V-сегмента соответственно), и более высокий — среди IgG- и IgA-клонотипов (медиана — 6,8 и 7,1 п.о. на 100 п.о. последовательности V-сегмента соответственно) (рис. 5), экспрессирующихся в B-лимфоцитах, прошедших через процесс созревания в герминативных центрах. При этом среднее число гипермутаций IgE-клонотипов было не ниже (медиана — 7,4 п.о. на 100 п.о. последовательности V-сегмента), чем для IgG- и IgA-клонотипов. Факт сходного числа гипермутаций у IgE- и IgG-клонотипов может свидетельствовать о возможном происхождении IgE- клонотипов антителосекретирующих субпопуляций клеток из IgG⁺ B-лимфоцитов памяти, однако не исключает возможности независимого переключения изотипов и дальнейшего гипермутагенеза IgE⁺ и IgG⁺ B-лимфоцитов.
Для более детального анализа взаимосвязи IgE-клонотипов в репертуарах тяжелых цепей иммуноглобулинов с клонотипами других изотипов мы применили ранее опубликованный подход для определения клональных групп, т. е. наборов клонотипов, наиболее вероятно произошедших от единого предшественника и имеющих схожую, но не обязательно идентичную нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный фрагмент тяжелой цепи B-клеточного рецептора [16]. Всего было выявлено 13 IgE-содержащих клональных групп, включавших в общей сложности 154 клонотипа. В 4 из них были идентифицированы клонотипы других изотипов: IgG — 82, IgA — 19, IgM — 4 и IgD — 1. Филогенетический анализ, проведенный для клонотипов каждой из этих клональных групп, указывает на близкое родство IgE- и IgG-клонотипов (рис. 6) — для большинства IgE-клонотипов наиболее близким соседом по филогенетическому древу являлся IgG-клонотип. Стоит отметить, что в каждой из рассмотренных IgE-содержащих клональных групп присутствовали IgG-клонотипы, представлявшие фракцию IgG⁺ B-лимфоцитов памяти.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ранее опубликованных исследованиях показан рост уровня сывороточного общего и аллергенспецифичного IgE в период сезонного обострения аллергического ринита [8–10]. Вместе с тем в этих работах представлены данные о сезонной динамике сывороточного уровня антител собраны с периодичностью раз в несколько месяцев и вне связи с уровнем пыльцы, вызывающей аллергическую реакцию, в воздухе. В данной работе мы провели измерения сывороточного уровня общего IgE и специфичных IgE к пыльце березы и ольхи с большим разрешением по времени (периодичность анализа уровня антител — раз в две недели) в течение периода, захватывающего начало периода пыления. Сопоставление концентрации антител с количеством пыльцы в воздухе в каждой временной точке позволило продемонстрировать согласованную динамику уровня пыльцы березы в воздухе и сывороточного уровня sIgE к березе и общего IgE. При этом рост уровня сывороточного sIgE к ольхе оказался в большей степени ассоциирован с ростом уровня пыльцы березы, но не ольхи, у всех доноров. Такой результат, по всей видимости, обусловлен кросс-реактивностью аллергенспецифичных IgE к пыльце березы в отношении антигенов пыльцы ольхи и может свидетельствовать об отсутствии специфичных антител к уникальным антигенам ольхи у доноров в нашем исследовании. Вместе с тем, так как уровень sIgE к пыльце ольхи не был исследован до начала цветения ольхи — до начала измерений sIgE прошло чуть более одной недели, в течение которой наблюдали низкий уровень (1–10 зерен на 1 м3) пыльцы ольхи в воздухе, нельзя исключить, что повышение уровня sIgE к ольхе до максимального значения могло случиться в этот период (точки 1–3).
Момент начала роста концентрации sIgE к пыльце березы и общего IgE совпадал с началом роста концентрации пыльцы березы у всех доноров, что может быть связано с увеличением количества IgE- секретирующих плазмобластов и плазматических клеток, дифференцирующихся из B-лимфоцитов памяти в ответ на стимуляцию аллергеном. Исследование динамики репертуара IGH и свойств последовательностей идентифицированных IGH-клонотипов в целом подтверждает это предположение. Полученные данные свидетельствуют о росте количества IgE-экспрессирующих плазмобластов и плазматических клеток в периферической крови после начала пыления березы, что отражает активный процесс дифференциации В-лимфоцитов. Высокий уровень гипермутаций, наблюдаемый в IgE- клонотипах, указывает на длительную историю отбора рецепторов в ходе реакций в герминативных центрах, позволяя предполагать происхождение данных IgE- секретирующих клеток из B-лимфоцитов памяти.

В целом, полученные результаты указывают на то, что модель долгосрочного поддержания иммунологической памяти в контексте пищевой аллергии [6] может быть справедлива и в контексте сезонного аллергического ринита. В рамках данной модели долгоживущие IgE-секретирующие плазматические клетки имеют ограниченный период жизни (~100 дней для мышиной модели), при этом IgG1-B-лимфоциты памяти служат долгосрочным «резервуаром», из которого пополняется пул IgE-секретирующих плазматических клеток. Процесс пополнения происходит в период контакта с аллергеном за счет быстрой пролиферации, изотип-свитчинга и дифференциации IgG1-B-лимфоцитов памяти под действием Th2-ассоциированных цитокинов (IL4, IL13 и др.). Результаты ранее опубликованного исследования репертуаров B-клеточных рецепторов в респираторной аллергии [18] не содержали сведений относительно принадлежности клонотипов к определенным субпопуляциям, но тем не менее свидетельствовали о наличии клональных связей между IgG- и IgE-клонотипами в репертуарах тяжелых цепей иммуноглобулинов в периферической крови, что также служит косвенным подтверждением корректности модели, предложенной R. Jiménez-Saiz. Проведенный в рамках данного исследования филогенетический анализ IgE-содержащих клональных групп демонстрирует вероятное происхождение IgE-секретирующих плазматических клеток из IgG⁺ B-лимфоцитов памяти у пациентов с аллергическим риноконъюнктивитом, однако в то же время строго не исключает возможности иного происхождения IgE- продуцентов.
Полученные нами данные также не исключают возможности того, что увеличение уровня сывороточного IgE происходит за счет более интенсивного производства и секреции антител уже существующими IgE- секретирующими плазматическими клетками. Средний срок жизни IgE⁺ плазматических клеток в красном костном мозге для человека остается неизученным. При этом повышенная концентрация IgE в сыворотке больных аллергическим ринитом наблюдается и вне сезона цветения, позволяя предположить, что срок жизни соответствующих плазматических клеток может превышать время между двумя сезонами пыления. Однако, принимая во внимание ранее опубликованные данные о корреляции сывороточного уровня IgE и числа IgE⁺ плазматических клеток в периферической крови [19], более вероятным объяснением роста сывороточного уровня общего и специфичного IgE представляется увеличение числа IgE-секретирующих клеток, что также согласуется с результатами настоящей работы.

ВЫВОДЫ

За счет существенно более высокого, по сравнению с опубликованными ранее исследованиями, временного разрешения при мониторинге уровня антител в сыворотке, удалось продемонстрировать, что момент начала роста концентрации общего и специфичного к пыльце березы IgE в контексте сезонной аллергии на березовую пыльцу совпадает с моментом начала роста концентрации пыльцы березы. При этом динамика роста уровней общего и специфичного IgE согласуется с количеством пыльцы березы в воздухе.
Результаты высокопроизводительного секвенирования и анализа репертуаров тяжелых цепей клеток B-лимфоцитарного ряда в сочетании с данными, полученными на мышиной модели пищевой аллергии другими авторами, позволяют предположить, что подобный прирост вероятнее всего вызван увеличением количества IgE-секретирующих плазматических клеток. Анализ нуклеотидных последовательностей IgE-содержащих клональных групп разных субпопуляций В-клеточного ряда показал высокое сходство последовательностей IgE- и IgG-клонотипов и присутствие в данных группах IgG-клонотипов, представляющих фракцию IgG⁺- B-лимфоцитов памяти, что позволяет предположить происхождение IgE-секретирующих клеток из пула IgG⁺-B- лимфоцитов.
Малый размер выборки пациентов не позволяет заключить, что полученные характеристики отражают общие закономерности для всех пациентов в силу предполагаемого многообразия эндотипов аллергического риноконъюнктивита. Полученные в работе результаты свидетельствуют о сходстве механизма долгосрочного поддержания иммунной памяти при САР с таковым при пищевой аллергии. Для подтверждения данного предположения необходимо продолжить исследование на существенно более многочисленной группе пациентов с более детальной клинической характеристикой пациентов. Недостаточная изученность механизмов поддержания аллергенспецифичной реактивности иммунной системы определяет необходимость подобных исследований для разработки новых способов терапии, направленных на нарушение таких механизмов. Например, блокирование процесса переключения изотипа на IgE при дифференцировке IgG⁺-аллергенспецифичных В-клеток памяти (например, за счет подавления эффекта цитокинов, производимых Th2-Т-клетками, при помощи моноклонального антитела к IL4R) может стать перспективной терапевтической стратегией. Сведения о динамике сывороточного уровня антител на фоне изменения концентрации аллергена в воздухе, полученные в настоящей работе, необходимы в дальнейшем при изучении сезонной динамики представленности IgE-секретирующих аллергенспецифичных клеток.