Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) появилось в клинической практике с конца 1980-х гг. (ранее его называли преимплантационной генетической диагностикой (ПГД) и преимплантационным генетическим скринингом). Целью первых программ ПГД было исключение передачи по наследству заболеваний, сцепленных с Х-хромосомой. С последующим развитием технологий эмбриологического и лабораторного этапов спектр определения возможных генетических заболеваний значительно расширился, а задачами метода стали не только профилактика наследственных заболеваний, но и повышение шансов рождения здорового ребенка у сложных категорий пациентов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [1].

С развитием возможностей эмбриологических и генетических лабораторий, наибольшую эффективность и распространение в настоящее время приобрело преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) с биопсией трофэктодермы (ТФЭ). Многочисленные исследования показывают высокие значения чувствительности и специфичности данного подхода, однако одним из его недостатков остается необходимость инвазивного вмешательства [1, 2].

Другая проблема, привлекающая внимание исследователей, — мозаицизм эмбрионов, а также соответствие хромосомного состава ТФЭ эмбриона его внутренней клеточной массе (ВКМ) [3, 4]. И хотя биопсия нескольких клеток позволяет частично преодолеть указанную проблему, полностью избежать риска отвергнуть эмбрион, перенос которого в полость матки способен привести к рождению здорового ребенка, не представляется возможным. 

Новой перспективной технологией ПГТ-А является неинвазивный анализ внеклеточной ДНК отработанной культуральной среды (ОКС), в которой развивался эмбрион. Получение адекватных результатов требует определенных условий культивирования эмбриона и сбора образцов среды (для увеличения концентрации ДНК и снижения возможной контаминации), но не требует инвазивного вмешательства [5–7]. Ряд ученых полагают, что неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ниПГТ-А) — это более информативный метод ПГТ-А, особенно в связи с тем, что, по данным литературы, внеклеточная ДНК ОКС происходит не только из клеток ТФЭ, но и ВКМ [8, 9]. Другие авторы, напротив, утверждают о его нерепрезентативности, так как до сих пор остается не до конца решенным вопрос об истинном происхождении внеклеточной ДНК в ОКС [10, 11]. Тем не менее, данный подход интенсивно изучается исследователями, и, вероятно, может быть использован в клинической практике.

Целью работы было оценить эффективность ниПГТ-А. Для этого был проведен повторный анализ бластоцист, анеуплоидных по результатам ПГТ-А с биопсией ТФЭ, методом ниПГТ-А.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эмбриологический этап проводили на базе отделения ВРТ в лечении бесплодия имени Б. В. Леонова, ПГТ-А и ниПГТ-А выполняли в Институте репродуктивной генетики.

В исследование было включено 11 эмбрионов от семи супружеских пар. Все бластоцисты были анеуплоидными по результатам предшествующего ПГТ-А с биопсией ТФЭ. Эмбрионы были получены после проведения циклов ВРТ с ПГТ-А методом NGS в период с апреля по сентябрь 2020 г.

Культивирование эмбрионов, биопсия ТФЭ и ПГТ-А

Оплодотворение ооцитов проводили методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ), после чего оплодотворенные клетки переносили в культуральную среду Continuous Single Culture Complete (CSCM) (IrvineScientific; США). Все этапы культивирования, а также морфологическую оценку бластоцист выполняли по ранее описанной методике [12]. На 5–6 сутки после оплодотворения была выполнена биопсия клеток ТФЭ у эмбрионов, соответствующих отличному и хорошему качеству согласно морфологическим критериям. Для биопсии использовали боросиликатные иглы. После биопсии эмбрионы криоконсервировали путем витрификации согласно инструкции производителя культуральных сред. Полученные клетки передавали в лабораторию в пробирках типа Эппендорф, содержащих лизирующий буфер, и хранили при температуре –20 °C до дальнейшего анализа. ПГТ-А выполняли методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS) на платформе Illumina (Illumina; США) согласно протоколу производителя. Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения SeqVario («ДНК-Технология»; Россия).

Размораживание эмбрионов, культивирование и сбор отработанной культуральной среды

Размораживание донированных эмбрионов проводили на средах Kitazato (Kitazato; Япония) согласно протоколу производителя. Далее бластоцисты культивировали в индивидуальных каплях среды CSCM по 10 мкл в течение 9 ч. Отрицательным контролем служила капля культуральной среды (1 образец), находящаяся в тех же условиях культивирования, но не содержащая эмбрион. Весь объем отработанной культуральной среды собирали в пробирки типа Эппендорф и передавали в лабораторию, где их хранили при температуре –20 °C в течение 14 дней до дальнейшего анализа.

Неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии

НиПГТ-А проводили с помощью наборов NICSInst (Yicon Genomics; Китай) согласно инструкции производителя. Высокопроизводительное секвенирование осуществляли на приборе NextSeq (Illumina; США). Анализ полученных результатов проводили с помощью оригинальных алгоритмов и программного обеспечения, разработанных в Центре для осуществления проведения ПГТ-А методом NGS SeqVario.

Анализ полученных данных

Статистический анализ проводили в программе Jamovi (бесплатный свободно распространяемый пакет статистической обработки). Полученные результаты сравнивали на соответствие с предшествующими данными по ПГТ-А. Первичной конечной точкой данного исследования считали частоту полного соответствия кариотипа эмбрионов по данным ПГТ-А и ниПГТ-А. Вторичной конечной точкой оценивали частоту клинического соответствия эмбрионов (эуплоидный/анеуплоидный) по данным ПГТ-А и ниПГТ-А. Для описания категориальных бинарных данных использовали абсолютные числа N и процентные доли от общего числа в группе P в формате N (P%). С целью определения статистической значимости полного и клинического соответствия результатов использовали биноминальный тест. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суммарно выполнили анализ 12 образцов ОКС: 11 образцов, в которых были культивированы эмбрионы, и один контрольный образец. Все образцы группы исследования успешно прошли полногеномную амплификацию и анализ методом NGS. В контрольном образце ДНК не была детектирована. Результаты ПГТ-А и ниПГТ-А, а также их соответствие для исследуемых эмбрионов представлены в табл. 1.

Обращает на себя внимание, что в одном случае (9,1%) из 11 были получены хаотичные результаты по данным ниПГТ-А, не позволяющие провести диагностику состояния кариотипа (рис. 1).

В одном случае из 10 (10%) вследствие высокого уровня шума сигнала по данным ниПГТ-А анеуплоидию в эмбрионе выявить не удалось, вследствие чего полученный результат рассматривали как эуплоидный (рис. 2).

Полное соответствие результатов получено в семи из 10 случаев (70%) (рис. 3). Соответствие результатов по половым хромосомам получено в девяти из 10 случаев (90%). Клиническое соответствие результатов — в девяти из 10 случаев (90%).

Сравнение полного и клинического соответствия результатов ПГТ-А и ниПГТ-А представлено в табл. 2. Статистически значимой разницы по данным биноминального теста не было найдено для частоты полного соответствия результатов ПГТ-А и ниПГТ-А (p = 0,344), но был найден статистически значимый результат для клинического соответствия ПГТ-А и ниПГТ-А (p = 0,021).

При оценке результатов по намерению исследовать, т. е. при оценке всех 11 эмбрионов, включенных в исследование, с практической точки зрения, данные результаты означают, что в 81,8% случаев клиническое решение о возможности переноса эмбриона в полость матки не было бы изменено. В 9,1% случаев клиническое решение о возможности переноса эмбриона по данным только ниПГТ-А было бы другим (эуплоидный эмбрион был рекомендован для переноса). В 9,1% случаев клиническое заключение о возможности переноса эмбриона было вынести невозможно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Данное исследование было запланировано как пилотный проект и было ограничено небольшой выборкой, наличием только анеуплоидных эмбрионов по данным ПГТ-А, отсутствием анализа хромосомного состава ВКМ исследуемых бластоцист. Тем не менее, результаты работы продемонстрировали 100%-ю частоту детекции внеклеточной ДНК (внДНК) в ОКС, а также высокую долю получения результатов, пригодных для клинической интерпретации (90,9%).

В большинстве исследований, проведенных к настоящему времени, тоже принимали за референс показатели ПГТ-А с биопсией ТФЭ и сравнивали их с результатами ниПГТ-А. Частота соответствия результатов в подобных работах составляла 33,3–89,1% [5, 8, 13–17]. Однако следует отметить, что в упомянутых публикациях чаще описывали протокол ниПГТ-А в нативном цикле. В нашем исследовании был использован протокол работы с размороженными эмбрионами, и частота соответствия результатов согласовалась с данными приведенных исследований (полное соответствие — в 70% случаев, клиническое соответствие — в 90% случаев).

В других работах за референс принимали целый эмбрион, а ОКС собирали после культивирования размороженных эмбрионов. Частота полного соответствия результатов ниПГТ-А и ПГТ-А для всего эмбриона в подобных исследованиях варьировала от 32,2 до 89,9%. Xu et al. оценивали ОКС размороженных эмбрионов 3 суток развития после их культивирования до 5 суток. Из 42 эмбрионов анализ 66,7% показал полное соответствие результатов [18]. Yin et al. анализировали ОКС 75 размороженных бластоцист 5–6 суток развития после их культивирования в течение 24 ч. Клиническая частота соответствия результатов составила 89,8%, полная частота соответствия — 32,2% [19]. Huang et al. удалось получить информацию по ОКС 48 эмбрионов из 52 на стадии 5–6 суток развития после их размораживания и культивирования тоже в течение 24 ч. Частота полного соответствия результатов составила 85,4% [9]. Shitara et al. показали полную частоту соответствия результатов в 56,3% случаев при анализе ОКС после размораживания и культивирования эмбрионов 5 суток развития в течение 24 ч, 6 суток — в течение 3 ч [20]. Xu et al. анализировали 35 размороженных эмбрионов 3-х или 5-х суток развития. Минимальное время культивирования составило 24 ч. Успешную полногеномную амплификацию прошли 88,6% образцов ОКС. Полная частота соответствия результатов ниПГТ-А и ПГТ-А по ВКМ составила 58,3% (14/24) [21].

Следует отметить, что объем капли культуральной среды в указанных исследованиях с культивированием размороженных эмбрионов варьировал от 10 до 30 мкл, а объем анализируемых образцов — от 3,5 мкл до 25 мкл.

Время культивирования в большинстве случаев составляло не менее 24 ч. В нашем исследовании показана успешная детекция и анализ внДНК в ОКС при культивировании размороженных бластоцист в течение 9 ч в капле объемом 10 мкл, что продемонстрировало возможность получения адекватных результатов после культивирования размороженных эмбрионов в более короткий период времени.

Особый интерес представляет изучение дополнительных возможностей применения ниПГТ-А в клинической практике. Заслуживает внимания работа, авторы которой проводили ниПГТ-А для мозаичных эмбрионов по результатам предшествующего ПГТ-А с биопсией ТФЭ. Они разморозили и рекультивировали в течение 14–18 ч 41 мозаичный эмбрион, а далее повторно провели ПГТ-А с биопсией ТФЭ и всего эмбриона, а также ниПГТ-А по ОКС. Результаты анализа ВКМ показали нормальный хромосомный набор для 84,4% (35/41) эмбрионов. Данные ниПГТ-А соответствовали результатам ПГТ-А по биопсии всего эмбриона в 74,4% случаев [22]. В рамках опубликованной работы авторы доложили ретроспектиные данные о переносе мозаичных эмбрионов для 60 пар, не имевших эуплоидные эмбрионы. У 30 пациенток впоследствии была диагностирована клиническая беременность. Таким образом, исследователи сделали предположение о возможном преимуществе дополнительного применения ниПГТ-А в подобных клинических случаях.

В нашем исследовании также в одном случае был получен эуплоидный результат ниПГТ-А для анеуплоидного эмбриона (кариотип (21)–1,5) по данным предшествующего ПГТ-А с биопсией ТФЭ. Причем отсутствие нарушений именно по 21 паре хромосом было четко фиксировано (рис. 2). Учитывая вышесказанное, целесообразно собирать ОКС в циклах с ПГТ-А с целью изучения возможности дополнительного проведения ниПГТ-А в сложных или сомнительных случаях для более корректной установки диагноза в случае необходимости.

Также интересна работа 2022 г., в которой оценивали возможность клинического применения ниПГТ-А в циклах ВРТ с переносом размороженного эмбриона (РЭ) [23]. Во всех случаях эмбрионы размораживали и культивировали в течение 6 ч в капле объемом 20 мкл перед переносом в полость матки. Авторы ретроспективно проанализировали исходы переносов РЭ для 210 пациенток, в зависимости от результатов ниПГТ-А. Частота клинической беременности, продолжающейся беременности и живорождения была значительно выше для эмбрионов, эуплоидных по ниПГТ-А, в сравнении с анеуплоидными (56,2% против 29,4%). Однако не были обнаружены значимые различия для указанных репродуктивных исходов для «эуплоидных» и «хаотичных» эмбрионов по данным ниПГТ-А (56,2% против 60,4%). Доля анеуплоидных эмбрионов была значительно выше среди эмбрионов низкого и среднего качества по морфологии, в сравнении с эмбрионами хорошего качества (46%, 34,6% и 21,5% соответственно; p = 0,013). Исследователи отметили возможное преимущество применения комбинированного подхода (морфологическая оценка в сочетании с ниПГТ-А) к выбору наиболее перспективного эмбриона для переноса в полость матки. Причем авторы предложили ранжировать эмбрионы в порядке снижения приоритета для ПЭ следующим образом: 1) эуплоидные эмбрионы хорошего качества; 2) «хаотичные» эмбрионы хорошего качества; 3) эуплоидные эмбрионы среднего качества по морфологии; 4) «хаотичные эмбрионы» среднего качества по морфологии.

Следует подчеркнуть, что и другие исследователи советуют с осторожностью трактовать хаотичные результаты ниПГТ-А, с большей вероятностью отражающие условия хранения биологического материала и процессы деградации ДНК, чем хромосомный состав эмбрионов [8, 24]. Мы в своей работе тоже в одном случае (9,1%) получили хаотичные результаты ниПГТ-А (рис. 1).

Таким образом, следует отметить, что работа с внДНК и ниПГТ-А имеет ряд особенностей, которые следует учитывать при интерпретации результатов и выборе наиболее перспективных эмбрионов для переноса в полость матки. Однако как главную его черту необходимо выделить неинвазивность метода. Учитывая, что в ряде научных работ появляются данные, свидетельствующие о возможном негативном влиянии биопсии ТФЭ на течение беременности (гипертензивные расстройства, преждевременные роды, нарушения плацентации) и здоровье новорожденного, изучение именно ниПГТ-А представляется особенно актуальным [25–27]. Тем не менее, следует отметить, что в значительном количестве других работ данной взаимосвязи не обнаружено [28–30].

ВЫВОДЫ

Неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии — перспективный, не требующий биопсии, метод диагностики хромосомного статуса эмбрионов. Необходимо проведение дополнительных исследований для дальнейшей разработки и усовершенствования методики, определения возможности и показаний ее использования в клинической практике.