Коронавирусная болезнь 2019 г. (COVID-19) вызвала катастрофические проблемы в системе здравоохранения и экономике во многих странах мира [1]. Хотя несколько вакцин эффективно замедлили распространение вируса SARS-CoV-2, их долгосрочная защита и эффективность против вариантов вируса все еще неясны [2–5]. Вспышки эпидемий вызванных коронавирусами в 2002 и 2012 г. послужили мощным толчком для фармацевтических и биотехнологических исследований, однако лишь в 2021 г. появились первые лекарственные кандидаты, успешно прошедшие клинические испытания [6, 7]. Несмотря на то, что массовая вакцинация сильно снижает эффективность распространения и летальность вирусной инфекции, остающиеся высокими уровни заболеваемости и смертности [8, 9] требуют разработки новых противовирусных препаратов для лечения COVID-19.

Привлекательной молекулярной мишенью для новых противовирусных препаратов является трансляционная машинерия инфицированной клетки. В этом исследовании высокоэффективный трансляционный ингибитор Амикумацин А (Ami), впервые выделенный из грамположительных бактерий Bacillus pumilus [10], использовался для разработки пролекарства против SARS-CoV-2. Одним из подходов к направленной терапии коронавирусной инфекции может являться протеолитическая активация пролекарства на основе Ami. Последовательность узнавания основной протеазы M^Pro позволяет использовать подходы тагретного высвобождения активной молекулы Ami и последующего ингибирования трансляции. Целью исследования стала разработка инактивированного аналога Амикумацина А, представляющего собой многообещающий инструмент для создания лекарств, нацеленных на специфическое подавление трансляции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) регистрировали на приборе Bruker Fourier 300 (300 МГц; США) и Bruker Avance I (700 МГц, США) при 303 K в CDCl₃ и DMSO-d₆, внутренний стандарт ― ТМС. Масс-спектры регистрировали на приборе Waters ACQUITY UPLC H-Class LC/MS System (Waters; США) методом электрораспылительной ионизации (ESI). Температуры плавления определяли на приборе SMP30 и не исправляли. Аналитическую и препаративную тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Merck (Германия) с флуоресцентным индикатором UV-254. Для колоночной хроматографии использовали силикагель фирмы Merck (Kieselgel 60, 70-230 mesh). Реактивы Acros Organics (Thermo Fisher Scientific; Бельгия) и SigmaAldrich (Merck; Германия) применяли без дополнительной очистки. Для проведения реакций использовали свежеперегнанные растворители фирмы Химмед (Россия).

Синтез инактивированного производного Амикумацина A

Диметиловый эфир N-третбут оксикарбонил-L-глутаминовой кислоты (1)

В 75 мл метанола суспендировали 14,7 г (0,10 моль) L-глутаминовой кислоты и добавили прикапыванием 25 мл (0,20 моль) триметилсилилхлорида при комнатной температуре. Осадок постепенно растворился. Реакционную смесь оставили на ночь при комнатной температуре. На следующий день упарили растворитель. К остатку прибавили 75 мл метанола, 40 мл (0,3 моль) триэтиламина и 22 г (0,1 моль) ди-трет-бутилкарбоната. Оставили реакционную массу при комнатной температуре на сутки. Контроль методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) этилацетат : гексан ― 1 : 1 (R_f = 0,36). Далее упарили растворитель, разбавили смесь 200 мл воды и экстрагировали 3 × 50 мл этилацетата. Органический слой промыли водой, 5%-ным раствором соляной кислоты, 5%-ным раствором поташа и снова водой. После высушивания над сульфатом натрия упарили растворитель. Получили 23 г продукта 1 в виде бесцветного вязкого масла, выход 85%.

1H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 5.09(s, br, 1H), 4.32(s, br, 1H), 3.73(s, 3H), 3.67(s, 3H), 2.47-2.31(m, 2H), 2.24-2.10(m, 1H), 2.03-1.85(m, 1H), 1.43(9H, s).
13С ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 173.2, 172.6, 155.3, 80.0, 52.9, 52.4, 51.8, 30.0, 28.3, 27.8
MS (EI): m/z, 276.2 [M+H⁺].

Диметил(2S,4R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)-амино]-(цианометил)пентандиоат (2)

К раствору 7,5 г (27,3 ммоль) диметилового эфира N-третбутоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты (1) в 50 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ) при ‒80 ^оС добавили 60 мл (60 ммоль) 1М раствора LiHMDS в ТГФ. Выдержали реакционную массу при этой температуре 1 ч и далее медленно прибавили раствор 1,9 мл (27,3 моль) бромацетонитрила в 10 мл сухого ТГФ, так чтобы температура не поднималась выше ‒70 ^оС. Контроль ТСХ этилацетат : гексан ― 1 : 1 (R_f = 0,48). Через 40 мин к смеси добавили 1М раствор HCl при ‒70 ^оС до нейтрального значения pH, затем упарили органический слой. Остаток растворили в 100 мл смеси вода-бензол (1 : 1). Органический слой упарили и хроматографировали остаток на силикагеле, элюент ― петролейный эфир : этилацетат (3 : 1). Получили 5 г продукта 2 с выходом 58%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 5.10(s, br, 1H), 4.38(s, br, 1H), 3.75(s, 3H), 3.74(s, 3H), 2.9-2.7(m, 3H), 2.25-2.05(m, 2H), 1.43(9H, s).
¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 172.4, 172.0, 155.5, 117.1, 80.6, 52.7, 52.6, 51.0, 38.3, 33.9, 28.3, 19.0
MS (EI): m/z, 287.2 [M+H⁺].

Метил(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-[(3S)-2-оксипирролидин-3-ил]пропаноат (3)

В 40 мл метанола растворили 2 г (6,4 ммоль) цианметильного производного 2 и 0,83 г (6,4 ммоль) хлорида кобальта. При охлаждении до ‒10 ^оС порциями присыпали 2,2 г (57 ммоль) сухого боргидрида натрия. После каждой порции смесь приобретала черную окраску и затем снова светлела. Через сутки при комнатной температуре по данным масс-спектрометрии LC/MS реакция доходит до конца. Органический растворитель упарили, остаток суспендировали в этилацетате и пропустили через тонкий слой силикагеля, упарили растворитель и остаток хроматографировали на силикагеле, элюент ― этилацетат (R_f  = 0,16). Получили 1,0 г кристаллического вещества 3 с выходом 55% и т.пл. 114 ^оС

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 6.42(s, br, 1H), 5.54(d, 8.4 Hz, 1H), 4.30(m, 1H), 3.72(s, 3H), 3.37-3.27(m, 2H), 2.50-2.35(m, 2H), 2.15-2.05(m, 1H), 1.90-1.75(m, 2H), 1.42(9H, s).
¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 179.7, 172.9, 155.7, 79.9, 52.4, 52.3, 40.3, 38.1, 34.1, 28.3, 28.1
MS (EI): m/z, 315.3 [M+H⁺].

Метил(2S)-2-{[2-(бензилоксикарбониламино)-4-метилпентаноил]амино}-3-[(3S)-2-оксипирролидин-3-ил]пропаноат (4)

В 0,3 мл хлористого метилена растворили 30 мг (0,104 ммоль) эфира 3 и прибавили 0,2 мл трифторуксусной кислоты. Через 30 мин при комнатной температуре по ТСХ происходит исчезновение исходного вещества. Трифторуксусную кислоту упарили на роторном испарителе. Полученную трифторацетатную соль растворили в 1 мл хлористого метилена, прибавили 33 мг (0,13 ммоль) Cbz-L-лейцина, 40 мг (0,13 ммоль) TBTU, 15 мг (0,13 ммоль) N-гидроксибензотриазола и охладили до 0 ^оС. В реакционную смесь добавили 0,11 мл (0,62 ммоль) диизопропилэтиламина. Смесь выдержали в холодильнике в течение ночи. Обработали реакционную массу смесью раствора поташа и этилацетатом, органический слой промыли водой и упарили. Остаток хроматографировали на силикагеле, элюент хлороформ: метанол 95/5 (R_f = 0,14). Получили 30 мг продукта 4 в виде желтоватого вязкого масла, выход 66%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 7.96 (d, 7.0 Hz, 1H), 7.40-7.21(m, 5H), 6.64 (s, 1H), 5.56(d, 9.0, 1H), 5.07(s,2H), 4.54-4.30 (m, 2H), 3.70(s, 3H), 3.36-3.18(m, 2H), 2.47-2.27(m, 2H), 2.26-2.11(m,1H),1.82-1.59(m, 4H), 1.57-1.43(m,1H), 0.95(d,6.1 Hz,6H)
¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 179.9, 173.0, 172.2, 156.1, 136.3, 128.5, 128.1, 127.9, 66.8, 53.3, 52.4, 51.4, 42.4, 40.5, 38.3, 32.9, 28.1, 24.6, 22.9, 22.1.
MS (EI): m/z, 434.4 [M+H⁺].

Бензил(1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-амино-4,5-дигидрокси-6-(((S)-1-((S)-8-гидрокси-1-оксихроман-3-yl)-3-метилбутил)амино)-1,6-диоксогексан-3-ил)амино)-1-оксо-3-((S)-2-оксопирролидин-3-ил)пропан-2-ил)амино)-4-метил-1-оксопентан-2-ил)карбамат (5)

Растворили 4 мг (9 мкмоль) эфира дипептида 4 в 0,1 мл метанола и прибавили 0,02 мл (20 мкмоль) 1М раствора LiOH в воде. Через 1 ч при комнатной температуре по данным LCMS реакция прошла. Нейтрализовали смесь 0,02 мл 1М раствора соляной кислоты, упарили растворители на роторном испарителе. Полученную кислоту растворили в 0,1 мл ДМФА, прибавили 3 мг (6 мкмоль) трифторацетата Амикумацина А, 3,8 мг (11,7 мкмоль) TBTU, 6,2 мг (6 мкмоль) N-гидроксибензотриазола и охладили до 0^оС. К реакционной массе прибавили 0,01 мл (54 мкмоль) диизопропилэтиламина. Через сутки рекционную смесь разбавили водой и экстрагировали этилцетатом, после упаривания органического растворителя продукт выделили препаративной ТСХ на силикагеле, элюент этилацетат: метанол 85/15 (R_f = 0,3). Получили 0.5 мг продукта 5 в виде смеси диастереомеров (3:1). Выход составил 10%.

¹H и ¹³С ЯМР DMSO-d₆: см. таблица.
MS (EI): m/z, 825,6 [M+H⁺].

Наработка и выделение Амикумацина A

В исследовании использовали штамм Bacillus pumilus ВКМ В-3464D (Патент RU2737856C1) [11], альтернативное название Bacillus pumilus strain 124, GenBank: QENN00000000.1, изолированный в 2017 г. [12]. B. pumilus (GenBank: QENN00000000.1), продуцирующий Ami, культивировали при 28 ^оC в среде SYC, содержащей 40 г/л сахарозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л CaCO₃, 1,5 г/л K₂HPO₄, 2 г/л глюкозы, 2 г/л NaCl, 1,5 г/л MgSO₄, 2 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,01 г/л FeSO₄, 0,01 г/л MnCl₂. B. pumilus инокулировали из ночной культуры (используя разведение 1 : 100) и культивировали в колбах на 750 мл в 100 мл среды на термостатируемой качалке с интенсивностью качания 250 об./мин. Клетки центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, а супернатант фильтровали с использованием фильтра Millistak + HC Pod Depth Filter (Millipore, Billerica; США).

Выделение Ami включало три хроматографических стадии. На первом этапе супернатант очищали методом твердофазной экстракции с сорбентом LPS-500 («Техносорбент»; Россия) на колонке XK 26 (GE Healthcare Life Sciences; США) с использованием буфера А (10 мМ NН₄ОАс, рН 5.0, 5% ACN), буфер B (10 мМ NH₄OAc, pH 5.0, 80% ACN), скорость потока 6 мл/мин, ступенчатый градиент 0–10 мин (0% B), 10–20 мин (20% B), 20–36 мин (40% B) и 36–45 мин (100% B). Фракции, содержащие Ami (40% B), лиофилизировали, растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и дважды фракционировали на колонке RP-HPLC Zorbax ODS 62 × 250 мм (Agilent; США) с использованием буфера A и B, скорость потока 5 мл/мин, градиент 0–10 мин (0% B), 10–24 мин (0–70% B), 24–25 мин (70–100% B). Наконец, Ami очищали на колонке Symmetry C18 5 мкм 4,6 × 150 мм (Waters; США) RP-HPLC с использованием буфера A и B, скорость потока ― 1 мл/мин, градиент ― 0–5 мин (0% B), 5–20 мин (0–100% В). Мониторинг Амикумацина A контролировали по поглощению при 315 нм. Концентрацию Ami измеряли с использованием εMeOH_315нм = 4380 М^-1см^-1.

Экспрессия и очистка протеазы

Кодон-оптимизированная последовательность гена, кодирующего полноразмерный M^Pro SARS-CoV-2, слитого с последовательностью 6×His на С-конце и с белком GST на N-конце в плазмиде pGEX6p [13], был любезно предоставлен профессором Рольфом Хильгенфельдом. Кодирующий M^Pro ген был фланкирован последовательностями двух протеазных сайтов для последующего процессирования полноразмерной M^Pro: сайт узнавания M^Pro для автопроцессинга (на N-конце последовательности) и сайт протеазы PreScission™ непосредственно перед 6×His для его удаления, как описано ранее [13]. Полноразмерный белок M^Pro был получен в клетках E. coli BL21(DE3) и очищен в соответствии с методикой [13]. Белок GST-M^Pro самопроцессировался во время экспрессии. M^Pro-His очищали с помощью металл-хелатной хроматографии с использованием сорбента TALON (Clontech; США) и обрабатывали PreScission™ Pro (соотношение M^Pro и PreScission как 100:1) на 48 ч при 4 °C для удаления 6×His и получения M^Pro с интактным C-концом. Смесь M^Pro с PreScission™ Pro была очищена с использованием сорбентов GST-Sepharose (Amersham Biosciences, Германия) и TALON (Clontech; США) IMAC. Вестерн-блот анализ с использованием антител к 6×His показал, что последовательность 6×His была полностью удалена. M^Pro концентрировали до 10 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl pH 7.5.

Анализ активации пролекарства Cbz-Leu-CG-Ami протеазой M^Pro

Удельная активность M^Pro была оценена с использованием FRET-субстрата (FRET-S), Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2 (BPS Bioscience, США) и соответствовала чистому препарату M^Pro [14]. Протеолиз пролекарства проводили в присутствии 0.1‒1 мкM M^Pro в реакционном буфере (20 мM Tris-HCl pH 7.3, 100 мM NaCl, 1.0 мM ЭДТА и 1.0 мM DTT) с использованием 10 мкM Cbz-Leu-CG-Ami при температуре 30 °С. Продукты реакции анализировали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ согласно описанной ранее методике [15]. Амикумацин А и его производные детектировали по поглощению при длине волны 315 нм. Концентрацию оценивали с использованием стандарта Ami, εMeOH_315нм = 4380 М^-1см^-1.

Оценка клеточной цитотоксичности

Цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-теста с использованием и клеточной линии HEK-293 (ATCC; США). Клетки А549 высевали в количестве 2 × 10⁵ кл./лунка в 96-луночный микропланшет в среду DMEM (Gibco, Invitrogen; США) с 2 мМ L-глутамина (Invitrogen; США), 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco; США) и инкубировали при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч. После инкубации среду удаляли. Затем клетки обрабатывали свежей средой, содержащей варьируемые концентрации Амикумацина A и аналога Cbz-Leu-CG-Ami в диапазоне 0,01–50 мкг/мл в течение 48 ч. После этой процедуры среду удаляли и клетки обрабатывали в течение 2 ч реагентом МТТ (концентрация 2,5 мг/мл). Живые клетки превращали МТТ в формазан, приобретающий сине-фиолетовый цвет при растворении в ДМСО. Раствор удаляли и добавляли 200 мкл ДМСО для растворения формазана. Оптическое поглощение обработанных клеток и контрольных (необработанных) клеток измеряли при 570 нм с использованием плашечного ридера Varioskan Flash (Thermo Fischer Scientific; США). Выживаемость оценивали как отношение оптической плотности обработанных клеток к контрольным, измеренной в каждом эксперименте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения пептида, имитирующего сайт узнавания протеазы M^Pro [16], был синтезирован аналог глутамина (циклоглутамин) 3 в четыре стадии с общим выходом 27% из глутаминовой кислоты [17, 18]. Алкилирование диэфира глутаминовой кислоты 1 протекает стереоселективно, однако наблюдается неполная конверсия исходного диэфира (рис. 1). Продукт реакции 2 очищали колоночной хроматографией на прямой фазе. Восстановление нитрила проводили боргидридом натрия в метаноле при ‒10 °С. В процессе восстановления в результате конкурирующей реакции происходит димеризация 2 с образованием вторичного амина (~15‒20%), который легко отделяется при хроматографической очистке.
После снятия Boc-группы с 3, последующего ацилирования в присутствии конденсирующего агента TBTU [16] Cbz-лейцином и гидролиза сложного эфира был получен дипептид 4, содержащий метильную защитную группу на карбоксильном фрагменте (рис. 1).

Амикумацин А является особенно мощным ингибитором трансляции как у про-, так и у эукариот [19, 20]. В природе Ami продуцируется пробиотическими штаммами Bacillus pumilus [10, 12;], опосредующими их противомикробную активность. Для данного исследования Амикумацин А был получен наработкой в бактериях B. pumilus по методу, описанному ранее [21].

На заключительной стадии синтеза после количественного удаления метильной защиты раствором щелочи в воде дипептид 4 без дополнительной очистки был введен в конденсацию с Амикумацином А в присутствии TBTU (рис. 1). Целевой продукт Cbz-Leu-CG-Ami 5 очищенный методом препаративного ТСХ был получен в виде смеси диастереомеров (3 : 1). Для целевого продукта 5 были зарегистрированы спектры ЯМР 1D ¹Н, 2D ¹³C-HSQC (с редактированием спектра в соответсвии с мультиплетностью сигналов) и 2D TOCSY (Bruker Avance I 700 МГц). Анализ спектров ЯМР позволил выделить спиновые системы и после сравнения со спектрами двух исходных фрагментов (Амикумацина А и дипептида 4) однозначно отнести химические сдвиги протонов и связанных с ними через одну химическую связь атомов ¹³С (таблица и рис. 2). Модификация Амикумацина А по 10'-NH₂ привела к изменению химических сдвигов атома углерода 10' (–2.56 м.д.) и соседних атомов 9' и 11' (+1.52 и +1.57 м.д. соответственно).

В результате был синтезирован инактивированный аналог Ami 5 для последующего тестирования на возможную активацию полученного соединения протеазой M^Pro SARS-CoV-2. В отличие от исходного Амикумацина А, обладающего высокоэффективным антипролиферативным действием (IC₅₀ = 0,06 ± 0,02 мкг/мл) [19, 22], модифицированное производное Cbz-Leu-CG-Ami 5 не ингибировало рост клеток вплоть до повышения концентрации 50 мкг/мл. Несмотря на то, что последовательность пептида Cbz-Leu-CG позволяет высокоэффективно осуществлять таргетирование M^Pro [:lit_16], молекула Cbz-Leu-CG-Ami была стабильна в присутствии протеазы M^Pro. Было показано, что менее 3% свободного Амикумацина А может быть высвобождено в присутствии 1 мкM M^Pro ([S]/[E]=10‒100) в течение 4 ч.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Появление COVID-19 в 2019 г. поставило перед специалистами здравоохранения задачи, связанные с быстрой диагностикой и оказанием медицинской помощи больным. В настоящее время большинство препаратов, используемых для терапии COVID-19, неспецифичны, имеют большое число серьезных побочных эффектов и применимы только в экстренных случаях [23]. Лишь два SARS-CoV-2-специфичных лекарственных кандидата успешно прошли клинические испытания [6, 7], один из которых нашел сегодня применение в лекарственном препарате нирматрелвир [23]. В настоящее время продолжается интенсивное изучение клинических и эпидемиологических особенностей коронавирусного заболевания, разработка новых средств его профилактики и лечения.

Результаты оценки клеточной цитотоксичности полученного в настоящем исследовании конъюгата Cbz-Leu-CG-Ami 5 на клеточной линии HEK-293 показывают снижение IC₅₀ инактивированного амикумацина на несколько порядков по сравнению с исходным Ami, что говорит о том, что, несмотря на высокую эффективность природного Амикумацина А в ингибировании эукариотической трансляции, на его основе могут быть созданы инактивированные аналоги, последующая специфическая активация которых позволит осуществлять направленное терапевтическое воздействие. Однако скорость протеолиза синтетического производного Cbz-Leu-CG-Ami более чем на четыре порядка ниже скорости протеолиза, характерной для природных субстратов, что свидетельствует о необходимости дальнейшей оптимизации полученной молекулы. Введение заместителей в P₁'-положение является критичным для функционирования многих протеаз, что, по-видимому, характерно и для M^Pro и требует дополнительного введения адаптерных последовательностей.

ВЫВОДЫ

Разработка лекарственных препаратов, нацеленных на специфические клеточные мишени и механизмы, лежит в основе успешного лечения вирусных заболеваний. В представленной работе предложена разработка нового инактивированного аналога природного ингибитора биосинтеза белка Амикумацина А, модифицированног пептидной последовательностью Cbz-Leu-CG, узнаваемой основной протеазой M^Pro вируса SARS-CoV-2. Исследование способности синтетического аналога Ami к активации основной протеазой SARS-CoV-2 выявило принципиальную возможность создания пролекарства с указанным принципом действия, однако наблюдавшийся низкий уровень гидролиза свидетельствует о необходимости дальнейшей модификации полученной молекулы. Оптимизация структуры и увеличение активности новых аналогов Амикумацина А представляют, на наш взгляд, перспективный подход для разработки лекарственных кандидатов для лечения COVID-19.