Ежегодно в мире после хирургических вмешательств, травм и ожогов более чем у 100 млн пациентов образуются рубцы кожных покровов. В зависимости от локализации и глубины повреждения, условий заживления раны и индивидуальных особенностей организма процесс регенерации может значительно варьировать по проявлениям и последствиям и приводить к образованию нормальных (нормотрофических) или патологических рубцов. Чрезмерная активация гиперпластических процессов, развивающихся в силу различных причин, приводит к образованию так называемых гипертрофических и келоидных рубцов. Оба варианта рубцов — проявление фибропролиферативного расстройства, в результате которого происходят чрезмерная активация фибробластов в ране и аберрантное образование внеклеточного матрикса [1].

Для изучения патогенеза гиперпластических рубцов и разработки эффективных средств их профилактики и лечения необходимы удобные и доступные экспериментальные модели in vitro, получаемые на основе клеток, способных наиболее полно воспроизводить патологические профиброгенные программы. Использование с этой целью фибробластов, выделенных из области келоидов, сопряжено со сложностями доступа к достаточному количеству клинического материала, а также вариабельностью фенотипа клеток, полученных от различных доноров. В связи с этим поиск оптимальных модельных клеток, наиболее полно воспроизводящих фенотип келоидных фибробластов, является актуальной задачей. Представляется перспективным использовать с этой целью иммортализованные клеточные линии, имеющие неограниченное число делений и стабильный фенотип вне зависимости от клеточного пассажа.

Известно, что для келоидных фибробластов характерны высокая пролиферативная активность и быстрый рост, повышенная экспрессия коллагена I, фибронектина, эластина, периостина (регулирует синтез коллагена I типа), тенасцина (участвует в клеточной адгезии) [2, 3], что приводит к избыточной наработке соединительной ткани, в том числе за пределами локуса повреждения кожи, а также ряд метаболических особенностей, свойственных клеткам опухолей [4, 5].

Есть мнение, что фенотип фибробластов в патологических рубцах может определять высокая активность теломеразы [6]. Так, за счет снижения теломеразной активности в келоидных фибробластах, авторам одного из исследований удалось уменьшить активность роста и пролиферации клеток, а также нормализовать ряд других фенотипических параметров клеток, что позволило прийти к заключению о перспективности стратегии ингибирования теломеразы при терапии келоидов [5]. В этой связи представляет интерес оценка перспективы использования теломеризованных фибробластов для моделирования патологических гиперпластических рубцов in vitro.

При разработке адекватных моделей патологических рубцов важно использовать оптимальные способы культивирования клеток. Известно, что в центре келоидных тканей часто возникает гипоксия вследствие окклюзии капилляров из-за избытка коллагена и эндотелиальных клеток [7]. Краевые фибробласты метаболически более активны, проникают в окружающие ткани и активируют ангиогенез, предположительно, для поддержания инвазивности [8]. В связи с этим перспективны модели, основанные на культивировании клеток в виде клеточных сфероидов.

Для индукции профиброгенного фенотипа фибробластов in vitro часто используют трансформирующий фактор роста β1 (TGFβ1) [9]. Этот многофункциональный белок регулирует рост клеток, дифференцировку, подвижность и выработку внеклеточного матрикса в нормальном процессе заживления ран, но его повышенная экспрессия может приводить к развитию фиброзных нарушений [10]. TGFβ1 стимулирует рост и секрецию коллагена, индуцирует биосинтез фибронектина в келоидных фибробластах [11]. Представляет интерес функциональный ответ потенциальных модельных клеток на воздействие данного ростового фактора.
Целью исследования было оценить перспективу использования теломеризованных фибробластов в качестве объекта при 3D-моделировании патологических гипертрофических рубцов in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии

Исследование проводил на культурах нормальных (НФ) и теломеризованных (Фб-hTERT) фибробластов кожи человека. НФ были получены из криобанка («Перспектива»; Россия) и представляли собой первичные клеточные линии фибробластов третьего пассажа, выделенные из крайней плоти доноров в возрасте 35–38 лет. Для учета индивидуальных особенностей клеток, полученных от различных доноров, при проведении экспериментов были использованы три клеточные линии.
Фб-hTERT были любезно предоставлены проф. Е. Е. Егоровым (Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН). Культура была получена в результате введения гена каталитического компонента теломеразы в фибробласты кожи линии 1608. Данные клетки имеют устойчивый фенотип, воспроизводимый до 200-го пассажа [12].

Культивирование клеток

Для культивирования использовали полную культуральную среду DMEM/F-12 (Gibco; США), содержавшую 10% FBS («Диаэм»; Россия), 1%-й раствор антибиотика- антимикотика (в финальной концентрации: пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 ед./мл, амфотерицин Б 0,25 мкг/мл) (Gibco; США) и 1%-й раствор GlutaMAX (финальная концентрация дипептида L-аланил-L-глутамина — 2 мМ) (Gibco; США).

Исследование влияния TGFβ1 на клетки методом МТТ

Для МТТ-теста [13] в каждую лунку плоскодонного 96-луночного планшета вносили по 2,5 тыс. клеток НФ (четвертый пассаж) и Фб-hTERT из культурального флакона с 70%-й конфлюентностью и преинкубировали 24 ч в полной среде DMEM/F-12 при 37 °С и 5% СО₂. Затем среду меняли на свежую, содержащую TGFβ1 (ProSpec; Израиль), и инкубировали клетки еще 48 ч, меняя среду каждые 24 ч. Среду отбирали, лунки промывали раствором DPBS (Gibco; США), добавляли по 100 мкл раствора МТТ («Диаэм»; Россия) с концентрацией 1 мг/мл и инкубировали 2,5 ч при 37 °С и 5% СО₂. По истечении этого времени раствор МТТ заменяли раствором ДМСО («Биолот»; Россия) и инкубировали клетки при комнатной температуре до полного растворения кристаллов формазана. Определяли оптическую плотность в каждой лунке на 490 нм (с учетом фонового поглощения на 655 нм). МТТ-тест проводили в трех повторах по пять лунок при следующих концентрациях TGFβ1: 0 нг/мл; 0,1 нг/мл; 1 нг/мл; 5 нг/мл; 10 нг/мл.
Метаболическую активность рассчитывали по следующей формуле (ОП — оптическая плотность): 100% * (ОП₄₉₀ (опытных лунок) — ОП₄₉₀ (среды))/(ОП₆₅₅ (контрольных лунок) — ОП₆₅₅ (среды)).

Культивирование клеток в виде сфероидов

Для получения сфероидов использовали 96-луночные планшеты ultra low attachment (Corning; США), в которые вносили 5, 10 или 20 тыс. клеток (НФ или Фб-hTERT) на лунку из культурального флакона с 70%-й конфлюентностью и инкубировали девять суток в полной среде DMEM/F-12 при 37 °С и 5% СО₂. Среду меняли каждые 24 ч.
Для исследования влияния TGFβ1 на сфероиды вносили 20 тыс. клеток НФ и 10 тыс. клеток Фб-hTERT на лунку (для получения сфероидов примерно одинакового размера) из культурального флакона с 70%-й конфлюентностью и инкубировали трое суток в полной среде DMEM/F-12 с добавлением 1 нг/мл TGFβ1 при 37 °С и 5% СО₂. Среду меняли каждые 24 ч для поддержания концентрации фактора роста на постоянном уровне.
Каждый сфероид фотографировали ежедневно в течение всего срока культивирования с помощью микроскопа Primovert (Carl Zeiss; Германия). Определение параметров сфероидов (диаметр) производили с помощью программного пакета для обработки изображений ImageJ и его расширения Fiji (National Institutes of Health; США) [14].

Оценка скорости зарастания дефекта монослоя клеток с помощью scratch-теста

В лунки 24-луночного планшета вносили по 50 тыс. клеток НФ и Фб-hTERT из культурального флакона с 70%-й конфлюентностью и преинкубировали 24 ч в полной среде DMEM/F-12 при 37 °С и 5% СО₂ до образования монослоя в лунке. Затем среду меняли, наносили стандартизированное повреждение монослоя с помощью наконечника объемом 1 мл, промывали клетки раствором DPBS и добавляли среду DMEM/F-12 (контроль) или DMEM/F-12 с TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл (опыт). После этого клетки инкубировали в течение двух суток. Каждую лунку фотографировали по всей длине повреждения ежедневно. Обработку фотографий проводили в программе CellProfiler (Broad Institute of Harvard and MIT; США) [15]. Вычисляли площадь восстановления дефекта за 24 ч и 48 ч и находили процентное соотношение с начальной площадью дефекта. Эксперимент проводили в трех повторах по три лунки.

Определение уровня экспрессии генов, ассоциированных с гиперпластическими процессами, методом qRT-PCR

С учетом литературных данных в качестве целевых генов были выбраны гены, кодирующие синтез коллагена I, коллагена III, фибронектина, а также ген PAI-1. Данный список генов, безусловно, не является исчерпывающим, но увеличение уровня их экспрессии позволяет констатировать факт модуляции профиброгенного потенциала клеток.
Для qRT-PCR во флакон вносили клеточную суспензию (по 200 тыс. клеток в 5 мл среды) преинкубировали клетки 48 ч в полной среде DMEM/F-12 при 37 °С и 5% СО₂. Затем среду меняли на содержащую 1 нг/мл TGFβ1 и инкубировали клетки еще 48 ч, меняя среду каждые 24 ч. После этого из клеток выделяли РНК с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen; Германия) по стандартному протоколу. Количество полученной РНК измеряли на приборе NanoDrop 2000c (Thermo Scientific; США). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор MMLV RT kit («Евроген»; Россия) по стандартному протоколу, добавляя в реакцию по 1 мкг РНК. qPCR проводили, используя qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген»; Россия). Для каждого гена и каждого образца реакцию проводили в трех повторах. В качестве референсного гена использовали GAPDH.

Использовали следующие праймеры: GAPDH Forward Primer F: 5'-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3' Reverse Primer R: 5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3'; COL1A1 F: 5'-CCAAGAGGAAGGCCAAGTC-3' R:5'ACACGTCTCGGTCATGGTA-3'; COL3A1 F: 5'-CTGGTGCTAAGGGTGAAGTT-3' R: 5'-GTCCAGGTTCTCCTCTTTGTC-3'; FN1 F: 5'-GAATAAGCTGTACCATCGCAAAC-3' R: 5'-ACCAAGACACACACACTCTAAC-3'; PAI-1 F: 5'-GGCTGACTTCACGAGTCTTT-3' R: 5'-CGTTCACCTCGATCTTCACTT-3';

Определение синтеза коллагена I клетками сфероидов

Сфероиды формировали, как описано выше. После трех суток инкубации сфероиды из 10 тыс. клеток фиксировали в 4%-м формалине, подвергали стандартной гистологической проводке с заключением в парафин, изготавливали парафиновые срезы и окрашивали первичными антителами козы к коллагену I человека («ИМТЕК»; Россия) и вторичными FITC-конъюгированными антителами к IgG козы (ab6881, Abcam; США). Для каждой группы использовали три биологических образца, для дальнейшей окраски брали по пять срезов с образца. Все препараты подвергали окрашиванию одновременно с использованием единого набора реактивов (разведений антител и буферов).
Полученные препараты последовательно визуализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss; Германия) с использованием одинаковых настроек. Обработку фотографий проводили в программе CellProfiler [15]. Для каждого образца вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции (суммарная интенсивность, деленная на площадь сфероида). Значения средней интенсивности флуоресценции нормировали на значение средней интенсивности флуоресценции в группе НФ без воздействия TGFβ1.

Статистическая обработка данных

Полученные результаты обрабатывали с помощью языка программирования для статистической обработки данных R. Различие между группами определяли с помощью t-критерия с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественное сравнение. Статистически значимыми различия считали при p < 0,05. Данные представлены в виде M ± m, если не указано иное.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нормальные и иммортализованные фибробласты кожи различались размерами и пролиферативной активностью. При выращивании в низкой плотности (менее 50% конфлюентности) НФ имели площадь 723 ± 54 мкм² (рис. 1А). Время удвоения, рассчитанное по формуле DT = T * ln2 / ln (X₁/X₀), где Т — время инкубации, Х₁ — конечное количество клеток, Х₀ — начальное количество клеток, для данных клеток составило 3,1 ± 0,6 сут. 100%-ю конфлюентность клетки при культивировании в виде монослоя достигали при плотности 16,5 ± 3,1 тыс./см².

Площадь клеток Фб-hTERT была меньшей 675 ± 29 мкм² (рис. 1А). Время удвоения составило 1,8 ± 0,4 сут. 100%-ю конфлюентность клетки достигали при плотности 41,9 ± 7,2 тыс./см².

МТТ-тест показал дозозависимое влияние TGFβ1 на культуры НФ и Фб-hTERT (рис. 1Б). Достоверное увеличение метаболической активности Фб-hTERT и НФ обнаружено при добавлении 0,1 нг/мл и 1 нг/мл TGFβ1 соответственно. Максимальное увеличение метаболической активности клеток обеих линий наблюдали при воздействии TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл, и оно было достоверно выше у Фб- hTERT (179 ± 12% и 135 ± 13% соответственно; p < 0,05). Дальнейшее увеличение концентрации ростового фактора в среде приводило к уменьшению метаболической активности клеток, по сравнению с воздействием 1 нг/мл TGFβ1. Исходя из полученных данных, для повышения профиброгенной активности клеток в дальнейшем использовали TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл.
С помощью scratch-теста было продемонстрировано, что восстановление дефекта монослоя клеток НФ и Фб-hTERT, в том числе в условиях воздействия TGFβ1, различалось (рис. 2).

Величина данного показателя через 24 и 48 ч от начала исследования была достоверно выше у контрольных (без воздействия TGFβ1) клеток НФ, в сравнении с контрольными клетками Фб-hTERT. В то же время после добавления в среду культивируемых клеток TGFβ1 скорость зарастания дефекта монослоя у НФ на всем протяжении исследования не имела достоверных различий с контролем. В тех же условиях величина анализируемого показателя у Фб-hTERT достоверно превышала таковую у клеток контроля более чем в два раза как через 24 ч после начала исследования (33 ± 8% и 13 ± 7% соответственно), так и на вторые сутки наблюдения (61 ± 10% и 30 ± 7% соответственно). Таким образом, НФ в сравнении с Фб-hTERT быстрее восстанавливали дефект монослоя в интактном состоянии, а клетки Фб-hTERT, напротив, при стимуляции TGFβ1.

При культивировании клеток в виде клеточных сфероидов, сформированных из различного количества исследуемых клеток (5 тыс., 10 тыс. и 20 тыс.), было установлено, что во всех экспериментальных ситуациях размер сфероидов уменьшался в течение первых пяти суток культивирования, а затем оставался относительно стабильным (рис. 3А). Причем, чем больше было взято клеток для формирования сфероида, тем более выраженной была скорость уменьшения его размеров, что характерно как для НФ, так и для Фб-hTERT.
Размеры сфероидов из клеток Фб-hTERT превосходили размеры сфероидов из НФ примерно в два раза, несмотря на то что сами клетки Фб-hTERT меньше, чем НФ.
Для оценки влияния TGFβ1 на клетки НФ и Фб- hTERT, культивируемые в виде сфероидов, использовали клеточные образования, сформированные из 20 тыс. клеток — для НФ и 10 тыс. клеток — для Фб-hTERT (рис. 3Б).

Используемое число клеток позволяло получить сфероиды примерно сопоставимых размеров. Данный параметр важен для функционирования подобных клеточных образований, так как определяет интенсивность трофических процессов в краевых и центральных клетках, а также интенсивность гипоксии в центре сфероида.
В условиях добавления в питательную среду TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл через 24 ч было обнаружено достоверное увеличение размеров сфероидов, сформированных из НФ, в сравнении с размерами сфероидов контрольной группы, состоящих из клеток НФ (рис. 4). Затем данные различия уменьшались и исчезали к третьим суткам культивирования.

Сфероиды, полученные из Фб-hTERT, вели себя несколько иначе. В присутствии TGFβ1 их размер на первые и вторые сутки культивирования достоверно уменьшался по сравнению с контролем. К третьим суткам данные различия также нивелировались.
Отмеченные незначительные различия в динамике изменения размеров сфероидов из НФ и Фб-hTERT при воздействии TGFβ1 на ранних сроках культивирования можно объяснить фенотипическими особенностями клеток разных линий, а также их исходно разным числом в клеточном образовании. Однако следует отметить, что на третьи сутки культивирования по мере формирования и уплотнения сфероидов данные различия практически отсутствовали.
Клетки НФ и Фб-hTERT имели различия в экспрессии генов, ассоциированных с развитием гиперпластических процессов, как в интактном состоянии, так и при воздействии TGFβ1 (рис. 5).

В интактных НФ по сравнению с Фб-hTERT выявлена тенденция к повышению экспрессии генов, кодирующих синтез коллагенов I и III. В клетках Фб-hTERT, в свою очередь, несколько более активно экспрессировался PAI-1. Экспрессия гена, кодирующего синтез фибронектина, в клетках НФ и Фб-hTERT была сопоставимой.

При инкубации исследуемых клеток с TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл в течение двух суток в клетках НФ по сравнению с контролем отмечена тенденция к увеличению экспрессии всех исследованных генов. Значимые различия выявлены для гена, кодирующего синтез фибронектина.

В то же время в клетках Фб-hTERT при воздействии TGFβ1 достоверное изменение экспрессии COL1A1, COL3A1, FN1, PAI-1 не обнаружено.

Отмеченные различия базовой и стимулированной TGFβ1 экспрессии коллагена I клетками НФ и Фб-hTERT сохранялись и при их культивировании в виде сфероидов (рис. 6А). По данным микроскопического исследования, уровень экспрессии коллагена в сфероидах, сформированных из НФ, был значительно выше, чем в сфероидах Фб-hTERT (рис. 6Б). При воздействии TGFβ1 в сфероидах, сформированных из НФ, наблюдалось выраженное увеличение продукции коллагена I в 1,7 раз, в то время как в сфероидах, полученных из Фб-hTERT, в тех же экспериментальных условиях увеличение экспрессии коллагена I было умеренным (в 1,4 раза).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведено сравнительное исследование нормальных и теламеризованных фибробластов кожи человека (НФ и Фб-hTERT соответственно) в аспекте возможности стимулирования их профиброгенного потенциала in vitro. Известно, что в фибробластах, выделенных из келоидных рубцов, происходит активация теломеразы [6]. По этому параметру келоидные фибробласты оказываются отчасти схожими с иммортализованными клетками, что определяет перспективность использования Фб-hTERT в качестве модельных клеток при разработке in vitro моделей патологических гиперпластических (келоидных и гипертрофических) рубцов. В то же время, по данным литературы, фенотип нормальных фибробластов может быть значительно приближен к таковому у клеток, выделенных из патологических рубцов, в результате использования ростовых факторов, играющих ключевое значение в патогенезе гиперпластических патологических процессов, в частности TGFβ1 [16]. Известно, что данный ростовой фактор активирует множество сигнальных каскадов, приводящих к увеличению пролиферации, адгезии и миграции клеток, продукции внеклеточного матрикса [17].

Как было отмечено ранее, для моделирования in vitro любой ткани, в том числе соединительной ткани в норме и при патологическом рубцевании, важно воспроизведение ее трехмерной структуры, позволяющее обеспечивать поведение клеток с учетом их межклеточного взаимодействия и взаимного влияния. В связи с этим исследованы фенотипические особенности НФ и Фб-hTERT при их культивировании в виде клеточных сфероидов. Эту модель активно используют для исследования канцерогенеза и экспериментальной оценки эффективности противораковой терапии, ввиду того что микроокружение, питание, газообмен и физиология клеток в сфероидах наиболее точно воспроизводят таковые в опухолях [18]. В то же время сфероиды ранее не использовали для создания клеточной модели патологического гиперпластического рубца, что определяет новизну полученных результатов.
В целом, интактные Фб-hTERT по сравнению с НФ имели ряд фенотипических признаков, характерных для иммортализованных клеток: более мелкие размеры, высокую скорость удвоения и формирования конфлюентного монослоя, что, по-видимому, обусловлено их высокой пролиферативной активностью. Эта особенность Фб-hTERT, вероятно, также определяет и более высокую по сравнению с НФ метаболическую активность клеток в покое и при воздействии TGFβ1 (данные МТТ-теста).

Метод МТТ позволяет оценить метаболическую или при некоторых допущениях пролиферативную активность клеток [19]. В настоящем исследовании показано дозозависимое влияние TGFβ1 на метаболическую активность НФ и Фб-hTERT, более выраженное для Фб- hTERT. Данное наблюдение согласуется с результатами других исследований, посвященных оценке влияния TGFβ1 на пролиферативную и метаболическую активность фибробластов [20, 21]. В целом наибольшее увеличение метаболической активности исследованных клеток было отмечено при воздействии TGFβ1 в концентрации 1 нг/мл, более выраженное — у Фб-hTERT.

Динамика изменения размеров сфероидов в процессе их культивирования, зарегистрированная в настоящем исследовании, согласуется с результатами других экспериментов [22, 23]. В них также отмечены резкое уменьшение размеров сфероидов в первые сутки культивирования и последующий постепенный переход на плато, что называют «созреванием» клеточного сфероида. Представляются также закономерными результаты о более резком уменьшении размеров сфероидов, для формирования которых использовали большее число клеток (максимальным этот показатель был для сфероидов, сформированных из 20 тыс. клеток), так как оптимальными, с точки зрения возможности обеспечения проникновения питательных веществ к клеткам сфероида и адекватного газообмена, считают диаметры сфероидов в диапазоне от 200–500 мкм [24].

Необходимо отметить, что сфероиды, сформированные из Фб-hTERT, были значительно крупнее сфероидов, полученных из НФ, несмотря на более крупные размеры данных клеток. Это может быть обусловлено более высокой пролиферативной активностью теламеризованных клеток. В то же время нельзя исключить, что сфероиды из Фб- hTERT имели сниженную способность к уплотнению (ретракции) за счет слабых межклеточных контактов.

Воздействие TGFβ1 приводило к уменьшению размеров сфероидов, сформированных из Фб-hTERT, а также увеличивало скорость заполнения дефекта монослоя (scratch-тест), более низкую у интактных Фб-hTERT, по сравнению с НФ. Возможно, наряду с увеличением пролиферативной активности в данной экспериментальной ситуации усиливалась способность клеток Фб-hTERT к адгезии и межклеточной кооперации. Однако данный вопрос требует дальнейшего изучения.

Важно отметить, что клетки Фб-hTERT имели и другие фенотипические отличия от нормальных дифференцированных фибробластов. Например, продукция основных специфических для данных клеток белков, используемых для формирования структур волокнистой соединительной ткани (коллаген I и III типов, фибронектин), была снижена, по сравнению с НФ как в интактных клетках, так и при стимуляции TGFβ1, в том числе при культивировании клеток в виде сфероидов (данные ПЦР-исследования, флуоресцентного окрашивания клеток в составе сфероидов). Так как данные клетки иммортализованы, по-видимому, в них наиболее активны программы пролиферации, а не дифференцировки. В связи с этим, как в исходных, так и в стимулированных клетках, наблюдается низкая экспрессия генов, связанных с продукцией коллагена (характерна для дифференцированных клеток соединительной ткани). В то же время НФ демонстрировали состоятельность этих программ, активность которых возрастала при воздействии TGFβ1.

Как известно, экспрессия генов, обеспечивающих синтез компонентов соединительной ткани, оказывается повышенной в клетках келоидных рубцов. Рядом исследователей показано повышение транскрипции и трансляции коллагена I и III типов, фибронектина в локусах гиперпластических процессов [2]. Повышенным уровнем экспрессии гена ингибитора активатора плазминогена PAI-1, не характерным для нормальных фибробластов, объясняют увеличение количества коллагена в келоидах [25]. Примечательно, что в нашем исследовании экспрессия гена PAI-1 у интактных клеток Фб-hTERT была выше, чем у НФ.

Кроме того, интактные НФ более активно, по сравнению с Фб-hTERT, восстанавливали дефект монослоя (scratch- тест). Данный методический подход используют для косвенной оценки регенераторного потенциала клеток (способности восстанавливать дефект). При этом скорость заполнения дефекта клетками обусловлена увеличением их пролиферации и/или миграционной активности. Известно, что TGFβ1 способствует заживлению ран [17]. В наших экспериментах воздействие TGFβ1 приводило к увеличению скорости заполнения дефекта клетками Фб- hTERT, но не НФ. Для оценки данного результата необходим дальнейший анализ влияния TGFβ1 в клетках Фб-hTERT и НФ на клеточные программы адгезии и межклеточной кооперации, участвующие в реализации способности клеток к миграции.

ВЫВОДЫ

Теломеризованные фибробласты имеют ряд фенотипических признаков, характерных для келоидных фибробластов: высокую пролиферативную и метаболическую активность; способность по сравнению с НФ восстанавливать дефект монослоя (scratch-тест) под воздействием TGFβ1; повышенный по сравнению с НФ уровень экспрессии гена PAI-1 (на уровне тенденции, статистически незначимо). Важны их способность к неограниченному числу делений, фенотипическая однородность клеток различных пассажей, способность образовывать клеточные сфероиды, что определяет перспективность использования данных клеток при 3D-моделировании патологических гиперпластических рубцов. Однако в данных клетках снижена экспрессия белков, ассоциированных с продукцией компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL3A1, FN1), в том числе и при воздействии TGFβ1. В то время как для келоидных фибробластов характерна гиперпродукция данных белков. Данное обстоятельство следует учитывать при использовании Фб-hTERT для моделирования патологических гипертрофических рубцов. Целесообразны дальнейшие исследования для оценки возможности и условий активации экспрессии белков внеклеточного матрикса в данных клетках.