В результате метаболизма комменсалитических бактерий кишечный эпителий в норме находится в состоянии физиологической гипоксии [1]. Однако в ходе паталогических процессов, включая воспалительные и опухолевые заболевания, в кишечнике возникает дополнительная тканевая гипоксия [2]. При этом можно наблюдать значительные изменения в транскриптоме клеток и структуре поверхности энтероцитов кишечника [3], что может послужить причиной нарушения важнейших свойств эпителия кишечника, включая реализацию барьерной функции и свойство дифферециальной абсорбции, а также нарушение взаимодействия с микробиотой. В связи с этими изменениями с каждым годом растет внимание к исследованию гипоксии на функционирование кишечника.

Для моделирования условий гипоксии в исследованиях in vitro используют несколько подходов: применение газовой смеси с пониженным содержанием кислорода [4] либо миметики, механизм действия которых основан на увеличении внутриклеточной концентрации HIF-1α — фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией. К таким миметикам гипоксии относят производные оксихинолина [5], хелаторы ионов Fe2+ и диметилоксалилглицин (DMOG) [4], однако наиболее широко используют хлорид кобальта (II) (CoCl2) [6], в том числе в исследованиях in vitro моделей кишечника [7]. Он стабилизирует факторы HIF-1α и HIF-2α, которые в норме быстро деградируют.

МикроРНК — класс коротких (в среднем 22 нуклеотида) некодирующих РНК, осуществляющих посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов [8]. Около половины генов микроРНК млекопитающих кодируются в интронах других генов. МикроРНК в комплексе с белками семейства Argonaute способны комплементарно взаимодействовать с мРНК-мишенью, причем комплементарность обычно неполная [8]. Как правило, для эффективного взаимодействия с мРНК достаточно полной комплементарности только в пределах 2-7/8 н. микроРНК (так называемый seed region), хотя нередко присутствует несколько дополнительных комплементарных нуклеотидов. Белки Argonaute привлекают другие белковые комплексы, осуществляющие репрессию трансляции и деградацию мРНК-мишени. Около 60% всех кодирующих белки генов регулируются микроРНК. К настоящему времени накоплено множество данных о ключевой роли микроРНК в широком спектре патофизиологических процессов, включая внутриклеточные и межклеточные взаимодействия [9], онкологические заболевания, бактериальные и вирусные инфекции [10]. Так, недавно были обнаружены семейства человеческих микроРНК hsa-let-7e / hsa-mir-125a и hsa-mir-141 / hsa-miR-200, регулирующие экспрессию генов ACE2 и TMPRSS2, являющихся входными воротами для коронавирусной инфекции [10].

Для моделирования кишечного барьера in vitro широко используют линию клеток Caco-2 [11]. Данная клеточная линия изначально была получена от пациента с аденокарциномой толстой кишки, однако по мере роста в культуре клетки Caco-2 дифференцируются, образуют монослой поляризованных призматических клеток, экспрессирующих целый ряд ферментов щеточной каемки и мембранных транспортеров, характерных для клеток эпителия тонкого кишечника [12]. Данные протеомного анализа свидетельствуют о близости дифференцированных клеток Caco-2 к нативным энтероцитам кишечника [13]. Фокусом исследования в настоящей работе является влияние гипоксии на адгезионные свойства эпителия кишечника. Существенная роль в процессах адгезии принадлежит интегринам — суперсемейству трансмембранных рецепторов, ответственных за взаимодействие с компонентами внеклеточного матрикса, а также с белками, расположенными на поверхности других клеток, в том числе бактериальных. Все интегрины представляют собой гетеродимеры, состоящие из α- и β-субъединиц. У млекопитающих имеются 18 α- и 8 β-субъединиц, в клетках Caco-2 одними из основных являются α-2, 5, V и β-1, 3, 4 субъединицы [14], что совпадает с профилем субъединиц интегринов в первичных энтероцитах человека [15]. Целью работы было провести оценку изменений в траскриптоме и протеоме клеток Caco-2 в норме и в условиях гипоксии и сравнить полученные результаты с изменениями в транскриптоме клеток Caco-2 при культивировании в микрофлюидном чипе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток линии Caco-2

Линию иммортализованных клеток аденокарциномы ободочнойкишки Caсo-2 (Институт цитологии РАН; Санкт- Петербург) культивировали в среде MEM (Gibco; США) с добавлением 20%-й фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS, Gibco; США), 1%-го (v/v) раствора заменимых аминокислот (Gibco; США), пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) (Gibco; США). Клетки Caco-2 культивировали в шестилуночных планшетах (Corning; США) в течение 23 суток до достижения состояния дифференцированных энтероцитов. Смену среды производили каждые 2–3 суток. Для моделирования гипоксии в среду добавляли CoCl2 (Sigma-Aldrich; США) до концентрации 300 мкМ и инкубировали 24 ч, как опубликовано ранее [7]. После инкубации клетки промывали 1 × DPBS (Gibco; США) и лизировали для анализа транскриптома и протеома, как описано ранее [16].

Оценку влияния гипоксии на состояние монослоя клеток проводили с помощью импедансной спектроскопии. Для этого перед посевом клеток Caco-2 в 96-луночные планшеты с мембранными вставками (Corning; США) все лунки планшета заполняли средой(50 мкл в верхнюю камеру, 235 мкл в нижнюю камеру) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в атмосфере 5% СО2. Затем клетки Caсo-2 рассеивали приблизительно по 5600 клеток на каждую мембранную вставку в объеме 50 мкл и культивировали в течение 23 суток до достижения состояния дифференцированных энтероцитов. Смену среды производили каждые 2–3 суток. Для индукции гипоксии в среду добавляли CoCl2, как описано выше.

Для оценки влияния перфузии на транскриптом клеток Caco-2 проводили культивирование в микрофлюидном чипе БАВР.942514.001 МЧ, разработанном в ходе выполнения работ по гранту Министерства образования и науки РФ по теме «Исследование адгезии бактерий в микрофлюидной модели кишечного барьера человека». Данный чип представляет собой проточную систему, содержащую две ячейки для культивирования клеток, каждая из которых разделена мембраной c порами 0,4 мкм.

Предварительно лунки микрофлюидного чипа покрывали ламинином 332 (Biolamina; Швеция). Для этого вносили по 57 мкл раствора ламинина 332 в DPBS (0,01 мг/мл) и инкубировали в течение 24 ч в холодильнике при 4 °С. Затем открепляли клетки Caco-2 от подложки при помощи раствора трипсина-ЭДТА 0,25% с солями Хенкса, после чего ресуспендировали клетки в питательной среде и проводили подсчет их числа при помощи автоматического счетчика клеток Countess (Invitrogen; Германия). В каждую лунку чипа добавляли по 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 20 000 клеток Caco-2, и инкубировали чипы в клеточном инкубаторе (5% СО2, 37 °С) в течение 2 ч. После инкубации подключали чип к перистальтическому насосу и включали перфузию жидкости в режиме 50 мкл/ч. Клетки культивировали 2 дня, регулярно проверяя трансэпителиальное сопротивление (не менее двух раз в сутки) до достижения значения 350 Ом·см2 в клеточном инкубаторе (5% СО2, 37 °С). По достижении состояния дифференцированных энтероцитов клетки промывали 1 × DPBS (Gibco; США) и лизировали для анализа транскриптома, как описано ранее [16].

Исследование влияния покрытия мембраны коллагеном IV и ламинином 332 на пролиферацию клеток Caco-2

Поверхность мембранных вставок Transwell 96-луночного планшета Corning покрывали коллагеном IV и ламинином 332.
Для этого в соответствующие вставки вносили 50 мкл раствора коллагена IV в DPBS (0,1 мг/мл) или 57 мкл раствора ламинина 332 в DPBS (0,01 мг/мл) и инкубировали в течение 24 ч в при 4 °С. Затем вставки отмывали от несвязавшегося компонента внеклеточного матрикса и заполняли лунки планшета питательной средой (50 мкл в верхнюю камеру, 235 мкл в нижнюю камеру). Планшет помещали в клеточный инкубатор (5% СО2, 37 °С) и инкубировали 1 ч. После инкубации среду из мембранных вставок отбирали и вносили 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 5000, 10 000 или 20 000 клеток, инкубировали в клеточном инкубаторе (5% СО2, 37 °С) в течение 96 ч. После культивирования в среду добавлялся реагент MTS в конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали при 37 °C в течение 4 ч. Затем проводили измерение оптической плотности раствора при длине волны 590 нм.

Измерение импедансных спектров и вычисление электрических параметров

Измерение импедансных спектров проводили в диапазоне частот от 40 до 20 000 Гц при помощи системы импедансной спектрометрии («БиоКлиникум»; Россия) и электрода STX100C96 (World Precision Instruments; США) при комнатной температуре. Для получения средних значенийэлектрических параметров использовали три независимые мембранные вставки с клетками. Расчет основных электрических параметров клеточного монослоя (трансэпителиального электрического сопротивления TEER (transepithelial electrical resistance), электрической емкости C, фонового сопротивления RM) проводили при помощи программного обеспечения CEISA Impedance fitting («БиоКлиникум»; Россия) по эквивалентной электрической схеме монослоя клеток (рис. 1). Дальнейшую статистическую обработку полученных данных проводили при помощи языка программирования R 3.5 с графической оболочкой RStudio. Для оценки статистической значимости наблюдаемых различий TEER применяли двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считали значимыми при p < 0,05.

Анализ транскриптомов

Анализ транскриптомов проводили с помощью микрочипов Gene Chip Human Transcriptome Array 2.0 для мРНК и Gene Chip miRNA 4.0 для микроРНК (TermoFisher Scientific-Affymetrix; США). Выделение, анализ качества и количества РНК проводили, как описано ранее [16]. Значение параметра качества RIN (RNA integrity number) для всех исcледуемых образцов было выше 9,5. Для синтеза кДНК брали 500 нг выделеннойтотальнойРНК. Все стадии подготовки образцов, гибридизацию, промывание, окрашивание и сканирование микрочипов проводили по методике производителя. CEL-файлы, полученные при сканировании микрочипов, обрабатывали с помощью программного пакета Transcriptome Analysis Console 2.0 (TermoFisher Scientific-Affymetrix; США). Для каждого гена на микрочипе представлено неколько проб к разным участкам гена, которые вместе формируют набор проб (или пробсет). Наборы проб на микрочипе, не соответствующие ни одному из известных на сегодняшний момент генов (неаннотированные наборы проб), из анализа были исключены. При оценке экспрессии генов в качестве порогового уровня сигнала на микрочипе было выбрано значение 6,0 по логарифмическойшкале Affymetrix.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)

ПЦР-РВ проводили, как описано ранее [16]. Детекцию накопления ПЦР-продукта в режиме реального времени проводили на основании разгорания флуоресценции SYBR Green I. В качестве референсных использовали транскрипты генов ACTB и GAPDH (средние значения пороговых циклов: 25,3 и 23,4 соответственно). Нуклеотидные последовательности праймеров («Синтол»; Россия) представлены в табл. 1.

Анализ протеомов клеток Caco-2

Подготовку проб клеток линии Caco-2, экстракцию тотального белка, гидролитическое расщепление и последующие процедуры проводили, как подробно описано ранее [16]. После трипсинолиза надосадочную жидкость анализировали на масс-спектрометре Q-ex-active HFX в режиме положительнойионизации с использованием источника NESI (Thermo Fisher Scientific; США) при напряжении на эмиттере 2,1 кВ и температуре капилляра 240 °C. Количественную оценку содержания белков проводили с использованием программного обеспечения Progenesis IQ (Waters; США), с параметрами, предлагаемыми производителем. Идентификацию белков проводили с помощью программы SearchGUI v.3.3.1 и базы данных HumanDB (UniProt Release 2018_05) со следующими поисковыми параметрами: расщепляющийфермент — трипсин, точность определения масс моноизотопных пептидов ±5 ppm, точность определения масс в спектрах MS/MS (тандемного масс-спектрометрического анализа) ±25 ppm и возможность пропуска одного сайта расщепления. Для оценки дифференциально экспрессированных белков полученные первичные данные анализировали с помощью программного обеспечения MaxQuant 1.6 (Max-Planck-Institute of Biochemistry; Германия) (алгоритм iBAQ). Дальнейшую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения Perseus и языка программирования R 3.5 с интегрированнойсредойразработки RStudio 1.1 (R-Tools Technology; США). Для определения статистическойдостоверности наблюдаемых различийиспользовали t-критерийСтьюдента.

Статистическая обработка данных

Исходные данные анализа микрочипов нормировали с использованием пакета oligo для языка программирования R [17]. Полученные данные логарифмировали по основанию 2. Анализ дифференциальной экспрессии генов и микроРНК проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Поправку на множественную проверку гипотез осуществляли с помощью метода False Discovery Rate (FDR), представленного процедурой Бенджамини– Хохберга [18]. Для оценки индекса ложноположительности микроРНК использовали алгоритм, описанный ранее [19].

Функциональную аннотацию генов производили с помощью баз данных и алгоритмов DAVID версии 6.8 [20]. Валидированные взаимодействия микроРНК и генов-мишеней были экспортированы из базы данных DIANA-TarBase версии 8 [21]. Предсказание позиций связывания микроРНК на 3'-нетранслируемых областях мРНК-мишеней производили с помощью miRWalk [22]. Для поиска интронных микроРНК и их хост-генов использовали базу данных miRIAD [23].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обработка CoCl₂ имитирует гипоксию в клетках Caco-2 и вызывает рост экспрессии генов α-субъединиц интегринов

Из литературных данных известно, что покрытие мембраны, на которой происходит культивирование клеток Caco-2, белками внеклеточного матрикса, такими как коллагены и ламинины [24], может существенно влиять на скорость образования монослоя и дифференцировки данных клеток. Поэтому при оптимизации условий культивирования клеток, входящих в состав микрофлюидной модели кишечного барьера, было оценено влияние покрытия мембраны коллагеном IV и ламинином 332 на пролиферацию клеток Caco-2. Исследование проводили с использованием мембранных вставок Transwell Corning. Покрытие мембраны ламинином 332 позволяло более чем в два раза повысить пролиферацию клеток Caco-2 (рис. 2). Поэтому для дальнейшей работы были выбраны условия культивирования с предварительным покрытием мембраны ламинином 332.

Для имитации гипоксии клетки Caco-2 обрабатывали CoCl₂ (см. Материалы и методы). Влияние гипоксии на состояние монослоя клеток оценивали с помощью импедансной спектроскопии. Импедансная спектроскопия — это измерение импеданса (полного электрического сопротивления переменному синусоидальному току) при разных частотах электрического тока (см. Материалы и методы) [25]. Возможность и информативность применения импедансной спектроскопии для указанных задач подробно описана ранее [25]. Cредние значения TEER как при гипоксии, так и при нормоксии были выше 3000 Ом (соответствует удельному сопротивлению

429 Ом∙см2). Значения TEER зависят как от внутриклеточного сопротивления, которое обусловлено состоянием трансмембранных каналов, проводящих ионы через клетку, так и от состояния межклеточных плотных контактов, отвечающих за парацеллюлярное сопротивление. Например, известно, что значения TEER сильно падают при понижении концентрации кальция в среде, так как эти ионы необходимы для поддержания нормальной структуры плотных контактов. В то же время, при гибели клеток нарушается целостность мембраны и сильно снижается внутриклеточное сопротивление. Наблюдаемые высокие значения TEER на протяжении всего эксперимента свидетельствуют об интактном состоянии плотных контактов и об отсутствии выраженной цитотоксичности, приводящей к гибели клеток (рис. 3).

С помощью микрочипов Affymetrix (TermoFisher Scientific-Affymetrix; США) провели анализ транскриптомов обработанных и контрольных клеток. В обработанных CoCl2 образцах выявлен значимый рост экспрессии генов, вовлеченных в ответ на гипоксию в соответствии с [26], полученные изменения валидированы с помощью ПЦР-РВ (табл. 2). Всего с помощью микрочипов значимые изменения экспрессии (в два и более раз; FDR < 0,05) выявлены у 165 генов. Их функциональная аннотация с помощью баз данных и алгоритмов DAVID [20] показала значимое обогащение для сигнального пути HIF-1 (KEGG- путь hsa04066, HIF-1 signaling pathway), опосредующего ответ на гипоксию (табл. 3). Та же функциональная аннотация не выявила обогащения генов антиоксидантной защиты (GO:0016209, antioxidant activity). Масс- спектрометрический анализ протеома обработанных и контрольных клеток также не смог выявить существенный рост количества четырех белков, кодируемых генами HIF-1 сигнального пути: ENO2 в 19,6, HMOX1 в 29,1, PDK1 в 2.8 и SLC2A1 в 2,2 раза соответственно. Всего в ходе протеомного анализа было выявлено 120 белков, значимо изменивших свою экспрессию в условиях имитации гипоксии.

При сравнении транскриптомов обработанных CoCl2 и контрольных клеток обнаружено значимое увеличение экспрессии двух генов, кодирующих α-субъединицы интегринов: в условиях имитации гипоксии экспрессия гена ITGA2 возросла в 3,2 (p = 0,02), а ITGA5 — в 1,9 раза (p = 0,0088). Изменения также были валидированы с помощью ПЦР-РВ: экспрессия ITGA2 и ITGA5 возросла в 3,5 и 2,0 раза соответственно. У генов β-субъединиц рост экспрессии обнаружен не был. При анализе протеомов из всех β-субъединиц были детектированы только β1- и β4-субъединицы, и их экспрессия в условиях гипоксии не изменилась. В клетках Caco-2 эти две субъединицы составляют более 90% от общего количества β-субъединиц [14]. α-Субъединицы детектированы в протеоме не были. Вероятно, это связано с недостаточной чувствительностью использованного нами анализа. Кроме того, ранее показано, что в клетках Caco-2 количество α2- и α5-субъединиц соответственно в 10 и 100 раз ниже, чем количество β1-субъединиц [14]. Важно, что при культивировании клеток Caco-2 в микрофлюидном чипе экспрессия в ITGA5, наоборот, снижалась в 2,1 раза. Наблюдалось также уменьшение в 1,6 раза экспрессии гена LAMA1, кодирующего α1-цепь ламининов, которая в норме отсутствует в здоровом кишечнике. Это свидетельствует о создании более физиологических условий для клеток кишечника в микрофлюидном чипе. Отметим, что достоверных изменений генов, вовлеченны в ответ на гипоксию и в сигнальные пути HIF-1, по сравнению со статическими условиями, обнаружено не было.

Изменение экспрессии гена ITGA5 сопровождает измененная экспрессия регулирующих его микроРНК

Для поиска возможных причин изменения экспрессии генов субъединиц интегринов ITGA2 и ITGA5 в ответ на имитацию гипоксии был проведен анализ микроРНК, осуществляющих регуляцию данных генов. С помощью микроРНК-микрочипов Affymetrix проанализировали микроРНК-транскриптомы обработанных CoCl2 и контрольных клеток. Экспрессия девяти микроРНК была значимо изменена при имитации гипоксии. Две из них, hsa-miR-23b-5p и hsa-miR-766-3p, оказались экспериментально подтвержденными регуляторами экспрессии гена ITGA5 [27, 28]. При этом в состоянии гипоксии их экспрессия уменьшилась в 2,2 и в 2,1 раза (p = 0,046) соответственно, что противоположно изменению экспрессии их гена-мишени ITGA5.
Анализ позиций связывания данных микроРНК с 3′-нетранслируемой областью мРНК ITGA5 показал, что обе микроРНК имеют полную комплементарность с мРНК-мишенью в области seed region (нуклеотиды 2-7/8 микроРНК) (рис. 4). Полная комплементарность в этом регионе является необходимым условием эффективного взаимодействия микроРНК и мРНК. Более того, обе микроРНК способны комплементарно взаимодействовать с мРНК ITGA5 и вне seed region, что дополнительно повышает прочность связывания (см. рис. 4).
Гены обеих микроРНК локализованы в интронах: hsa-miR-23b-5p расположена в интроне гена AOPEP, hsa-miR-766-3p — в интроне гена SEPTIN6. Интересно, что в условиях моделирования гипоксии экспрессия данных хост-генов значимо не изменилась. Это может свидетельствовать о наличии у данных микроРНК независимых промоторов, что было ранее обнаружено для многих микроРНК, кодируемых интронами [29].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В условиях гипоксии, имитированной с помощью обработки хлоридом кобальта (II) клеток аденокарциномы толстого кишечника Caco-2, обнаружен рост экспрессии генов, вовлеченных в сигнальный путь HIF-1. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными об изменении транскриптома при воздействии хлоридом кобальта на клеточные линии Caco-2 [30] и Caki-1 [31].
При моделировании гипоксии было выявлено значимое повышение экспрессии генов ITGA2 и ITGA5. Данные гены кодируют субъединицы α2 и α5 интегриновых рецепторов. Поскольку значимых изменений экспрессии β-субъединиц обнаружено не было, можно полагать, что в условиях гипоксии возросла доля рецепторов, содержащих α2- и α5-субъединицы. Нами обнаружено, что в статических условиях выращивания в клетках Caco-2 экспрессия ITGA5 была в 2,1 раза выше, чем при культивировании этих клеток в микрофлюидном чипе. Благодаря микроциркуляции создаются более близкие к физиологическим условия и улучшается снабжение клеток питательными веществами. Таким образом, изменение профиля интегриновых рецепторов (увеличение доли α2- и α5-субъединиц) может быть реакцией клеток Caco-2 на ухудшение условий роста. В данной работе нами обнаружены возможные регуляторы изменения экспрессии ITGA2 и ITGA5 — микроРНК hsa-miR-23b-5p и hsa-miR-766-3p. Их экспрессия снижалась в условиях гипоксии. Стоит отметить, что помимо активности данных микроРНК могут присутствовать кофакторы, способствующие увеличению экспрессии ITGA2 и ITGA5, например факторы транскрипции, регулирующие эти гены, экспрессия которых также была дифференциально изменена.
Существующая литература содержит небольшое количество информации о двух обнаруженных микроРНК. Так, известно, что уменьшение экспресии hsa-miR-766-3p приводит к повышенной пролиферативной активности злокачественных клеток почки [32] и агрессивности гепатоцеллюлярной карциномы [33]. Пониженная экспрессия hsa-miR-23b-5p приводит к повышенной пролиферативной и миграционной активности клеток аденокарциномы легкого [34].

Для выполнения функции рецептора цепи интергинов должны образовать αβ-гетеродимер. В клетках эпителия кишечника для α2- и α5- цепей одним из основных партнеров является β1-цепь. Основными лигандами интегринового рецептора α2β1 являются ламинин, коллаген и эпителиальный кадгерин, а рецептор α5β1 связывается с фибронектином [35]. Эти белки, в свою очередь, служат лигандами бактериальных адгезинов. Например, адгезин YadA, расположенный на внешней мембране грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica (возбудителей тяжелых зоонозных заболеваний: псевдотуберкулеза и иерсениоза), связывается с коллагеном, ламинином и фибронектином [36]. Кроме того, белок инвазин, расположенный на внешней мембране патогенных бактерий рода Yersenia, селективно связывается с интегриновыми рецепторами семейства β1, что приводит к транслокации бактерий через клетки эпителиального слоя [37]. Отметим, что имитация гипоксии миметиком DMOG в одном из исследований сопровождалась снижением чувствительности клеток Caco-2 к Yersinia enterocolitica при культивировании на пластиковой подложке [38], что авторы связывали со снижением экспрессии β1-цепи интегринов. В нашем исследовании при культивировании клеток на проницаемой мембранной вставке экспрессия β1-цепи интегринов не менялась, что, по-видимому, указывает на важность условий культивирования клеток при проведении подобных экспериментов. Нельзя, однако, исключать и различие специфического влияния конкретного миметика гипоксии.
Таким образом, гипоксия энтероцитов кишечника, недостаточное снабжение их питательными веществами и избыток продуктов обмена приводят к изменению профиля экспрессии интегринов, что может способствовать повышению восприимчивости к ряду бактериальных патогенов. Регуляторами этого процесса могут служить микроРНК hsa-miR-23b-5p и hsa-miR-766-3p.

ВЫВОДЫ

Использование хлорида кобальта (II) позволило смоделировать гипоксию в клеточных линиях Caco-2. Результаты транскриптомного анализа продемонстрировали активацию ключевых участников сигнального пути HIF-1 и изменение профиля экспрессии интегринов в энтероцитах кишечника. Возможными регуляторами этого процесса могут служить микроРНК hsa-miR-23b-5p и hsa-miR-766-3p, экспрессия которых при имитации гипоксии уменьшилась в 2,2 и 2,1 раза соответственно. Использование условий микроциркуляции имеет обратное действие в отношении экспрессии ITGA5 и не оказывает воздействия на экспрессию генов сигнального пути HIF-1.