Моноциты во взрослом организме являются динамической популяцией основных клеток врожденного иммунитета, которые постоянно формируются из предшественников в костном мозге, и циркулируют в кровотоке от 3 до 6 дней. Моноциты во взрослом организме служат основными предшественниками тканевых макрофагов, основными сенсорами врожденного иммунитета для экзогенных и эндогенных патологических факторов в крови, а также ключевыми предшественниками опухолеассоциированных макрофагов [1–5]. Представляя пул эффекторных клеток врожденного иммунитета с паттернраспознающими рецепторами, они могут выступать в качестве регуляторов опухолевого роста. Различные типы моноцитов имеют разнонаправленное действие в отношении роста и метастатического распространения раковых клеток, они и активируют, и подавляют данные процессы. Опухолевая прогрессия связана с запуском целого каскада воспалительных и иммунных реакций. Данные патологические процессы ассоциированы с изменением содержания аминокислот в составе моноцитов, что может привести к нарушению их функции [6–8].

Моноциты являются предшественниками опухолеассоциированных макрофагов (ОАМ) и дендритных клеток, которые формируют микроокружение опухоли [9]. В очаге воспаления они выполняют функцию фагоцитоза и выработки провоспалительных цитокинов. В условиях провоспалительного микроокружения они дифференцируются в воспалительные макрофаги и воспалительные дендритные клетки, которые впоследствии мигрируют в лимфатические узлы и активируют T-лимфоциты CD4+ и CD8+. Активированные иммунные клетки в последующем включаются в метаболические пути, ассоциированные с прогрессией раковых клеток [10–13]. Эта общность метаболических процессов создает фундаментальную конкуренцию за питательные субстраты, необходимые как раковым, так и иммунным клеткам в микроокружении опухоли.

Развитие аналитической техники, и в первую очередь жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ЖХ-МС), привело к формированию метаболомики [14–16], которую активно используют для выявления метаболических особенностей онкологических процессов, выяснения механизмов патогенеза и поиска новых лекарственных мишеней [14, 17]. На сегодняшний день особого внимания заслуживает изучение профиля аминокислот. Изменение уровня аминокислот может иметь важное значение для формирования надлежащего иммунного ответа [13, 18–20] и приводить к нарушению миграции, деления и созревания иммунных клеток. Аминокислоты участвуют в контроле ряда путей, регулирующих реакции иммунных клеток, включая передачу сигналов mTOR и выработку NO [19, 21]. Конкуренция за метаболиты и сигнальное взаимодействие между иммунными клетками хозяина и патогенами могут повлиять на развитие болезни, в том числе и опухолевого процесса [18].

Рак молочной железы (РМЖ) остается лидирующим по распространенности злокачественным новообразованием у женщин [22]. Это первый тип рака, для которого в экспериментах на животных была продемонстрирована роль иммунных клеток в поддержании роста опухоли [23]. Дальнейшие исследования позволили накопить информацию о взаимном влиянии раковых клеток и клеток иммунной системы [7, 9, 17, 24–29]

Изучение гетерогенности моноцитов и их роли на разных стадиях прогрессирования онкологического процесса имеет решающее значение для исследования способности раковых клеток препятствовать иммунологическому надзору и скрываться от агрессии иммуннокомпетентных клеток. Работы в этом направлении позволят в будущем выявить новые биомаркеры онкологического процесса и разработать персонифицированные пути иммунотерапии рака [30].
Целью работы было установление особенностей аминокислотного профиля моноцитов, выделенных из крови пациенток с РМЖ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В группу исследования вошли 13 больных в возрасте 36–69 лет с РМЖ IIА–IIIА стадии T1-2N0-1M0. Все пациентки имели Her2⁺ молекулярный подтип опухоли (Ki67⁺ не менее 30%). B контрольную группу вошли 10 здоровых добровольцев в возрасте 50–67 лет. Критерии включения в контрольную группу: отсутствие хронических заболеваний в период обострения, отсутствие онкологических заболеваний в анамнезе, отсутствие аллергических и аутоиммунных заболеваний, подписанное информированное согласие об участии в исследовании.

Объектом исследования послужила периферическая венозная кровь, взятая натощак в пробирки с К3ЭДТА. Из крови получали фракцию мононуклеарных клеток с помощью обогащения на градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). Из полученной фракции мононуклеарных клеток выделяли CD14+-моноциты по протоколу проведения позитивной магнитной сепарации компании Myltenyi Biotec с использованием магнитного сепаратора MidiMACS (Myltenyi Biotec; Германия). Чистота полученной фракции была определена с помощью проточной цитофлуорометрии на приборе Cytoflex (Beckman Coulter; США) и составила более 92% CD14⁺-клеток. Подсчет числа клеток проводили на основании данных цитофлуорометрии. Аликвоту, содержащую 4–5 млн моноцитов, отделяли и 3 раза проводили промывку центрифугированием при 311 g в течение 5 мин с холодным 0,3%-м ацетатом аммония. Полученный осадок клеток высушивали в атмосфере азота и хранили при –80 °C до экстракции в течение не более чем 6 месяцев.

Подготовка образцов для ЖХ-МС анализа

В исследовании использовали ацетонитрил, метанол, бутанол и хлороформ (степени очистки для жидкостной хроматографии), приобретенные у Merck (Дармштадт; Германия), а также водный раствор соляной кислоты 37% (Acros Organics; США). Деионизированную воду готовили с помощью установки Milli-Q Reference Water Purification System (Мольсем; Франция).
Приготовление образцов осуществляли согласно следующей процедуре: к образцу моноцитов добавляли 480 мкл раствора хлороформ/метанол (2:1, об./об.); образец подвергали ультразвуковому воздействию в течение 10 мин при комнатной температуре, добавляли 150 мкл воды, перемешивали в течение 5 мин; получившийся раствор центрифугировали при 13 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре; отбирали 150 мкл верхнего водно-метанольного слоя; сушили в токе азота 30 мин при 60 °C; добавляли 200 мкл раствора соляной кислоты в бутаноле (0,1 моль/л); перемешивали в течение 3 мин; центрифугировали при 13 000 g в течение 15 с при комнатной температуре; выдерживали при 60 °C в течение 15 мин для проведения реакции дериватизации; центрифугировали при 13 000 g в течение 15 с при комнатной температуре; сушили в токе азота 30 мин при 60 °C; перерастворяли в 300 мкл раствора ацетонитрил/вода (1/1 об./об.); перемешивали в течение 5 мин; центрифугировали при 13 000 g в течение 15 с при комнатной температуре; переносили 200 мкл полученного образца в виалу со вставкой для дальнейшего анализа.

ЖХ-МС-анализ и обработка данных

Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе 1260 Infinity II (Agilent; США) с детектированием на масс-спектрометре 6460 Triple Quad (Agilent; США). Разделение образцов осуществляли методом жидкостной хроматографии с использованием колонки Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 2,1 × 100 мм, с диаметром сорбента 1,8 мкм (Agilent; США).
Для анализа аминокислот вводили 3 мкл образца и использовали следующие элюенты, подаваемые со скоростью потока 150 мкл/мин с поддерживаемой температурой колонки 20 °С, в качестве подвижной фазы: элюент А — 10 мМ раствор ацетата аммония в воде, элюент В — ацетонитрил. Состав подвижной фазы в ходе анализа изменялся в соответствии с табл. 1.
Транзитные переходы между ионами-предшественниками и ионами-продуктами для анализируемых аминокислот приведены в табл. 2. Параметры источника ионов были следующие: температура осушающего газа — 150 °C, скорость потока осушающего газа — 10 л/мин, давление газа-распылителя — 2,76 Бар, температура газа-завесы — 400 °C, скорость потока газа-завесы — 10 л/мин, напряжение на капилляре — 2000 В.

Уровни метаболитов определяли с использованием программы QuantAnalysis (Agilent; США).

Статистический анализ данных

Все данные были проанализированы в программной среде R (http://www.r-project.org/, версии R 4.1.1, 4.1.2). Начальную обработку таблиц данных производили с помощью пакетов tidyverse (версия 1.3.1) и readxl (1.3.1). Для визуализации результатов использовались ggplot2 (версия 3.3.5) и ggforestplot (версия 0.1.0).
Сравнение уровней аминокислот проводили с помощью непараметрического критерия Уилкоксона–Манна–Уитни. Для описания количественных данных использовали медианы (Me) и квартили Q1 и Q3. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.
Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. В качестве независимых переменных в моделях рассматривали уровни отдельных аминокислот. В качестве зависимой переменной выступала принадлежность образца к группе «норма» или «РМЖ». Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ROC-кривой (AUC). Качество разработанных моделей оценивали путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.
Для аминокислот, уровни которых различались в моноцитах от пациентов с РМЖ, проводили анализ вовлеченности в метаболические пути с помощью ресурса MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/home.xhtml).

РЕЗУЛЬТАЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе анализа были получены полуколичественные данные о содержании 26 аминокислот в моноцитах здоровых доноров и пациентов с РМЖ. Список аминокислот включал в себя метил-гистидин, аминомасляную кислоту, 5-гидроксилизин, аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цитруллин, цистин, глутаминовую кислоту, глютамин, глицин, гистидин, лейцин, лизин, метионин, орнитин, фенилаланин, пролин, саркозин, серин, треонин, транс-4-гидроксипролин, триптофан, тирозин, валин. Профиль аминокислот получали делением площади хроматографического пика каждой аминокислоты на суммарную площадь пиков всех аминокислот соответствующего образца. Для поиска различий профилей аминокислот в моноцитах, полученных от пациентов групп «норма» и «РМЖ» было выполнено сравнение данных, полученных с помощью ЖХ-МС, методом Уилкоксона–Манна–Уитни. Статистически значимые различия уровней метаболитов обнаружены для глицина (p-value = 0,0127), аспарагина (p-value = 0,0197), пролина (p-value = 0,0159), метионина (p-value = 0,0357), триптофана (p-value = 0,0028), тирозина (p-value = 0,0127) (рис. 1).

Для аминокислот, уровни которых статистически значимо различались между моноцитами групп «норма» и «РМЖ» был выполнен биоинформатический анализ метаболических путей с их участием. Анализ проводили с использованием ресурса MetaboAnalyst. В результате были определены биологические сети, которые потенциально могут быть вовлечены в изменение фенотипа моноцитов под воздействием РМЖ. В ходе анализа данных, представленных в базе KEGG и SMPDB (табл. 3, табл. 4), были выявлены пути, упорядоченные по уровням значимости (анализ обогащения путей — ось ординат на рис. 2) и значениям влияния рассматриваемых метаболитов на путь (анализ топологии пути — ось абсцисс на рис. 2). Цвет узла соответствует уровню значимости, а радиус узла коррелирует с величиной влияния на путь. Влияние на путь рассчитывали как сумму показателей значимости соответствующих метаболитов, деленную на сумму показателей значимости всех метаболитов в каждом пути. Оценку обогащения метаболических путей выполняли с помощью анализа избыточного представления (Over representation analysis, ORA) с использованием гипергеометрического теста.

Для проверки возможности диагностики РМЖ по уровням аминокислот в моноцитах были разработаны модели логистической регрессии по каждой из значимых аминокислот (рис. 3А), а также рассмотрены модели с использованием комбинации аминокислот и выбраны четыре с наибольшим значением площади под операционной кривой (AUC) по результатам ROC- анализа (рис. 3Б). В табл. 5 приведены результаты оценки качества моделей, построенных на одной аминокислоте. Модели, построенные на комбинации аминокислот, характеризовались AUC = 1 и 100%-й чувствительностью и специфичностью (рис. 3Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Из 26 проанализированных аминокислот уровни шести статистически значимо различались между моноцитами, взятыми у здоровых доноров и пациентов с РМЖ. Из этих шести аминокислот особый интерес представляют глицин, триптофан и аспарагин, поскольку нарушения связанных с ними метаболических путей ассоциируют с изменениями, вызванными опухолевыми процессами [11, 13, 14, 18, 27, 31].

Доступность в течение определенного времени незаменимой аминокислоты триптофана является важным фактором, определяющим силу и качество иммунного ответа. Пролиферация и активация Т-клеток человека были сильно подавлены в средах, не содержащих триптофан, по сравнению с обычными питательными средами [32, 33].

Раковые клетки, ОАМ и ассоциированные с раком фибробласты могут снижать уровень триптофана за счет ферментативной активности индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) [13]. ОАМ, а иногда и сами опухолевые клетки, повышают уровень IDO и создают иммуносупрессивную микросреду с помощью, по меньшей мере, двух механизмов: истощения триптофана и накопления катаболитов триптофана, таких как кинуренин, 3-гидроксиантранилат и хинолинат [34, 35]. Истощение триптофана ингибирует распространение активированных Т-клеток, а катаболиты, полученные из триптофана, действуют как лиганды рецепторов ароматических углеводородов [36]. Кинуренин является супрессором Т-клеточного иммунитета. Стимулируя рецепторы ароматических углеводородов, он направляет дифференцировку наивных Т-клеток в сторону регуляторных Т-клеток и подавляет дифференцировку Th17-клеток [22, 37].

Биосинтез серина, глицина и метаболизм одноуглеродных фрагментов имеют решающее значение для поддержания выживания и пролиферации раковых клеток и обладают высокой клинической значимостью. Чрезмерная активация биосинтеза серина и глицина приводит к онкогенезу, обеспечивая субстрат для одноуглеродного метаболизма. Одноуглеродный метаболизм, представляющий собой циклическую метаболическую сеть, основанную на химической реакции соединений фолиевой кислоты, обеспечивает необходимые белки, нуклеиновые кислоты, липиды и другие биологические макромолекулы для поддержки роста опухоли [31].

Было обраружено, что аспарагин может влиять на рост раковых клеток [38], что привело к использованию бактериального фермента L-аспарагиназы для ограничения доступности аспарагина [14, 39]. Значительные усилия прилагаются к разработке средств для истощения других аминокислот и воздействия на центральные метаболические пути, регуляция которых нарушена в раковых клетках, включая гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и липогенез. Многие из этих препаратов все еще находятся на доклинических стадиях, однако некоторые в настоящее время проходят оценку в ходе клинических испытаний [14].

ВЫВОДЫ

В результате данного исследования было выявлено шесть аминокислот, уровни которых статистически значимо различаются в моноцитах пациентов с раком молочной железы от моноцитов здоровых доноров. Статистически значимые различия уровней метаболитов обнаружены для глицина (p-value = 0,0127), аспарагина (p-value = 0,0197), пролина (p-value = 0,0159), метионина (p-value = 0,0357), триптофана (p-value = 0,0028), тирозина (p-value = 0,0127). В результате биоинформатического анализа метаболических путей с участием задействованных аминокислот были определены биологические сети, которые потенциально могут быть вовлечены в изменение фенотипа моноцитов под воздействием РМЖ. Обнаруженные изменения содержания аминокислот в моноцитах могут свидетельствовать о влиянии опухолевых процессов не только на микроокружение, но и опосредованно на отдаленных участников иммунной системы. На основании найденных различий была предложена модель, обладающая 100%-й специфичностью и чувствительностью, позволяющая диагностировать РМЖ по аминокислотному профилю моноцитов.