Ежегодно регистрируется более 10 млн новых случаев заболеваемости туберкулезом и около 1,5 млн смертей. Пандемия COVID-19 тоже внесла свой вклад в распространенность туберкулеза, который развивается на фоне вирусной инфекции — общемировой уровень заболеваемости туберкулезом в 2020 и 2021 гг. повысился на 3–6% по сравнению с предыдущими годами [1]. Несмотря на это, в пандемийные 2020–2021 г. заболеваемость туберкулезом в РФ снизилась, но в то же время осложнилось его течение. При первом обращении увеличилось количество больных с деструкцией легочной ткани, массивным бактериовыделением и фиброзно-кавернозным туберкулезом [2].

На данный момент единственной одобренной вакциной для профилактики туберкулеза является БЦЖ. БЦЖ используют более 100 лет и помимо туберкулеза она способна обеспечивать неспецифичную защиту против других респираторных и вирусных заболеваний, обеспечивая тренированный иммунитет [3]. В Российской Федерации БЦЖ вводят трехкратно детям, не имеющим противопоказаний после рождения, и помимо протективного действия она способна вызывать ряд поствакцинных осложнений, таких как воспалительные реакции, проявляющиеся в виде инфильтратов, абцессов, свищей и язв [4]. Недостатком БЦЖ является также то, что эта вакцина не обеспечивает защиту от туберкулеза легких у взрослых [5]. В случае туберкулеза с множественной или широкой лекарственной устойчивостью требуется использовать дорогостоящие и при этом токсичные препараты химиотерапии [6]. С учетом вышесказанного актуальной становится задача поиска новых эффективных вакцин против туберкулеза для подростков и взрослых, в том числе для профилактики и иммунотерапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Основная цель вакцинации — предупреждение развития заболевания. В случае туберкулеза Т-клеточный ответ играет ключевую роль в элиминации патогена, и основной эффект вакцинации, обеспечивающий протективное действие против туберкулеза, заключается в формировании CD4⁺-клеток памяти. CD8⁺-клетки, в свою очередь, обеспечивают контроль распространения микобактерий при хроническом туберкулезе. Секреция провоспалительного цитокина IFNγ Т-клетками ассоциируется с протективным действием вакцин [7].

При поиске новых противотуберкулезных вакцин исследователи чаще всего обращаются к субъединичным белковым вакцинам или вирусным векторам [8], но на сегодняшний день исследователи предлагают новые дизайны вакцин на основе мРНК. Так, показана способность самореплицирующейся мРНК вакцины вызывать специфичный ответ CD4⁺- и CD8⁺-клеток [9]. При сравнении с другими типами вакцин мРНК-вакцины обладают рядом преимуществ. Они обеспечивают на порядок более высокий титр антител при сравнении с вакцинами на основе белковых антигенов. При этом стоимость их производства и масштабирования ниже, поскольку для этого используют бесклеточный способ наработки [10]. В сравнении с ДНК-вакцинами, мРНКвакцины менее генотоксичны, поскольку не способны встраиваться в геном [10], а также более эффективны, поскольку выполняют свою функцию в цитозоле клетки, а не ядре, как ДНК-вакцины, что делает их эффективность не зависимой от этапа клеточного цикла при трансфекции [11].

В случае перехода от аттенуированных вакцин к белковым или к вакцинам на основе нуклеиновых кислот, возникает проблема выбора эпитопа для иммунизации. Чаще всего используют субъединичные вакцины, которые содержат последовательность одного белка [12], но также есть варианты вакцин, содержащие эпитопы от одного или нескольких антигенов патогена, что может приводить к синергическому иммунному ответу [13]. Подобные вакцины называются мультиэпитопными. Гуморальный и Т-клеточный ответ вызывают разные эпитопы. В-клеточные эпитопы могут быть нелинейными, повторяя нативную конформацию белка, и линейными, в то время как Т-клеточные эпитопы представляют собой короткие пептиды. Использование мультиэпитопных вакцин позволяет индуцировать оба типа иммунных реакций одновременно. Для предсказания эпитопов противотуберкулезных мРНК вакцин активно используют биоинформатические инструменты [14, 15]. При этом использование коротких пептидов в составе мультиэпитопной вакцины позволяет избежать возможных аллергических реакций, появляющихся в случае использования аттенуированных вакцин [16]. Помимо этого, мультиэпитопная вакцина может содержать эпитопы антигенов различных микроорганизмов, что приводит к эффективной иммунизации против нескольких возбудителей одновременно [13].

Однако число экспериментальных работ, в которых сравнивали эффективность мРНК-вакцин, кодирующих полноразмерные и мультиэпитопные варианты антигенов, ограничено. Таким образом, целью нашего исследования было оценить выраженность Т-клеточного ответа у мышей, иммунизированных мРНК-вакцинами, которые кодируют полноразмерный или мультиэпитопный антиген M. tuberculosis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн эксперимента

В эксперименте были использованы 15 самцов мышей C57BL6/J в возрасте 8–9 недель SPF-статуса и массой 19–21 г, полученные из Центра генетических ресурсов лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН. Содержались в условиях конвенционального вивария при фиксированном световом режиме 12.00 : 12.00 ч. Стандартный корм (гранулы) и воду животные получали без ограничения. Мыши были иммунизированы внутримышечно двумя различными вариантами мРНК-вакцин: mRNA Rv3875 (582 нуклеотида) или mRNA mEpitope (699 нуклеотида) по 50 мкг РНК каждой. Кроме того, мыши были иммунизированы полноразмерным белком Rv3875 (25 мг) в качестве адъюванта, к которому были использованы липидные наночастицы, не содержащие мРНК, в количестве, эквивалентном (± 10%) количеству частиц в группах с РНК-вакцинами. Помимо экспериментальных групп, были созданы две контрольные группы: первая — с введением липидных наночастиц без мРНК, вторая — с введением фосфатного буфера. В каждой группе было по три животных. Через четыре недели после первой иммунизации животные были иммунизированы повторно теми же дозами препаратов. Забой мышей и выделение селезенки осуществляли через четыре недели после второй иммунизации (рис. 1).

Выбор эпитопов для мультиэпитопной конструкции Rv3875

Для предсказания эпитопов MHC I использовали пакет MHCFlurry 2.0 версии 2.0.4 [17], для предсказания эпитопов MHC II — пакет NetMHCIIpan 4.1 [18]. Для расчета эпитопов были выбраны опции длины возможных эпитопов: «-length» = 13,14,15,16,17 и «-BA», для того чтобы включить режим предсказания аффинности для пары эпитоп– аллель. Количественные характеристики частот аллелей были получены на основе опубликованных данных [19, 20]. Полученные предсказания результатов MHCFlurry 2.0 и NetMHCIIpan 4.1 отфильтровывали в среде Python 3.9. Каждая пара эпитоп–аллель должна взаимодействовать с аффинностью не более 500 нМ, каждый эпитоп должен связываться как минимум с 5 различными аллелями. С помощью такого алгоритма было отобрано два эпитопа для MHC I (LLDEGKQSL и AAWGGSGSEAY) и три эпитопа для MHC II (WNFAGIEAAASAIQG, KQSLTKLAAAWGGSG и LNNALQNLARTISEA). Финальная конструкция содержала пять эпитопов (по одной копии каждого эпитопа), соединенных между собой линкерами (KK для MHCII и AAY для MHCI). Кроме того, в конструкцию была добавлена последовательность цитоплазматического и трансмембранного домена MHC класса I (IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA), который обеспечивает колокализацию целевого белка с комплексами гистосовместимости в различных эндоцитарных компартментах [21].

Клонирование

С целью получения конструкций для последующей in vitro транскрипции РНК в коммерческий вектор pSmart (Lucigen; США) встраивали кассету, содержащую последовательность 5'-UTR (gggaaataagagagaaaagaagagt aagaagaaatataagaccccggcgccgccacc), последовательность белка Rv3875 (полноразмерного или мультиэпитопного) и 3'-UTR (gctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtgtctttgaataaagtctgagtgggcggca). Затем полученную кассету обрабатывали рестриктазами EcoRI и BglII, очищали на агарозном геле и осуществляли лигирование с аналогично подготовленным коммерческим вектором pSmart (Lucigen; США). Химически компетентные клетки NEB-stable (New England Biolabs; Великобритания) трансформировали лигазной смесью и высевали на LB-агар, содержащий ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Колонии на наличие вставки проверяли методом ПЦР. Верификацию плазмид осуществляли секвенированием по Сэнгеру. Анализ хроматограмм секвенирования проводили с помощью программы Ugene v38.1. E. сoli NEB-stable с вектором культивировали при 30 °C и 180 rpm. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen; США). Для получения линеаризованной плазмиды препарат обрабатывали рестриктазой SpeI по уникальному сайту рестрикции, расположенному после поли(А)-хвоста.

Для получения конструкции и наработки полноразмерного белка Rv3875 использовали вектор pET30 (Agilent; США). Последовательность Rv3875 с дополнительной последовательностью для шести гистидинов на N-конце была собрана из олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Полученную кассету обрабатывали рестриктазами EcoRI и NdeI, очищали на агарозном геле и осуществляли лигирование с аналогично подготовленным коммерческим вектором pET30 (Agilent; США). Для трансформации использовали клетки BL21DE3 (Agilent; США). Верификацию плазмид осуществляли секвенированием по Сэнгеру.

In vitro транскрипция мРНК

In vitro транскрипцию проводили, как описано ранее [22]. Использовали 5 мкг линеаризованной плазмиды, буфер (20 мМ DTT, 2 мМ спермидина, 80 мМ HEPES-KOH pH 7,4, 24 мМ MgCl₂), 500 единиц T7 РНК-полимеразы («Биолабмикс»; Россия), 200 единиц ингибитора рибонуклеаз RiboCare («Евроген»; Россия) и 1 мкл смеси ферментов из набора RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega; США) в качестве источника неорганической пирофосфатазы. Реакционная смесь содержала также 12 мМ аналога кэпа ARCA («Биолабмикс»; Россия) и по 3 мМ каждого из рибонуклеозид трифосфатов («Биосан»; Россия). Реакцию проводили 2 ч при температуре 37 °С, после чего добавляли еще по 3 мМ каждого из рибонуклеозид трифосфатов и инкубировали в течение еще 2 ч. ДНК гидролизовали при помощи нуклеазы RQ1 (Promega; США), РНК преципитировали добавлением LiCl до концентрации 0,32 M и EDTA pH 8,0 до концентрации 20 мМ с последующей инкубацией на льду в течение часа. Далее раствор центрифугировали в течение 15 мин (25 000 g при 4°С). Осадок РНК промывали 70%-м этанолом, растворяли в ультрачистой воде и еще раз преципитировали спиртом по стандартной методике. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм. Целевую длину и гомогенность синтезированных РНК молекул оценивали с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent; США).

Формуляция мРНК в ЛНЧ

Формулирование мРНК в липидные наночастицы проводили путем смешивания водного раствора (10 мМ цитратный буфер, pH 3,0) 0,2 мг/мл мРНК со спиртовым раствором смеси липидов в микрофлюидном картридже на приборе The NanoAssemblr™ Benchtop (Precision Nanosystems; США). Липидная смесь содержала следующие компоненты: ионизируемый липидоид ALC-0315 (BroadPharm; США), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) (Avanti Polar Lipids; США), холестерин (Sigma-Aldrich; США), DMG-PEG-2000 (BroadPharm; США) в молярном соотношении (%) 46,3 : 9,4 : 42,7 : 1,6. Массовая доля мРНК в ЛНЧ составляла 0,04% масс. Для формирования частиц водную и спиртовую фазы смешивали в соотношении 3 : 1 по объему с общей скоростью смешивания 10 мл/мин.

Затем частицы фильтровали в стерильных условиях через фильтр с мембраной из PES 0,22 мкм (Merck; США) и хранили при 4 °С. После фильтрации качество полученных частиц анализировали по двум параметрам: размер частиц (Zetasizer Nano ZSP, Malvern Panalitycal; США) и загрузки мРНК. Концентрацию загруженной в липидные наночастицы мРНК определяли по разнице значений уровня флуоресцентного сигнала при окрашивании реагентом RiboGreen (Thermo Fischer Scientific; США) суспензии частиц до их разрушения и после. Для разрушения частиц использовали детергент Triton X-100 (Sigma-Aldrich; США).

Наработка и очистка белка Rv3875

Для наработки белка E. сoli BL21DE3 с вектором культивировали при 37 °C и 180 rpm до OD₍₆₀₀₎ = 0,65. Затем добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и культивировали клетки 6 ч при 30 °C. Клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl pH 8,0 и 300 мМ хлорида натрия. Далее проводили лизис клеток ультразвуком с длительностью импульса 15 с и промежутком между импульсами 15 с. Амплитуда ультразвуковых колебаний составляла 50% от максимальной. После лизиса образцы центрифугировали в течение 15 мин (20 000 g при 4 °С). pH полученного после центрифугирования супернатанта доводили до 7,5 путем добавления раствора 1 М Tris-OH. Затем испытуемый образец подвергали фильтрации через полиэфирсульфоновую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.

Первый этап очистки белка Rv3875 осуществляли с использованием металлохелатного аффинного сорбента со средним размером частиц 30 мкм. На сорбент с иммобилизованным хелатирующим лигандом (нитрилотриуксусной кислотой) наносили лизат клеток и элюировали в градиенте имидазола. Затем фракции очищенного белка диализовали против буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCl. Диализованный образец наносили на сильный катионообменный сорбент со средним размером частиц 45 мкм и иммобилизованными на них функциональными сульфогруппами (‒SO₃‒). Массу Rv3875 проверяли как с помощью классического метода электрофореза в полиакриламидном геле, так и с помощью масс-спектрометра maXis 4G ETD (Bruker; США).

Оценка уровня T-клеточного ответа после вакцинации

Уровень сформированного Т-клеточного ответа у вакцинированных мышей определяли по количеству спленоцитов, секретирующих IFNγ в ответ на белок туберкулеза Rv3875 с помощью метода ELISpot.

Из селезенок вакцинированных и контрольных мышей выделяли спленоциты протиранием через фильтр 70 мкм. Спленоциты высаживали в количестве 300 тыс. клеток (BD; США) в ELISpot планшеты с PVDF-мембраной с одновременной стимуляцией. Стимуляцию осуществляли белком Rv3875 (50 мкг/мл) и дендритными клетками линии DC2.4 в количестве 30 тыс. клеток на лунку. Каждую экспериментальную лунку ставили в двух технических повторах. После посадки спленоцитов и добавления стимуляторов суммарный объем лунки составлял 200 мкл питательной среды RPMI-1640 («ПанЭко»; Россия) с 10% FCS. Далее спленоциты культивировали 18 ч в CO₂инкубаторе (5% CO₂, 37 °С).

По истечении срока культивирования спленоциты, секретирующие IFNγ, выявляли с помощью наборов Mouse IFNg ELISpot Set (BD; США) и AEC Substrate Set (BD; США), согласно инструкции производителя. Подсчет точек, соответствующих спленоцитам, секретирующим IFNγ, производили на приборе S6 Ultra (CTL; США).

Цитометрическое определение IFN-продуцирующих клеток

Для цитометрического определения IFNγ-продуцирующих клеток спленоциты вакцинированных мышей высаживали в 200 мкл среды RPMI-1640 в культуральный 96-луночный планшет в количестве 300 тыс. на лунку и стимулировали белком Rv3875 (50 мкг/мл) или оставляли нестимулированными. Через 2 ч после начала стимуляции в лунки добавляли Брефелдин А (Abcam; США) в концентрации 10 мкг/мл. Далее клетки культивировали ночь в СО₂-инкубаторе. По окончании инкубации клетки окрашивали анти-CD3 (PE Anti-Mouse CD3, Elabscience) и CD8-антителами (FITC Anti-Mouse CD8а, Elabscience) в концентрации согласно инструкции производителя, фиксировали и пермеабилизировали коммерческим набором (BD; США) согласно инструкции производителя. Полученные пробы анализировали на проточном цитометре LSRFortessa (BD; США). Пример гейтирования представлен в Приложении 1. Полученные данные обрабатывали в программе FlowJo (Treestar Inc.; США).

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA и Turkey’sтест в качестве post-hoc-анализа. Различия между экспериментальными группами считали статистически значимыми при p < 0,05. Анализ данных производили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (Statsoft Inc.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ Т-клеточного ответа методом ELISpot на IFNγсекретирующие клетки показал эффективность вакцинации [F(10,4) = 6,02; p = 0,012]. Количество IFNγ-секретирующих клеток в ответ на стимуляцию DC2.4+RV3875 было выше в спленоцитах мышей, вакцинированных мультиэпитопным вариантом мРНК-вакцины (mRNA mEpitope) по сравнению с контрольными группами (PBS, LNP) или спленоцитами мышей, иммунизированных белком Rv3875 с наночастицами без РНК (Rv3875+LNP) (рис. 2А). Количество IFNγ-секретирующих клеток среди спленоцитов мышей, иммунизированных мРНК-вакциной, кодирующей полноразмерный белок Rv3875, было также выше, чем у контроля (64 ± 2,7 vs 2,5 ± 1,0) однако эти изменения статистически не достоверны. Следует отметить, что спленоциты мышей, иммунизированных белком Rv3875 с «пустыми» ЛНЧ без мРНК, демонстрировали лишь незначительное увеличение IFNγ-секретирующих клеток по сравнению со спленоцитами после иммунизации мРНК-вакцинами (Rv3875: 5,7 ± 1,8; mRNA Rv3875: 64,0 ± 2,7; mRNA mEpitope: 126,0 ± 46,2). Данные по спленоцитам отдельных животных представлены в Приложении 2.

Цитометрическое исследование было проведено на спленоцитах одного животного из каждой группы. Поэтому отсутствует статистическая обработка данных, результаты приведены для наглядности. По нашим данным, процент T-лимфоцитов CD3⁺CD8⁺ и CD3⁺СD8^‒, продуцирующих IFNγ, выше в спленоцитах мышей, иммунизированных мРНК-вакцинами (рис. 2Б). Таким образом, данные по цитометрии подтверждают, что повышенная секреция IFNγ в спленоцитах мышей, вакцинированных mRNA Rv3875 и mRNA mEpitope, обеспечивается в том числе за счет T-лимфоцитов, что говорит о формировании Т-клеточного ответа на антигены микобактерии туберкулеза у вакцинированных мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наши результаты показали, что иммунизация мРНКвакциной, кодирующей мультиэпитопный белок Rv3875 (ESAT6) M. tuberculosis, приводит к более выраженному Т-клеточному ответу, как по сравнению с иммунизацией мРНК-вакциной, кодирующей полноразмерный вариант белка, так и по сравнению с иммунизацией рекомбинантным белком. Эти результаты могут быть вызваны как более эффективной презентацией эпитопов комплексами гистосовместимости I и II типов, так и связаны с выбором наиболее иммуногенных эпитопов [11]. Повышение эффективности презентации может быть обусловлено правильным расщеплением белковой молекулы по протеосомному и лизосомному пути, которое обеспечивается путем добавления последовательностей расщепляющихся линкеров [23]. Кроме того, на иммуногенность оказывают влияние лидерные последовательности. В качестве такой последовательности мы использовали последовательность цитоплазматического и трансмембранного домена MHC класса I на карбоксильном конце белковой молекулы. Ранее было показано, что лидерная последовательность с транспортным сигналом MHC класса I обеспечивает ко-локализацию целевого белка с комплексами гистосовместимости в различных эндоцитарных компартментах и, как результат, приводит к эффективной активации и экспансии антиген-специфичных CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток [21].

Еще одним несомненным преимуществом мультиэпитопных вакцин является возможность «настройки» Т-клеточного ответа за счет выбора специфичных эпитопов. В нашем исследовании мы использовали вакцину, кодирующую пять эпитопов Rv3875, три из которых презентируются с помощью MHC класса II и два с помощью MHC класса I, что обеспечивает специфичную активацию CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток. Несмотря на то что эпитопы были отобраны по сродству к человеческим аллелям, а не мышинным, мультиэпитопная мРНК-вакцина все равно показала высокую эффективность, вероятно, за счет высокой межвидовой кросс-реактивности. Т-клеточный ответ вносит основной вклад в борьбу с M. tuberculosis. CD8⁺-Т-лимфоциты способны уничтожать инфицированные фагоцитирующие клетки при помощи белков перфорина, гранзима и гранулизина, а также индукции апоптоза через FasL-рецептор, при этом секретируемый гранулизин может непосредственно вызывать гибель M. tuberculosis.

Важнейшей функцией CD4⁺-клеток при борьбе с M. tuberculosis является выработка IFNγ, активирующего макрофаги и цитотоксические Т-лимфоциты. Сниженная эффективность БЦЖ у некоторых индивидов может быть связана с недостаточной индукцией CD8⁺-Т-клеток [24].

Использование мРНК вакцин против туберкулеза было также продемонстрировано в двух экспериментальных работах, которые показали непоследовательные результаты [9, 25]. В исследовании по разработке противотуберкулезной мРНК-вакцины на основе полноразмерного MPT83антигена были обнаружены иммуногенные свойства такой вакцины [25]. При иммунизации она была способна вызывать выработку специфичных антител. Т-клетки, выделенные из селезенки мышей, секретировали IFNγ в ответ на стимуляцию антигеном, а CTL были способны лизировать трансфецированные антигеном клетки, что согласуется с полученными нами результатами. В аналогичном исследовании 2022 г. использовали мРНК ID91, содержащую четыре туберкулезных полноразмерных антигена, слитых с синтетическим агонистом TLR4, причем мРНК являлась самореплицирующейся [9]. Сравнение такой мРНК вакцины с белковой вакциной показало аналогичное увеличению титра антител, но менее выраженный Т-клеточный ответ. В нашем исследовании впервые была использована мультиэпитопная мРНК вакцина против туберкулеза. Результаты показали более выраженные эффекты по сравнению с полноразмерной мРНК-вакциной. Вероятно, дальнейшее использование мультиэпитопных вакцин для профилактики туберкулеза может быть более перспективно по сравнению с белковыми и полноразмерными мРНК-вакцинами. 

ВЫВОДЫ

Мультиэпитопная мРНК-вакцина приводит к выраженному Т-клеточному ответу у мышей при внутримышечном способе введения. Усиление Т-клеточного ответа может быть ключевым в разработке эффективной профилактической вакцины против M. tuberculosis. Вакцины к новым эпитопам туберкулеза могли бы усилить Т-клеточный ответ и ускорить вовлечение клеток адаптивного иммунитета в иммунный ответ в первые две недели заражения, обеспечивая более эффективную элиминацию патогена. Таким образом, мультиэпитопные вакцины на основе мРНК-молекул могут иметь хороший потенциал для разработки эффективной вакцины против M. tuberculosis.