Методы молекулярно-генетического типирования, выявляющие внутривидовую вариабельность бактериальных патогенов, с начала XXI в. активно используют для проведения эпидемиологических исследований [1]. Особую актуальность типирование приобрело для мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний, развивающих множественную устойчивость к антимикробным препаратам, в частности, возбудителя гонореи Neisseria gonorrhoeae. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила N. gonorrhoeae в список из 12 патогенов, представляющих глобальную угрозу и требующих безотлагательной разработки новых лекарственных препаратов [2].
Задачу контроля и слежения за глобальным и региональным распространением эпидемически значимых, в том числе мультирезистентных, клонов N. gonorrhoeae решают такими методами молекулярного типирования, как NG-MAST (Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence typing) и MLST (Multilocus sequence typing) [3, 4], а также полногеномным секвенированием (WGS) [5]. Наиболее полная информация о филогении исследуемых клинических изолятов может быть получена с использованием WGS, однако применение этого подхода в рутинной практике пока ограничено его относительно высокой стоимостью и требованиями к качеству анализируемого образца ДНК. Методом MLST, первоначально разработанным для молекулярного типирования N. meningitidis, анализируют гены, более консервативные, чем гены porB и tbpB, используемые в NG-MAST-типировании. В связи с этим NG-MAST остается основным и широко используемым методом, позволяющим исследовать эволюцию патогена и определять пути распространения инфекции [4, 6]; показана высокая разрешающая способность метода при анализе клинических изолятов [7, 8].

Метод NG-MAST основан на определении нуклеотидных последовательностей вариабельных участков двух генов, кодирующих трансмембранный белок порин (porB) и трансферринсвязывающий белок (tbpB). По результатам их секвенирования каждой уникальной последовательности присваивают оригинальный номер аллеля и каждой совокупности аллелей — номер сиквенс-типа (ST). По мере выявления новых аллелей их перечень постоянно дополняют, и к настоящему времени (январь 2020 г.) в базе данных www.ng-mast.net представлено более 11 000 аллелей porB и свыше 2900 аллелей tbpB, определяющих существование более 19 500 NG-MAST типов.
Целью исследования являлись NG-MAST-типирование современных российских клинических изолятов N. gonorrhoeae и сравнительный филогенетический анализ возбудителей гонококковой инфекции в России, странах Европейского Союза и Японии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические изоляты N. gonorrhoeae (822 образца) получены Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии (Москва) из 17 регионов Российской Федерации в рамках долговременной программы мониторинга гонококковой инфекции RU-GASP (Russian Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme). Изоляты собраны в период с 2013 по 2018 г. Регионы РФ включали Архангельскую, Астраханскую, Брянскую, Иркутскую, Калужскую, Новосибирскую, Омскую, Пензенскую, Псковскую, Рязанскую, Томскую и Челябинскую области, г. Москву, Ставропольский край, Республику Татарстан, Республику Тыва и Чувашскую Республику (таким образом, были охвачены 7 из 8 федеральных округов РФ, кроме Дальнего Востока). Образцы поступали из специализированных медицинских организаций дерматовенерологического профиля, каждый образец от отдельного пациента. Количество клинических изолятов варьировало в зависимости от плотности населения и показателей заболеваемости гонококковой инфекцией в регионе, в относительных величинах составляя 1–10% от общего количества зарегистрированных случаев заболевания, а в абсолютных — 5–35 штаммов в год. Сбор клинических изолятов, их транспортировка, культивирование, верификация и хранение подробно описаны [9–11]. Данные по количеству проанализированных клинических изолятов для каждого года исследования представлены в табл. 1.
Молекулярное типирование N. gonorrhoeae проводили путем анализа нуклеотидных последовательностей вариабельных участков генов porB (490 пн) и tbpB (390 пн) в соответствии с протоколом NG-MAST [12]. После первого раунда ПЦР-амплификации и очистки полученные фрагменты ДНК секвенировали по Сэнгеру с использованием 3730xl Genetic Analyser (Applied Biosystems; США). Определенные последовательности аллелей сравнивали с последовательностями из базы данных NG-MAST database (www.ng-mast.net), и делали заключение о принадлежности исследуемого клинического изолята к определенному сиквенс-типу. Обнаруженные новые последовательности аллелей porB и tbpB или их сочетания регистрировали в указанной выше международной базе данных с присвоением номеров NG-MAST.

При характеристике образцов N. gonorrhoeae из стран ЕС использовали данные NG-MAST типирования, представленные в базе данных https://pathogen.watch/ collection/ eurogasp2013. Всего в анализ включили 1071 изолят из 21 страны: Австрии, Бельгии, Великобритании, Венгрии, Германии, Греции, Дании, Ирландии, Исландии, Испании, Италии, Кипра, Латвии, Мальты, Нидерландов, Норвегии, Португалии, Словакии, Словении, Франции и Швеции. Данные по NG-MAST-типированию N. gonorrhoeae в Японии (2015 г.) были представлены сведениями о 206 клинических изолятах из базы данных https://pubmlst.org/ (нами выбраны образцы N. gonorrhoeae с известными вариантами porB и tbpB). Изоляты со смешанным или неопределенным NG-MAST-типом не учитывали. Таким образом, из исходной выборки (страны ЕС и Япония) было удалено 29 изолятов, что составило 1,4% от всего объема выборки.
Для филогенетического анализа использовали конкатенированные последовательности генов porB и tbpB. С использованием Байесовского критерия и информационного критерия Акаике было показано, что лучшая модель замен для наших данных  — GTR с вычислением пропорции инвариантных сайтов и Г-моделью гетерогенной скорости. Для полученных последовательностей и выбранной модели методом максимального правдоподобия в программе RAxML вер. 7.4.8 [13] построено филогенетическое древо с числом итераций 999 на платформе http://galaxy-dev.cnsi.ucsb. edu/osiris/. Для построения древа использовали данные для российских и европейских клинических изолятов N. gonorrhoeae за 2013 г. Для клад на филогенетическом древе достоверными считали значения уровня поддержки (bootstrap value) 90% и выше.
Данные по численности населения и доле изолятов уникальных сиквенс-типов по странам анализировали, используя иерархическую агломеративную кластеризацию методом Варда в пакете «cluster» для языка R. Для определения оптимального числа кластеров использовали пакет «Nbclust» [14]. Информация о численности населения стран и коэффициенты миграционного прироста (количество мигрантов на 1000 человек населения) взяты из The World Factbook, https://www.cia.gov/library/publications/the-world-factbook/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам молекулярного типирования, 822 клинических изолята N. gonorrhoeae, собранных в России в период с 2013 по 2018 г., были отнесены к 301 различному NG-MAST-типу. Наиболее распространенными сиквенс-типами были 807, 228, 1993, 5714, 9476 (8,3%; 3,3%; 3,2%; 3,2%; 2,7% от общей численности анализируемой выборки соответственно). В 2013 г. изоляты NG-MAST 807 составляли более 13% российской популяции N. gonorrhoeae, а далее их доля постепенно уменьшалась от года к году до 4,6% в 2018 г. (см. табл. 1). Представители сиквенс-типов 807 и 1993 обнаружены также среди образцов, полученных в европейских странах, однако в Европе они встречались спорадически: NG-MAST 807 — в Испании и Словакии и NG-MAST 1993 — в Дании. В 2018 г. на первом месте в России по распространенности оказался уникальный российский тип NG-MAST 228, сформировавший 14,6% популяции. Доля российских изолятов, относящихся к уникальным российским сиквенс-типам (см. табл. 1, отмечены звездочкой), в общем числе сохранялась (2013–2018) и в среднем составляла около 80%.
Следует отметить высокую долю сиквенс-типов, представленных одним образцом, которая сохранялась год от года и равнялась 25–31% от общего количества изолятов. Для образцов N. gonorrhoeae стран ЕС эта доля в 2013 г. составила 24% [6].
Результаты молекулярного типирования N. gonorrhoeae в странах Европы [5, 6], а также наиболее часто встречающиеся сиквенс-типы представлены в табл. 2. В европейских странах в 2013 г. обнаружено 389 сиквенс-типов, наиболее распространенным среди которых был NG-MAST 1407, встречающийся в 13 странах и составивший 7,3% от общей численности проанализированных клинических изолятов. Популяция N. gonorrhoeae Японии (см. табл. 2) сильно отличалась как от российской, так и от европейской. Изоляты из Японии принадлежали к 65 молекулярным типам, из них только два сиквенс-типа присутствовали в России и в европейских странах: NG-MAST 1407 (в странах ЕС и в России) и NG-MAST 4186 (один образец этого типа в Швеции), остальные 63 молекулярных типа были уникальными для Японии.
Для определения филогенетического родства клинических изолятов N. gonorrhoeae Европы и России построено филогенетическое древо по максимальному правдоподобию. Филогенетическое древо с раскраской, соответствующей наличию NG-MAST-типа в той или иной стране, представлено на рис. 1.
Анализ расположения сиквенс-типов изолятов, полученных в России и Европе, на древе позволил выделить 16 клад с высокими значениями уровня поддержки (более 90%) (см. рис. 1). Некоторые клады полностью либо частично соответствуют европейским геногруппам, установленным в докладе Европейского центра профилактики и контроля болезней для образцов N. gonorrhoeae, полученных в Европе в 2013 г. [6].

Клада α (уровень поддержки 100) включает 40 NG-MAST-типов (82 изолята) из 17 стран Европы и России, из них 6 сиквенс-типов принадлежат 7 российским изолятам (8,5%). Клада включает NG-MAST 5624 (15 образцов из 7 стран) и соответствует ранее установленной европейской геногруппе G5624 [6].

Клада β (уровень поддержки 94) состоит из 33 сиквенс-типов (91 изолят), включая часто встречающиеся в Европе NG-MAST 225 (24 образца из 12 европейских стран) и NG-MAST 292 (15 образцов из 6 стран, из них один образец из России). Российские образцы в данной кладе представлены 19 изолятами (21,3%), принадлежащими к 12 сиквенс-типам. Клада β соответствует европейской геногруппе G225 [6].

Клада Υ (уровень поддержки 96) состоит из 14 сиквенс-типов (98 изолятов), полученных в 17 странах Европы (из России — один изолят), из них 78 образцов принадлежат сиквенс-типу NG-MAST 2992 (2-е место в Европе по распространенности). Клада Υ соответствует европейской геногруппе G2992 [6].

Клада δ (уровень поддержки 98) включает 3 сиквенс-типа (образцы из Португалии, Норвегии, Великобритании. Клада ε (уровень поддержки 100) состоит из 4 сиквенс-типов (4 изолята из Норвегии, Греции и Великобритании). Клада ζ (уровень поддержки 100) включает только уникальные российские сиквенс-типы (7 образцов, принадлежащих 5 NG-MAST-типам).

Клады η и θ (уровни поддержки 98 и 90 соответственно) включают только европейские сиквенс-типы, не обнаруженные в России. Клада η состоит из 9 NG-MAST-типов (16 образцов), клада θ — из 11 сиквенс-типов (34 образца). NG-MAST-типы этих двух клад принадлежат одной европейской геногруппе G5333 [6].

Клада ι (уровень поддержки 98) состоит из 4 сиквенс-типов (4 образца, полученных в Португалии, Италии и Нидерландах).

Клада Κ (уровень поддержки 94) содержит 4 европейских сиквенс-типа (36 образцов), в том числе сиквенс-тип NG-MAST 4995 (4-е место в Европе по распространенности, обнаружен в 10 европейских странах), к которому принадлежит 31 изолят. Клада Κ соответствует европейской геногруппе G4995 [6].

В кладу λ (уровень поддержки 95) входят 3 сиквенс-типа европейских стран: 10 образцов, из них 8 принадлежит NG-MAST 5441, обнаруженному в 5 странах.

Клада μ (уровень поддержки 94) состоит из 4 сиквенс-типов (10 образцов, обнаруженных в Греции, Дании, Словении, Португалии). Клада ν (уровень поддержки 98) включает 3 сиквенс-типа (5 образцов из 5 европейских стран).

В кладу ξ (уровень поддержки 100) входят три сиквенс-типа (4 образца из Ирландии и Дании). Клада ο (уровень поддержки 98) состоит из 5 NG-MAST-типов (17 образцов), включающих часто встречающиеся в России типы NG-MAST 1993 и 5714.

Клада π (уровень поддержки 97) включает 7 сиквенс-типов (12 изолятов), обнаруженных как в России, так и в европейских странах. Сюда входят уникальные российские сиквенс-типы NG-MAST 5792, 9485, 9490, 9491.

Для каждой страны были обнаружены изоляты, принадлежащие к уникальным сиквенс-типам, не найденным в других странах. Доля изолятов с уникальными сиквенс-типами от общего количества изолятов в стране в европейских странах варьировала от 25 до 56%, наименьшие значения у Великобритании и Бельгии, наибольшие у Австрии, Словении, Швеции (> 50%). Для России и Японии доля изолятов с уникальными сиквенс-типами превышала 80% (табл. 3).
Для нахождения групп со сходными параметрами распространения уникальных сиквенс-типов и их связи с численностью населения страны проведен кластерный анализ, включающий 21 страну (см. табл. 3). Из анализа были исключены Кипр и Исландия из-за малого количества доступных образцов (6 и 5 соответственно). После проведения иерархической кластеризации методом Варда оптимальное число кластеров определили с помощью пакета «NbClust» для языка R, используя правило большинства. Девять методов (Silhouette, Duda, PseudoT2, Beale, Ratkowsky, PtBiserial, McClain, Dunn, SDindex) из 30 показали, что оптимально разбиение стран на два кластера (уровень значимости 0,01), шесть методов (Hartigan, Scott, Marriot, TrCovW, TraceW, Ball) показали, что оптимально разбиение на три кластера. В соответствии с правилом большинства было принято решение, что оптимальным является разбиение на два кластера, но в то же время имеется статистическое обоснование для разбиения кластера 2 на два подкластера (рис. 2А).

В первый кластер входят Россия и Япония — страны с населением свыше 125 млн человек, во второй — все европейские страны с населением 0,4–81 млн человек. Второй кластер подразделен на два подкластера 2а и 2б; подкластер 2а включает Великобританию, Германию, Испанию, Италию и Францию — страны с населением 47–81 млн человек, подкластер 2б включает европейские страны с численностью населения менее 17 млн человек (Ирландия, Норвегия, Дания, Словакия, Мальта, Латвия, Словения, Нидерланды, Бельгия, Португалия, Греция, Австрия, Венгрия, Швеция).
В целом, изолятов с уникальными сиквенс-типами тем больше, чем больше население страны, что видно на примере стран с численностью населения свыше 47 млн человек, входящих в кластер 1 и подкластер 2а (рис. 2Б). Для стран кластера 2б с меньшей численностью населения такой зависимости не наблюдается. Переход из кластера 2 в кластер 1 происходит для стран с численностью населения более 125 млн человек (Россия, Япония).
Интересно было также проанализировать вклад мобильности населения (миграции) в распределение образцов уникальных сиквенс-типов по странам. При анализе только коэффициентов миграции по странам и доли образцов уникальных сиквенс-типов не удалось выявить кластеры, подтверждаемые статистическими критериями. При кластерном анализе трех параметров (миграции населения, численности населения и доли образцов уникальных сиквенс-типов) коэффициент агломерации оказался равен 0,83, что ниже, чем коэффициент 0,93, полученный при анализе двух параметров: численности населения и доли образцов уникальных сиквенс-типов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сравнение результатов молекулярного типирования изолятов N. gonorrhoeae в России, странах Европы и в Японии показало существенные различия между популяциями гонококка. Большинство российских изолятов обладали сиквенс-типами, не встречающимися в анализируемый период в европейских странах и Японии. Так, в России обнаружено только 3 образца (0,4%) пандемически значимого молекулярного типа 1407, который доминировал в Бельгии, Венгрии, Дании, Испании, Норвегии, Португалии, Словакии, а также в Японии. Следует отметить, что изоляты этого молекулярного типа еще в 2010 г. составляли более 10% во многих европейских странах, в том числе в Австрии, Бельгии, Великобритании, Голландии, Испании, Италии, Португалии, Румынии, Словении, Польше [15–17], Японии и США [18, 19]. Этот сиквенс-тип представляет большую опасность, так как в нем обнаружены множественные детерминанты резистентности к антимикробным препаратам, включающие мозаичный тип пенициллинсвязывающего белка PBP2 и дополнительную мутацию остатка Ala501 в PBP2, вызывающие устойчивость к цефалоспоринам [16, 20, 21].
В России присутствовало только 3 образца N. gonorrhoeae NG-MAST типа 2992 (0,4%) и 7 образцов типа 2400 (0.9%), которые занимали второе и третье места по распространенности в Европе в 2013 г. (7,0 и 4,7% соответственно). Напротив, в европейских странах не были обнаружены NG-MAST-типы 228, 5714, 1751, которые входили в число ключевых среди российских изолятов.
Сравнение с ситуацией в соседней с Россией Польше (данные по этой стране отсутствовали в базе данных EUROGASP и были взяты из работы [17]) показало, что распределение NG-MAST-типов в Польше ближе к европейским странам, чем к России, с доминированием NG-MAST 1407 (см. табл. 2).

Анализ филогенетического древа NG-MAST-типов клинических изолятов Европы и России демонстрирует, что популяция N. gonorrhoeae как в России, так и в Европе гетерогенна. Существуют сиквенс-типы, одновременно присутствующие в разных странах, и в то же время в одной стране обнаружены изоляты, принадлежащие к филогенетически неблизким кладам. Не наблюдается близкого филогенетического родства между наиболее распространенными европейскими сиквенс-типами NG-MAST 1407, 2992, 2400, 4995, 21, 225, которые в сумме составляют более четверти (25,9%) от всех европейских штаммов: данные сиквенс-типы филогенетически далеки друг от друга и распределены по всему древу. Следует также отметить отсутствие близкого родства между наиболее распространенными европейскими и российскими сиквенс-типами, такими как NG-MAST 807, 1152, 5941. На древе выделено 16 клад с высокими значениями уровня поддержки, которые полностью либо частично соответствуют европейским геногруппам [6].
Дальнейший филогенетический анализ NG-MAST-типов позволил заключить, что географически разделенные популяции N. gonorrhoeae эволюционируют относительно локально. Это может быть одной из причин различий в уровне и динамике заболеваемости гонококковой инфекцией в России и странах ЕС [22]: в России наблюдается тенденция к снижению заболеваемости гонореей [9, 23], при этом не обнаружено изолятов, обладающих устойчивостью к цефтриаксону (основной препарат, используемый для лечения гонореи) [9, 10].
Нами проанализирована связь между долей изолятов с уникальными сиквенс-типами и численностью населения страны, в которой их обнаружили. В России и Японии преобладающая доля изолятов (> 80%) относилась к уникальным для данной страны NG-MAST-типам. Кластерный анализ данных по доле изолятов с уникальными сиквенс-типами, обнаруженными в данной стране, и численности населения страны показал существование двух кластеров: первый кластер включал Россию и Японию с численностью населения свыше 125 млн человек, второй — анализируемые европейские страны с численностью населения 0,4–81 млн человек. В целом, показана тенденция в распределении уникальных сиквенс-типов: их доля тем выше, чем больше численность населения страны.

ВЫВОДЫ

NG-MAST-типирование российских клинических изолятов N. gonorrhoeae показало их существенное отличие от современных популяций возбудителей гонококковой инфекции в странах ЕС и Японии. Наиболее широко распространенные в России молекулярные типы NG-MAST 807, 1152 и 5941 в других странах представлены спорадически, а NG-MAST 228, 5714 и 1751 вообще не обнаружены. За период 2013–2018 гг. в России выявлено только три образца пандемически значимого молекулярного типа 1407 (0,4% от общей численности анализируемой выборки), который представляет большую опасность из-за наличия множественных детерминант резистентности к антимикробным препаратам и доминирует во многих странах ЕС и Японии.
Филогенетический анализ NG-MAST-типов для изолятов России и стран ЕС показал их высокую генетическую гетерогенность, а также генетическую отдаленность распространенных европейских сиквенс-типов и сиквенс-типов, наиболее часто встречающихся в России, что указывает на локальный характер формирования и эволюции российской популяции N. gonorrhoeae.
Преобладающая (> 80%) доля российских и японских изолятов относилась к уникальным для данной страны NG-MAST-типам, что гораздо выше, чем доля изолятов уникальных типов в европейских странах. Кластерный анализ данных по доле изолятов с уникальными сиквенс-типами и численности населения показал существование двух кластеров: Россия и Япония в одном и европейские страны в другом. При этом в странах с численностью населения более 47 млн человек (Великобритании, Германии, Испании, Италии, Франции, России и Японии) чем больше население, тем больше доля изолятов уникальных сиквенс-типов. Не удалось выявить зависимости доли изолятов с уникальными сиквенс-типами от миграции (мобильности) населения.
Таким образом, проведенный филогенетический анализ выявил относительную изолированность современной российской популяции N. gonorrhoeae, эволюционирующей на основе собственных закономерностей. Тем не менее сохраняется необходимость непрерывного динамического контроля за распространением гонококковой инфекции и антибиотикорезистентностью изолятов N. gonorrhoeae в РФ, целью которого являются своевременное выявление и эффективная элиминация глобально распространенных сиквенс-типов с множественными детерминантами резистентности.