Персонализированная медицина позволяет с помощью современных молекулярно-генетических технологий (фармакогенетическое тестирование, выявление геномных и транскриптомных биомаркеров) индивидуализировать выбор лекарственного средства [1]. Значительный интерес в этом смысле представляет бронхиальная астма (БА), поскольку и сама патология, и реакция на терапию БА имеют в своей основе существенный генетический компонент [2– 5]. Так, изменение функциональной активности β2-адренорецептора (ADRB2), связанное с полиморфизмом кодирующего его гена, может приводить к низкому фармакологическому ответу на β2-агонисты, составляющему основу терапии БА [6, 7].

По данным базы Ensembl [8], ген ADRB2 весьма полиморфен и содержит в кодирующей части более 500 однонуклеотидных замен и инсерционно-делеционных полиморфизмов. Из них 276 представляют собой миссенс- мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания или возникновению стоп-кодона. С точки зрения ответа на противоастматическую терапию наиболее интересны три полиморфных варианта гена, для которых указана ассоциация с эффективностью ответа на β2-агонисты: Argl6Gly (rs1042713), Gln27Glu (rs1042714) и Thrl64Ile (rs1800888). Однако ассоциации, установленные для этих молекулярно-генетических маркеров, демонстрируют плохую воспроизводимость в различных исследованиях [9– 11]. В связи с этим вопрос о возможности клинического применения результатов генетического тестирования по полиморфным вариантам гена ADRB2 до сих пор остается открытым [12– 14].

Среди причин, по которым клинический эффект того или иного полиморфного варианта гена может не находить подтверждения в различных исследованиях, — популяционная гетерогенность, недостаточный объем выборки, неполная характеристика групп сравнения [15, 16]. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение молекулярных механизмов патогенеза БА с привлечением к исследованию многочисленных когорт из различных популяций. Следует отметить, что в России такие работы практически не ведутся.

Несмотря на это клиницисты уже сегодня обладают опытом и необходимым инструментарием для использования фармакогентического тестирования на практике. Представляется интересным подойти к вопросу установления клинической значимости генетических маркеров c другой стороны. Мы не ставили целью установление ассоциации маркера с признаком, а напротив, проверяли применимость маркеров с уже установленной ассоциацией для ограниченной, охарактеризованной нами с клинической точки зрения когорты пациентов [17]. Подтверждение значимости фармакогенетических маркеров для данной группы позволило бы уже сегодня использовать результаты генетического тестирования в качестве дополнительного обоснования при принятии решения о лечении пациентов, торпидных к стандартной терапии.

Таким образом, целью настоящего исследования было оценить клиническую значимость ассоциированных с терапевтическим ответом на β2-агонисты полиморфных вариантов гена ADRB2 для группы пациентов с описанным нами ранее редким тератипом БА.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Критерии включения пациентов в исследование: наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании; возраст пациентов любого пола — 18 лет и старше; наличие тяжелой атопической бронхиальной астмы; длительность заболевания не менее двух лет; способность адекватно оценивать свои симптомы и соблюдать рекомендации; подтвержденная обратимость бронхиальной обструкции (после ингаляции 400 мкг сальбутамола прирост ОФВ1 у пациента составляет 12% и 200 мл и более). Приемлемым считали наличие документально подтвержденной обратимости бронхиальной обструкции в пределах 12 месяцев до подписания информированного согласия.

Критерии исключения: острое инфекционное заболевание (до момента выздоровления), обострение сопутствующего хронического заболевания (до стабилизации состояния); наличие у пациента любого клинически значимого, неконтролируемого медицинского состояния, по поводу которого пациент получает или не получает лечение, и которое будет препятствовать соблюдению графика или процедур исследования, интерпретации данных по эффективности или представлять угрозу для безопасности данного пациента; наличие у пациента диагностированного злокачественного новообразования; развитие серьезного нежелательного явления в ходе проведения исследования.

В исследовании приняли участие взрослые некурящие пациенты (n = 21) русской этнической принадлежности обоего пола (8 мужчин и 13 женщин), средний возраст которых составил 53 года (минимальный — 47, максимальный — 63), страдающих БА средней степени тяжести (III–IV ступень по GINA); средняя продолжительность заболевания составляла 13 лет (минимальная — 1 год, максимальная — 32 года). Всем пациентам в качестве основной терапии назначали ингаляционные кортикостероиды в средних или высоких дозах в сочетании с ДДБА, при этом контроль над симптомами БА у них отсутствовал или был неполным: присутствовала ежедневная потребность в симптоматической терапии; результаты теста по контролю астмы ACT (Asthma Control Test) составляли 15–20 баллов; объем форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) до использования бронхолитика достигал 70,6 ± 5% от нормальных величин. Пациенты были разделены на две группы. В первую (n = 14) были определены пациенты с клинически и инструментально подтвержденной эффективностью сальбутамола (увеличение объема форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) — более 12% и более 200 мл после ингаляции 400 мкг сальбутамола), которые в то же время имели хороший ответ на 50 мкг ипратропия бромида (КДБА+КДХП+). Во вторую группу (n = 7) вошли пациенты с низкой эффективностью лечения сальбутамолом (прирост ОФВ1 менее 12% и менее 200 мл после ингаляции 400 мкг сальбутамола) и положительным тестом (прирост ОФВ1 более 12% и более 200 мл через 30 мин) после ингаляции 50 мкг ипратропия бромида (КДБА-КДХП+).

Генетические маркеры

Ген ADRB2 расположен на длинном плече хромосомы 5q32 рядом с кластером генов, кодирующих цитокины и глюкокортикоидный рецептор. ADRB2 относится к генам рецепторных молекул, контролирующих лабильность бронхов [18].

Полиморфизм Arg16Gly (международный код полиморфизма: rs1042713) представляет собой однонуклеотидную замену в кодирующей области гена ADRB2, где происходит замена нуклеотида гуанина (G) на аденин (А) (генетический маркер G46A). В результате данной замены в аминокислотной последовательности белка ADRB2 в позиции 16 аргинин заменяется на глицин (Arg16Gly). Таким образом, возможны следующие варианты: Arg16Arg, Arg16Gly, Gly16Gly. В исследованиях in vitro было показано изменение функциональной активности ADRB2 [19]. По некоторым результатам, больные, гомозиготные по этим вариантам гена, быстро теряют чувствительность к короткодействующим β2-агонистам (КДБА) и нуждаются в назначении гормональных препаратов [14].

Полиморфизм Glu27Gln (международный код полиморфизма: rs1042714) представляет собой однонуклеотидную замену цитозина на гуанин (генетический маркер C79G). В результате данной замены в аминокислотной последовательности белка ADRB2 в позиции 27 глутамин заменяется на глутаминовую кислоту (Glu27Gln). В исследовании Martinez и сооавторов было показано, что аллель Glu27 ассоциирован с пониженной чувствительностью дыхательных путей пациентов с БА к метахолину [20].

Очистка ДНК и проведение типирования

Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Полученные образцы сразу использовали для генотипирования либо хранили при –20 °С. Концентрация ДНК, определенная на специализированном флуориметре Qubit (Invitrogen; США), составляла в среднем 50–100 мкг/мл. Анализ полиморфных вариантов rs1042713 и rs1042714 гена ADRB2 проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на амплификаторе «DTprime» («ДНК-Технология»; Россия) с использованием праймеров ADRB2-f: 5'-AGTGCGCTCACCTGCCAGACTG-3' и ADRB2-r: 5'-CCAAACACGATGGCCAGGACGA-3'. Синтез праймеров осуществляли на твердой подложке с использованием инвертированных (5') фосфорамидитов и фоторазрушаемых линкеров. Последние использовали для снятия праймеров с твердой фазы за счет действия ультрафиолетового излучения.

Для определения генотипов использовали метод примыкающих зондов с модификациями [21]. Применяемый подход выгодно отличается от большинства молекулярногенетических методов определения полиморфизмов одиночных нуклеотидов, в том числе использующих технологию TaqMan. Определение генотипа происходит дважды, независимо по двум каналам флуоресценции, что существенно повышает надежность генотипирования и практически нереализуемо другими способами. Для амплификации использовали реакционную смесь объемом 35 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10× Taq-буфера (67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 0,01% Тween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы («ДНК-Технология»; Россия) и 5–10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов. Использовали следующий температурный режим амплификации: 94 °С — 10 с, 64 °С — 30 с в течение 50 циклов. По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25 °С со скоростью 2 °С/с. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25 до 75 °С с шагом в 1 °С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы MS Excel 2013 (Microsoft; США) с использованием точного критерия Фишера для проверки соответствия наблюдаемого распределения частот генотипов [24, 25]. Различия между группами считали значимыми при р < 0,05. Частоту аллелей вычисляли по формуле:

формула

где n — встречаемость аллеля.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование  были включены полиморфные варианты rs1042713 и rs1042714 (вариант rs1800888 не включен в исследование из-за низкой встречаемости [24, 25]). Для решения поставленной цели нами была разработана новая тест-система для анализа полиморфных вариантов гена ADRB2 методом ПЦР в реальном времени и подтверждена ее работоспособность методом прямого определения последовательности (секвенирования) для гомозиготных и гетерозиготных образцов (рисунок).

В ходе исследования нами были сформированы группы сравнения из пациентов Института иммунологии ФМБА России, относящихся к разным тератипам БА; проведены их генотипирование и анализ различий в представленности аллелей и генотипов в группах сравнения. Результаты генотипирования представлены в таблице (таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведено клиническое и генетическое обследование пациентов страдающих БА средней степени тяжести (III– IV ступень по GINA) с вариабельным фармакологическим ответом на β2-агонисты, где КДБА+КДХП+ — пациенты с клинически и инструментально подтвержденной эффективностью сальбутамола, а КДБА-КДХП+ — пациенты, имевшие низкий ответ на сальбутамол и положительный ответ на ипратропия бромид. Подробная клиническая характеристика для групп пациентов, разных тератипов была приведена нами ранее [17]. Определены аллели и генотипы пациентов по вариантам гена β2-адренорецептора ADRB2 rs1042713 (Arg16Gly) и rs1042714 (Glu27Gln).

Полиморфизм Arg16Gly (rs1042713)

Среди пациентов КДБА+КДХП+ / КДБА–КДХП+ частота гетерозигот в группе с плохой эффективностью терапии сальбутамолом была в 1,5 раза больше по сравнению с пациентами с хорошим терапевтическим ответом. У пациентов обеих групп выявление аллелей Arg16 и Gly16 было отмечено с одинаковой частотой (см. таблица).

Показано, что полиморфизм Arg16Gly связан с десенситизацией рецептора ADRB2. Рецептор, имеющий в структуре Gly16Gly, в большей степени подвержен десенситизации эндогенными катехоламинами в сравнении с рецептором, имеющим в своей структуре Arg16Arg или Arg16Gly [26]. По данным литературы, выявлена вариабельность ответа на применение β2агонистов [27]. Наши данные частично согласуются с данными, согласно которым отсутствует терапевтический ответ на терапию ингаляционными β2-агонистами у больных БА с преобладанием аллеля Gly (генотипы Arg16Gly и Gly16Gly) [28]. В нашем исследовании пациенты с отсутствием ответа на сальбутамол в 100% случаев имели либо генотип Arg16Gly, либо Gly16Gly, однако при оценке влияния аллеля Gly на плохой ответ на β2-агонисты мы такой связи не подтвердили (отношение шансов [OR] 1,00; 95% Cl 0,26–3,81). Наиболее выраженный ответ на однократное введение β2-адреномиметика выявлен в группе пациентов, гомозиготных по Arg в положении 16 (Arg16Arg), по сравнению с гомозиготами по Gly в данном положении (генотип Gly16Gly) [20]. В другом исследовании тоже подтверждено, что генотип Arg16Arg ассоциируется с легкой формой БА и лучшим ответом на сальбутамол [29]. По нашим данным, в группе КДБА+КДХП+ с хорошим ответом на сальбутамол в 14% случаев тоже был выявлен генотип Arg16Arg (в группе с плохим ответом на сальбутамол такой генотип не встречался).

К сожалению, в связи с редкой встречаемостью тератипа КДБА–КДХП+ среди пациентов с БА мы смогли включить в данную группу лишь небольшое число пациентов. Вероятно, дальнейшее выявление таких пациентов и проведение исследования на большей выборке позволят получить статистически значимые различия.

Полиморфизм Glu27Gln (rs1042714)

Распределение генотипов и аллелей для 27-й позиции среди пациентов КДБА+КДХП+ / КДБА–КДХП+ было практически идентичным и не имело статистически достоверных различий между этими двумя группами (см. табл.). При этом нами было выявлено относительно большее число гетерозигот Gln27Glu (64%) в группе КДБА+КДХП+ по сравнению с частотой 45,7%, установленной ранее для русской популяции [30], однако данное наблюдение требует подтверждения на большей выборке.

Ограниченность исследований, посвященных изучению полиморфизма Gln27Glu и вариабельности ответа на β2-агонисты, а также противоречивость этих результатов не позволяют соотнести полученные нами данные с литературными. В основном изучали распределение частот генотипов при разной степени тяжести БА. Так, было показано преобладание генотипа Glu27Glu среди пациентов с тяжелой астмой (55 и 75% соответственно) [31, 32]. В другой работе у пациентов с БА распределение генотипов для 27-й позиции было следующим: Glu27Glu — 9,2%, Gln27Glu — 27,8%, Gln27Gln — 63%, при этом не было выявлено различий у пациентов с разной степенью тяжестью и ответом на β2-агонисты [29]. Таким образом данные, полученные в настоящем исследовании, согласуются с данными [29] об отсутствии взаимосвязи ответа на β2-агонисты и полиморфизмом rs1042714 (Gln27Glu). 

В проводимом исследовании мы не оценивали другие полиморфизмы гена ADRB2, пособные влиять на вариабельность ответа на β2-агонисты. Возможно, что в основе плохого ответа на сальбутамол у пациентов с редким тератипом КДБА–КДХП+ лежат иные, негенетические причины десенситизации гена ADRB2.

ВЫВОДЫ

Анализ распределения полиморфных вариантов rs1042713 (Arg16Gly) гена ADRB2 показал, что пациенты с отсутствием ответа на β2-агонисты (сальбутамол) в 100% случаев имели генотип Arg16Gly либо Gly16Gly, однако при оценке влияния наличия аллеля Gly на плохой ответ на β2-агонисты мы такой связи не подтвердили, что может быть обусловлено малочисленной выборкой. Мы не выявили различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов rs1042714 (Gln27Glu) при сравнении групп пациентов с различным клиническим ответом на β2агонисты. Возможно, что дальнейшее исследование с включением большего числа пациентов с БА с редким тератипом КДБА–КДХП+ позволит выявить статистически значимые различия в распределении полиморфных вариантов rs1042713 (Arg16Gly). В проведенном исследовании мы не оценивали возможное влияние других полиморфизмов гена ADRB2 на вариабельность ответа на β2-агонисты. Целесообразно включение в дальнейшее исследование редких функциональных вариантов, установленных в результате ресеквенирования полиэтнических когорт. Кроме того, с плохим ответом на сальбутамол у пациентов с редким тератипом КДБА– КДХП+ могут быть связаны иные, негенетические причины десенситизации гена ADRB2.