Среди основных функций эпителия кишечника — защита организма от инфекций и обеспечение возможности безопасного существования комменсальных бактерий в кишечнике [1, 2]. Бактерии и бактериальные антигены могут непосредственно взаимодействовать с клетками эпителия кишечника, в том числе с энтероцитами [2, 3]. Такое взаимодействие включает следующие основные этапы: связывание с поверхностью клетки, эндоцитоз, экзоцитоз и трансцитоз бактерий, их фрагментов и белков [3]. Рецепторами для бактерий на поверхности энтероцитов служат как белки, так и гликолипиды и углеводы [4]. Бактериальную адгезию к тканям кишечного барьера моделируют с помощью различных клеточных линий [5]. Из клеточных линий наиболее часто в качестве модели используют клетки аденокарциномы толстого кишечника человека Сасо-2 [6–8]. В просвете здорового кишечника в ходе метаболизма комменсальных бактерий возникают условия гипоксии [5]. Низкий уровень кислорода стабилизирует индуцируемые гипоксией факторы HIF1α и HIF2α, которые, в свою очередь, влияют на барьерные функции кишечного эпителия [9]. Многие паталогические состояния кишечника также ассоциированы с развитием гипоксии [10]. Это подтверждает важность исследования всех этапов взаимодейcтвия кишечной микробиоты с эпителием при недостатке кислорода.

Растительные лектины — хорошо описанные белки, которые используют для изучения связывания белковых молекул с поверхностью клетки и процессов внутриклеточного транспорта [11, 12]. Рецепторами таких белков на поверхности клетки служат гликозилированные белки и липиды, что позволяет использовать лектины в качестве моделей при изучении взаимодействия бактерий с клетками. Целью настоящей работы было исследовать влияние гипоксии на процесс трансцитоза в клетках эпителия кишечника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линию иммортализованных клеток аденокарциномы ободочнойкишки Caсo-2 (Институт цитологии РАН; Санкт- Петербург) культивировали в среде MEM (Gibco; США) с добавлением 20%-й фетальной сыворотки крупного рогатого скота FBS (Gibco; США), 1%-го (v/v) раствора заменимых аминокислот (Gibco; США), пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) (Gibco; США). Клетки Сасо-2 культивировали в шестилуночных планшетах (Corning; США) в течение 23 суток до достижения состояния дифференцированных энтероцитов. Смену среды производили каждые 2–3 суток. Для индукции гипоксии в среду добавляли CoCl2 (Sigma-Aldrich; США) до концентрации 300 мМ и инкубировали 24 ч. Затем клетки промывали однократным (1×) DPBS (Gibco; США) и лизировали для анализа транскриптома и протеома, как было описано ранее [13, 14].

Оценку влияния гипоксии на состояние монослоя клеток проводили с помощью импедансной спектроскопии. Для этого перед посевом клеток Caco-2 в 96-луночные планшеты с мембранными вставками (Corning; США) все лунки планшета заполняли средой(50 мкл в верхнюю камеру, 235 мкл в нижнюю камеру) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в атмосфере 5%-го СО2. Затем клетки Caсo-2 рассеивали приблизительно по 5600 клеток на каждую мембранную вставку в объеме 50 мкл и культивировали в течение 23 суток до достижения состояния дифференцированных энтероцитов. Смену среды производили каждые 2–3 суток. Для индукции гипоксии в среду добавляли CoCl2, как описано выше.

Измерение импедансных спектров проводили в диапазоне частот от 40 до 20 000 Гц при помощи системы импедансной спектрометрии («БиоКлиникум»; Россия) и электрода STX100C96 (World Precision Instruments; США) при комнатной температуре [15]. Для получения средних значенийэлектрических параметров использовали три независимые мембранные вставки с клетками. Обработку полученных данных проводили при помощи языка программирования R 3.5 с графической оболочкой (R-Tools Technology; США)

Растительный лектин рицин выделяли из семян клещевины Ricinus communis, как описано ранее [16, 17]. Биотинилирование, анализ связывания с асиалофетуином и проверку цитотоксических свойств на клетках-мишенях проводили, как описано ранее [18–20].

Для оценки трансцитоза дифференцированные клетки Сасо-2 инкубировали со средой, содержащей биотинилированный рицин (1 × 10-7 М), в мембранных вставках. Белок добавляли в верхнюю камеру лунки на апикальную мембрану клеток. Для иммуноферментного анализа культуральную среду забирали из нижней камеры лунки через 1 и 6 ч.

Иммуноферментный анализ для определения концентрации лектина в культуральной среде проводили следующим образом. Моноклональные антитела RA999 против каталитической субъединицы рицина (10 мкг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (ФБ) pH 7,4 (Sigma-Aldrich; Германия) адсорбировали на 96-луночную плашку (Corning; США) по 100 мкл на лунку. Для отмывания использовали буфер ФБ, содержащий 0,05% Tween-20 (буфер ФБТ). В качестве неспецифичного белка использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) («Диаэм»; Россия). Для блокирования неспецифичных мест связывания использовали буфер ФБТ, содержащий 0,1% БСА. Культуральные среды разводили в 100 раз буфером ФБ, содержащим 50 мМ β-лактозы (Sigma-Aldrich; Германия) и наносили по 100 мкл в лунки плашки с иммобилизованными антителами. Все инкубации проводили при +37 °С в термошейкере. Биотинилированный лектин детектировали коньюгатом стрептовидина с пероксидазой хрена (Intitrogen; Германия). После инкубации с жидким субстратом 3,3',5,5’-тетраметилбензидином (Intitrogen; Германия) реакцию останавливали 1М раствором НСl и измеряли оптическую плотность при 450 нм на планшетном спектрофлуориметре SpectroMax i3х (Molecular devices; США). Моноклональные антитела были любезно предоставлены профессором П. Г. Свешниковым (лаборатория биотехнологии, Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения; Россия).
Анализ экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили так же, как описано ранее [14]. В качестве референсных использовали транскрипты генов ACTB и GAPDH.

Профиль экспрессии мРНК анализировали с помощью микрочипов Gene Chip Human Transcriptome Array 2.0 (TermoFisher Scientific-Affymetrix; США). Выделение, анализ качества и количества РНК проводили, как описано ранее [14]. Значение RIN для всех использованных образцов было выше 9,5. Для синтеза кДНК брали 500 нг выделеннойтотальнойРНК. Все стадии подготовки образцов, гибридизацию, промывание, окрашивание и сканирование микрочипов проводили так же, как описано ранее [21]. CEL-файлы, полученные при сканировании микрочипов, обрабатывали с помощью программного пакета Transcriptome Analysis Console 2.0 (TermoFisher Scientific-Affymetrix; США). Неаннотированные пробсеты (наборы проб на микрочипе) исключали из анализа. При оценке экспрессии генов в качестве порогового уровня сигнала на микрочипе выбирали значение 6,0 по логарифмическойшкале Affymetrix.

Профиль экспрессии микроРНК анализировали с помощью секвенирования «нового поколения» (NGS). Библиотеки NGS создавали из фракции малых РНК, полученной с использованием набора CATS small RNA-seq в соответствии с протоколом производителя (Diagenode; Бельгия). После ПЦР-амплификации библиотеки очищали с использованием магнитных шариков AMPure. Концентрации конечных библиотек измеряли с помощью набора Qubit v2.0 DNA High Sensitivity DNA Kit (TermoFisher Scientific; США). Затем объединенные библиотеки денатурировали и группировали на шести считывающих проточных ячейках Illumina HiSeq2000 V4 (Illumina; США) и секвенировали. Проводили 51 цикл глубокого секвенирования с шестицикловым индексированием ридов. Данные секвенирования HiSeq 2000 экспортировали в виде файла FASTQ, полученные риды подвергали обрезке адаптеров и удалению поли-(А)-хвоста.

Контроль качества FASTQ файлов секвенирования микроРНК осуществляли с помощью программы FastQC версии v0.11.9 (Babraham Bioinformatics; Великобритания). Cutadapt версии 2.8 использовали для обрезки адаптеров [22], риды короче 18 нуклеотидов удаляли. Экспрессию микроРНК оценивали с помощью программы miRDeep2 [23]. Анализ дифференциальной экспрессии проводили на языке R версии 3.6.3 (R-Tools Technology; США) с использованием библиотеки DESeq2 [24].

Статистическую обработку данных микрочипов осуществляли следующим образом. Исходные данные нормировали с использованием пакета oligo для языка программирования R (R-Tools Technology; США). Полученные данные логарифмировали по основанию 2. Анализ дифференциальной экспрессии генов и микроРНК проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Поправку на множественную проверку гипотез делали с помощью метода False Discovery Rate (FDR) и процедуры Бенджамини–Хохберга.

Функциональную аннотацию генов производили с помощью баз данных и алгоритмов DAVID версии 6.8 (Laboratory of Human Retrovirology and Immunoinformatics; США). Валидированные взаимодействия микроРНК и генов- мишеней были экспортированы из базы данных DIANA-TarBase версии 8 (DIANA Lab; Греция) [25]. Предсказание позиций связывания микроРНК на 3'-нетранслируемых областях мРНК-мишеней производили с помощью miRWalk [26]. Для поиска интронных микроРНК и их генов-хозяев использовали базу данных miRIAD.

Подготовку лизатов клеток линии Сасо-2, экстракцию тотального белка, гидролитическое расщепление и последующие процедуры для анализа протеомов проводили, как описано ранее [14]. После трипсинолиза надосадочную жидкость анализировали на масс-спектрометре Q-Exactive HFX в режиме положительнойионизации с использованием источника NESI (Thermo Fisher Scientific; США) при напряжении на эмиттере 2,1 кВ и температуре капилляра 240 °C. Для оценки дифференциально экспрессированных белков полученные первичные данные анализировали с помощью программного обеспечения MaxQuant 1.6 (алгоритм iBAQ) (Max-Planck-Institute of Biochemistry; Германия). Дальнейшую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения Perseus и языка программирования R 3.5 с интегрированнойсредойразработки RStudio 1.1 (R-Tools Technology; США). Для определения статистическойдостоверности наблюдаемых различийиспользовали t-критерийСтьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование энтероцитов кишечника в условиях гипоксии стимулирует трансцитоз и ассоциировано с изменением экспрессии генов, вовлеченных в транспорт везикул

Условия культивирования энтероцитов кишечника, имитирующие гипоксию, создавали путем обработки CoCl2 дифференцированных клеток аденокарциномы толстого кишечника человека Сасо-2. На основании измерения импедансных спектров было показано, что обработка CoCl2 не нарушает целостность монослоя Сасо- 2. Значение трансэпителиального сопротивления (TEER) сохраняется на уровне 2000 Ом, что свидетельствует об отсутствии выраженной цитотоксичности и гибели клеток.

Анализ профиля мРНК с помощью микрочипов показал, что обработка энтероцитов CoCl2 приводит к изменению экспрессии в два и более раз (FDR < 0,05) 165 генов, среди которых значимое увеличение было выявлено для генов, вовлеченных в ответ клеток на гипоксию: DDIT4 в 2,4, EGLN1 в 2,7, LDHA в 2,0, PFKFB3 в 2,1, SLC2A1 в 3,1, SLC2A3 в 3,0, а также VEGFA в 1,4. Изменение экспрессии данных генов было подтверждено методом ПРЦ-РВ (p < 0,05). Кроме того, функциональная аннотация дифференциально экспрессированных генов с помощью базы данных DAVID выявила значимое обогащение для сигнального пути HIF-1, опосредующего ответ на гипоксию (данные не представлены). Таким образом, обработка энтероцитов CoCl2 действительно имитирует условия гипоксии.

Для оценки эффективности трансцитоза через монослой энтероцитов кишечника в стандартных условиях культивирования и в условиях гипоксии дифференцированные клетки Сасо-2 в мембранных вставках обрабатывали с апикальной стороны средой, содержащей биотинилированный лектин рицин. В контрольных лунках со стандартными условиями культивирования проводили замену среды с апикальной стороны на свежую без лектина. Через 1 и 6 ч после замены среды в верхней камере среду из нижней камеры полностью отбирали и анализировали в ней содержание лектина с помощью иммуноферментного анализа. Мониторинг параметров импедансной спектроскопии в течение 6 ч обработки клеток лектином свидетельствовал о сохранении целостности монослоя, что согласуется с ранее полученными данными [27]. При этом значение TEER через 6 ч обработки лектином даже возрастало, как в контроле, так и при гипоксии (:media_1), что указывает на формирование более плотных межклеточных контактов. Таким образом, можно исключить возможность проникновения белковых молекул из верхней камеры мембранных вставок с монослоем энтероцитов в нижнюю путем парацитоза. Следовательно, попадание лектина из верхней камеры в нижнюю происходит только благодаря трансцитозу.

Результаты иммуноферментного анализа показали, что и при нормоксии и при гипоксии лектин действительно подвергается трансцитозу энтероцитами. При этом в условиях гипоксии через 6 ч обнаружено увеличение в 1,8 раза (p < 0,05) количества лектина, подвергшегося трансцитозу по сравнению со стандартными условиями культивирования (:media_2).
Отметим, что проведенный функциональный анализ дифференциально экспрессированных генов позволил идентифицировать 16 генов, вовлеченных во внутриклеточный транспорт везикул (табл. 1).

Для оценки изменения экспрессии генов в энтероцитах кишечника на уровне белка был проведен масс- спектрометрический анализ протеома. Общее число достоверно детектированных белков составило 3361. Содержание 237 белков достоверно различалось в 2 и более раз в энтероцитах, культивируемых при нормоксии и в условиях гипоксии. Из белков, кодируемых генами внутриклеточного транспорта везикул, экспрессия которых изменилась по данным микрочипов, в протеоме были обнаружены только четыре: apoB (ген АРОВ), SorLA-1 (ген SORL1), CAM-PRP (ген PPP3CA) и CEACAM1. При этом для apoB было показано достоверное снижение экспрессии (в 6,5 раза), что согласуется с данными транскриптомного анализа.

Регуляцию экспрессии генов APOB, SORL1, PPP3CA и CEACAM1 в энтероцитах кишечника могут осуществлять микроРНК

Для выявления возможного механизма регуляции экспрессии генов, вовлеченных во внутриклеточный транспорт везикул, был проведен анализ профиля экспрессии микроРНК с помощью NGS. Достоверное изменение экспрессии в 1,5 и более раз (р ≤ 0,05) было обнаружено для 16 микроРНК. Интересно, что семь из них являются регуляторами генов APOB, SORL1, PPP3CA и CEACAM1 [25]. При этом направление изменения экспрессии данных микроРНК антикоррелировало с направлением изменения экспрессии соответствующих мРНК-мишеней (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Огромное число данных о механизмах внутриклеточного везикулярного транспорта было получено благодаря исследованию проникновения в клетку растительного лектина рицина [11]. Связывание рицина с гликозилированными белками на поверхности клетки индуцирует эндоцитоз и последующий его транспорт в составе везикул внутри клетки к аппарату Гольджи и эндоплазматическому ретикулуму. Благодаря использованию рицина были установлены многие особенности апикального и базолатерального транспорта, а также трансцитоза в поляризованных эпителиальных клетках.

С каждым годом все больше внимания уделяют роли гипоксии и обусловленных гипоксией сигнальных путей в физиологии и патофизиологии кишечника. Кишечный эпителий обычно находится в состоянии физиологической гипоксии, однако дополнительная тканевая гипоксия является признаком активного воспалительного процесса [10]. Важнейшее условие нормального функционирования кишечника — сохранение барьерных функций монослоя эпительных клеток, выстилающих его поверность [2]. Однако опасность инфекционных заболеваний может сохраняться и при отсутствии очевидных нарушений монослоя клеток, причиной тому может быть изменение внутриклеточного транспорта везикул, содержащих бактерии, а именно трансцитоза [7, 28]. В нашей работе было показано, что в условиях гипоксии при сохранении целостности монослоя энтероцитов происходит значимое стимулирование трансцитоза лектина. Сравнительный анализ транскриптомов выявил изменение экспрессии генов, вовлеченных во внутриклеточный транспорт везикул, в клетках, культивируемых в условиях гипоксии. Значительное снижение APOB, одного из этих генов, было подтверждено и при анализе протеома. Интересно, что белок apoB является одним из ключевых регуляторов метаболизма липидов и холестирина энтероцитами [29, 30]. Локализуясь преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме, apoB способствует упаковке адсорбированных с апикальной стороны липидов и холестирина в пре- хиломикроны, apoB-содержащие частицы. Эти частицы в процессе транспорта в мембранных везикулах к аппарату Гольджи созревают до хиломикрон и секретируются с базолатеральной стороны энтероцитов посредством экзоцитоза. В здоровых энтероцитах кишечника образование apoB-содержащих частиц и их секреция происходят постоянно [29]. Возможно, что значительное снижение экспрессии apoB может активировать компенсаторные механизмы секреции адсорбируемых и накапливающихся липидов и холестирина, например трансцитоза. Отметим также, что накапливаемые в клетках липиды и холестирин служат основным строительным материалом для формирования мембран, что в свою очередь тоже может изменять мембранный транспорт в энтероцитах.

Для выяснения механизма регуляции наблюдаемых изменений был проанализирован профиль экспрессии микроРНК. Интересно, что семь из 16 микроРНК, обнаруженных дифференциально экспрессированными в ответ на гипоксию, оказались регуляторами дифференциально экспрессированных генов внутриклеточного транспорта везикул. Кроме того, направление изменения экспрессии микроРНК антикоррелировало с направлением изменения экспрессии соответствующих мРНК-мишеней. Полученные данные указывают на то, что возможным механизмом регуляции свойств энтероцитов в условиях гипоксии может быть микроРНК-зависимый механизм.

ВЫВОДЫ

На модели энтероцитов кишечника человека показано, что гипоксия стимулирует процесс трансцитоза. Это сопровождается изменением экспрессии генов, вовлеченных во внутриклеточный транспорт везикул. Обнаружено, что гипоксия ассоциирована с падением экспрессии apoB, важнейшего регулятора метаболизма липидов, как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Механизм регуляции изменения свойств клеток может включать регуляцию экспрессии генов посредством микроРНК. Дальнейшее изучение взаимосвязи метаболизма липидов и процесса трансцитоза позволит разработать препараты для снижения вероятности инфицирования тканей кишечника при воспалительных процессах.