Рассеянный склероз (РС) — хроническое заболевание центральной нервной системы с аутоиммунновоспалительными и нейродегенеративным механизмами развития [1]. В иммунопатогенезе болезни большое значение имеют процессы, связанные с проникновением через гематоэнцефалический барьер в ткань мозга активированных Т-клеток (Т-хелперы 1-го типа (Th1), Th17клетки) и макрофагов, местной активацией астроцитов и микроглии, выработкой ими противовоспалительных цитокинов [2, 3], которые приводят к демиелинизации и дегенерации нейронов. Этиология РС остается неизвестной. Полагают, что в его развитии, кроме генетических факторов, принимают участие различные персистирующие инфекции [4]. Вирусам простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ1 и ВПГ2) [5], варицеллазостер-вирусу (ВЗВ) [6], вирусу герпеса человека 6-го типа (ВГЧ6) [7] и вирусу Эпштейна–Барр (ВЭБ) отводится основная роль в возникновении РС, развитии обострений и прогрессировании патологического процесса [8–11]. 

Известно, что выработка цитокинов клетками врожденного иммунитета имеет ключевое значение в ограничении распространения герпетической инфекции в организме человека [11, 12]. При РС в качестве основного фактора развития его обострений и прогрессирования иммуновоспалительного процесса рассматривают также дисбаланс продукции про- и противовоспалительных цитокинов. Наиболее хорошо изучены интерлейкины (IL) IL1-β, IL2, IL4, IL6, IL10, IL17, IL23, фактор некроза опухоли — (ФНО-α) и интерферон-γ (ИНФ-γ) с применением как стандартных, так и мультиплексных технологий [2, 3, 13–15]. Значение других цитокинов, в частности IL31 и IL33, в патогенезе РС изучено недостаточно и представлено только данными из зарубежных источников [16–21]. Кроме того, как в России, так и за рубежом не проводили определение цитокинов в сыворотке крови при реактивации герпетической инфекции у пациентов РС и оценку их клинического значения. Отсутствие в доступной литературе данных по этим вопросам послужило основанием для настоящего исследования. Цель работы — определение уровня цитокинов в сыворотке крови у пациентов c РС, оценка их клинического значения и взаимосвязи с реактивацией герпетической инфекции.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на базе Научно-образовательного центра демиелинизирующих заболеваний ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России и Центра рассеянного склероза в ГБУЗ ЯО «Клиническая больница № 2» г. Ярославля (Россия).

В исследование было включено 36 пациентов (12 мужчин и 24 женщины) с достоверным диагнозом РС по критериям McDonald [22] (табл. 1). Средний возраст пациентов на момент исследования составил 38,5 (28,0; 48,5) года, возраст дебюта — 27,00 (21,5; 38,0) лет и длительность заболевания — 9,50 (3,5; 12,5) года. У всех пациентов было ремитирующее течение РС (РРС), 29 (80,6%) человек находились в стадии ремиссии, у 7 (19,4%) имело место обострение заболевания.

У 30 (83,3%) пациентов проводили терапию препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза (ПИТРС) (у 14 пациентов — глатирамера ацетатом (ГА), у 16 — высокодозными интерферонами (ИНФ)), длительность лечения составила в среднем 30,0 (9,0; 67,0) месяцев. Шесть (16,7%) человек на момент осмотра были без терапии ПИТРС.

Клиническую оценку неврологического статуса проводили с использованием двойной оценочной системы J. F. Kurtzke [23]: шкалы неврологического дефицита (FSS) и расширенной шкалы инвалидности (EDSS). Средний балл по шкале EDSS составил 3,25 (2,00; 4,50), а сумма неврологического дефицита — 6,50 (3,00; 9,00) балла. В соответствии с классификацией F. Lublin [24] пациенты РРС были разделены на группы с активным РС — 17 (47,2%) и неактивным РС — 19 человек (52,8%). Среди пациентов с активным РС дополнительно выделялись пациенты с высоко активным РС (шесть человек (35,3%), имеющие два и более обострений в год.

Учитывали также основные показатели течения заболевания: первые симптомы, длительность первой ремиссии, возраст больного к периоду начала болезни, сумму баллов неврологического дефицита по шкале Куртцке (СНД), количество и тяжесть обострений. Обострения РС классифицировали как легкие при увеличении неврологического дефицита по шкале EDSS на 0,5–1 балл; средние — на 1–2 балла; тяжелые — более чем на 2 балла [25]. Среднегодовая частота обострений была равна отношению количества обострений заболевания к длительности этого периода, выраженного в годах. Скорость прогрессирования болезни рассчитывали как отношение степени инвалидизации (EDSS) в баллах к длительности болезни в годах (балл/год).

Индекс прогрессирования, отражающий скорость нарастания неврологического дефицита (СННД), рассчитывали как отношение показателя FSS (СНД) к длительности заболевания, выраженной в годах. Для оценки прогноза РС вычисляли временной интервал до наступления стойкой инвалидности (оценка по шкале EDSS = 3 балла), продолжительность первой ремиссии, время до наступления вторичного прогрессирования.

В анамнезе заболевания особое внимание уделяли перенесенным герпесвирусным заболеваниям. С целью уточнения факторов риска развития и обострений РС был разработан специальный опросник (наличие/отсутствие частых обострений лабиального и генитального герпеса, наличие вирус-ассоциированных обострений РС, наличие хронического стресса, субфебрилитета, хронических очагов инфекции, частых респираторных вирусных заболеваний и их связь с обострениями РС), производили также осмотр на наличие герпетических высыпаний.

На основании полученных данных пациенты были разделены на две группы. В первую вошли пациенты с достоверным РС и реактивацией периферической герпесвирусной инфекции (ПГВИ) (вирус-ассоциированная форма РС) — 18 (50%) человек. Критерии включения: достоверный РС в сочетании с признаками ПГВИ — наличие одновременно клинических (типичные везикулезные высыпания, субфебрилитет, лимфаденопатия, артралгии, миалгии и др.) и серологических признаков активной герпесвирусной инфекции; наличие только клинических признаков герпесвирусной инфекции на момент обострения или в интервале двух недель до и после него. Серологические признаки: низкий индекс авидности типоспецифичных антител IgG (менее 50%) и повышение коэффициента позитивности (КП) IgG в три и более раза или появление в крови специфичных IgM-антител. Вторую группу составили 18 (50%) пациентов с достоверным РС без признаков реактивации ПГВИ по данным клиники, анамнеза и результатов серологических исследований. В табл. 2 представлена клиническая характеристика данных групп.

При реактивации ПГВИ заболевание дебютировало достоверно в более раннем возрасте (p < 0,05), преимущественно у женщин, с меньшей длительностью болезни. Был отмечен более выраженный гриппоподобный синдром на терапию ПИТРС, а обострения заболевания возникали практически в два раза чаще (в 27,8%), чем в сравниваемой группе (11,1%). Не выявлено различий между данными группами пациентов по другим признакам, включая возраст на момент осмотра, активность заболевания, степень инвалидизации, наличие терапии ПИТРС. В обеих группах в большинстве случаев имела место герпесвирусная микст-инфекция, но только у пациентов с ПГВИ выявлено наличие серологических маркеров двух инфекций (ВПГ1,ВПГ2/ВЗВ и ВЭБ).

В качестве контроля обследовано 18 практически здоровых доноров без клинико-анамнестических и серологических признаков ПГВИ. В нее вошли лица без хронических неврологических заболеваний и соматической патологии в стадии обострения. Всем проводили стандартный неврологический осмотр и тщательный сбор анамнеза с целью исключения заболеваний, способных повлиять на результаты обследования. Группа была сопоставима по полу — семь (38,9%) мужчин и 11 (61,1%) женщин; возрасту — 39,10 (29,00; 49,60) лет с группой пациентов РС.

Всем пациентам РС и группе контроля было проведено исследование сыворотки крови для определения уровня типоспецифичных антител IgM и IgG к ВПГ 1-го и 2-го типов, IgM и IgG к ВВЗ, IgM и IgG к капсидному антигену VCA ВЭБ, IgG к ранним антигенам EA и ядерному антигену NA ВЭБ, IgM и IgG к ЦМВ с помощью иммуноферментного метода (ИФМ) с использованием стандартных наборов («Вектор-Бест»; Россия) в клинико-диагностической лаборатории ООО «Сеть» (г. Ярославль) в соответствии с инструкцией производителя. При определении антител к ВПГ 1-го и 2-го типов, ВВЗ, ВЭБ и IgM к ЦМВ референтными значениями считали КП более 1 ЕД/мл, при определении IgG к ЦМВ — 0,25 РЕ/мл. Положительным результатом считали превышение КП специфичных иммуноглобулинов класса G (IgG) в 3 и более раза, низкий индекс авидности IgG (менее 50%) или появление в крови специфичных иммуноглобулинов класса М (IgM) в сочетании с клиническими данными активация латентной герпетической инфекции. 

Концентрацию 15 цитокинов в сыворотке крови (IL1β, IL4, IL6, IL10, IL17А, IL17F, IL21, IL22, IL23, IL25, IL31, IL33, ИНФ-γ, ФНО-α, sCD40L) определяли с помощью мультиплексной технологии хMАР на анализаторе BioPlexTM 200 System (Bio-Rad; США) с использованием реагентов производителя в лаборатории НИИ трансляционной медицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н. И. Пирогова МЗ России. Анализировали как средний уровень каждого цитокина, так и частоту его повышения (превышение верхней границы нормы M+3 σ в группе контроля). 

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Stаtistica 10.0 (StatSoft; США), включая общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовали критерий Манна– Уитни, а при сравнении трех и более групп — критерий Краскела–Уоллиса (для независимых групп). Результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом [25-й, 75-й перцентили]. Для сравнения выборок по качественному признаку и при оценке долей встречаемости признака использовали точный критерий Фишера. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования цитокинов в общей группе пациентов с РС, при обострении и ремиссии заболевания

У пациентов с РС не отмечено различий в среднем уровне цитокинов между мужчинами и женщинами. Обнаружены значимые положительные связи между возрастом пациентов на момент осмотра и концентрацией IL6 (r = 0,36; p < 0,05), ФНО-α (r = 0,35; p < 0,05) и sCD40L (r = 0,42, p < 0,05), длительность болезни не коррелировала с уровнем ни одного цитокина.

В общей группе пациентов с РС, в сравнении с контролем, выявлено достоверное увеличение средних значений IL10 и IL33 (р < 0,001) и тенденция к повышению IL4 (р > 0,05) (табл. 3). Концентрации IL1-β, IL17F, IL22, IL25 и ФНО-α при РС были достоверно ниже (р < 0,001), чем у доноров, а снижение IL23 не достигало значимых различий (р > 0,05). Уровни IL6, IL17A, IL21, IL31, ИНФ-γ и sCD40L не различались в сравниваемых группах.

Среди всех изучаемых цитокинов наиболее часто наблюдали гиперпродукцию IL33 — у 20 (52,8%) пациентов. Значительно реже регистрировали высокие значения IL17А, IL17F, IL21, IL31 (соответственно в 2,8, 5,6, 5,6 и 13,8% случаев). Уровень других цитокинов ни в одном случае не превышал верхнюю границу нормы. Повышение IL17А, IL17F, IL21 всегда сочеталось с увеличением IL33. Гиперпродукция IL31 только у одного из пяти пациентов носила изолированный характер, а у остальных происходила совместно с IL33. Напротив, у большинства (14 (70%) из 20 пациентов) имело место изолированное увеличение концентрации IL33, а у шести пациентов вместе с другими цитокинами наиболее часто (четыре случая) с IL31. Высокие значения IL33 достоверно ассоциировались с повышением концентрации IL17А (r = 0,38; p < 0,05), IL17F (r = 0,38; p < 0,05), IL21 (r = 0,54; p < 0,001) и IL31 (r = 0,68; p < 0,001). 

При обострении РС средний уровень IL10 был достоверно выше, чем без него (p < 0,01). В эту фазу болезни отмечена также тенденция к увеличению IL4, IL23, IL31, IL33 и sCD40L (p > 0,05). Средние значения IL1β, IL6, IL17А, IL17F, IL21, IL22, IL25, ФНОα и ИНФ-γ не различалась между сравниваемыми группами.

Высокие значения IL31 регистрировали достоверно чаще при обострении (соответственно в 42,8% и 6,9% случаев; p = 0,04), преобладала и продукция IL33 (71,4 и 51,7%; p > 0,05). При этом превалировало сочетанное повышение уровня IL33 с другими цитокинами (IL17А, IL17F, IL21, IL31) (соответственно в 57,1 и 6,9% случаев; р = 0,008). Выявлены положительные ассоциации между обострением заболевания и высокими значениями IL17А (r = 0,34; p < 0,05), IL17F (r = 0,34; p < 0,05) и IL31 (r = 0,41; p < 0,01). Сочетанная гиперпродукция IL33 также достоверно коррелировала с обострением болезни (r = 0,53; p = 0,001).

Результаты исследования цитокинов у пациентов с РС в зависимости от клинических проявлений реактивации ПГВИ

У пациентов с РС с клиническими проявлениями ПГВИ средний уровень IL1β, IL23 и IL33 был достоверно выше, чем без ПГВИ (p < 0,05 и p < 0,01 соответственно, отмечена также тенденция к увеличению средних значений IL4 (p > 0,05; табл. 4). Не выявлено различий в сравниваемых группах концентраций IL6, IL10, IL17А, IL17F, IL21, IL22, IL25, IL31, ИНФ-γ, ФНОα и sCD40L.

Повышение IL31 одинаково часто происходило в обеих группах пациентов (16,7 и 11,1%; р > 0,05). Напротив, высокие значения IL33 достоверно чаще (77,7%) регистрировали при реактивации ПГВИ, чем без таковой (33,3%; p = 0,008). Клинические проявления ПГВИ несколько чаще выявлялись при сочетанном, чем при изолированном, повышении IL33 (соответственно в 83,3 и 64,3% случаев), а при его нормальной концентрации их частота составила только 25,0% (p = 0,02). Гиперпродукция IL33 достоверно ассоциировалась с реактивацией ПГВИ (r = 0,45; p = 0,006), подобной закономерности не выявлено для IL17А, IL17F, IL21 и IL31 (соответственно r = 0,17, r = 0,17, r = 0,24 и r = 0,08; p > 0,05 во всех случаях).

Изолированное или сочетанное повышение IL33 достоверно ассоциировалось с частыми (более одного раза в год) проявлениями Herpes labialis (r = 0,42 и r = 0,38, p < 0,01 в обоих случаях), а одновременное увеличение IL33 с другими цитокинами — с повторными эпизодами опоясывающего герпеса во взрослом возрасте (r = 0,55; p < 0,001).

Значения АТ к капсидному белку ВЭБ IgG достоверно положительно коррелировали только с концентрацией IL1β (r = 0,34; p < 0,05). Взаимосвязей между уровнем других цитокинов и лабораторными маркерами герпетической инфекции выявлено не было. 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Клиническое значение определения цитокинов при РС неоднозначно. В ряде работ отмечено влияние на их уровень гендерных различий: обнаружено повышение IL31 и sCD40L у мужчин с РС [26] и увеличение IL33 у женщин [18]. По данным других исследователей, концентрация IL33 в сыворотке не зависит от пола и возраста пациентов с РС [27], или его повышение наблюдается преимущественно у пожилых пациентов [28]. Отмечено увеличение IL31 и sCD40L в ранние (до 5 лет) сроки болезни [19]. Подобную закономерность выявили и другие авторы [21]. Они установили достоверные отрицательные корреляции между длительностью заболевания и значениями IL1β, IL17, IL21, IL23, IL31 и IL33. В нашем исследовании не выявлено различий в концентрациях цитокинов между мужчинами и женщинами, также не обнаружено связи с длительностью болезни, возраст пациентов положительно коррелировал только со значениями IL6, ФНОα и sCD40L.

У наших пациентов, по сравнению с контролем, наблюдалось значимое повышение концентраций IL10, IL33 и тенденция увеличения уровня IL4, при одновременном снижении IL1-β, IL17F, IL22, IL25 и ФНО-α. Эти результаты в определенной мере согласуются с данными других авторов. Так, при исследовании с помощью мультиплексного анализа 15-ти цитокинов у пациентов с РС, по сравнению с донорами, было выявлено повышение в плазме крови концентраций IL4, IL33, sCD40L и снижении ФНО-α, а в спинномозговой жидкости отмечены высокие значения IL1β, IL10, IL33 и низкий уровень sCD40L [17].

Низкий уровень провоспалительных цитокинов у пациентов с РС связывают с влиянием терапии ПИТРС [26, 29]. Большинство наших пациентов (83,3%) тоже находилось на терапии ПИТРС. Однако есть исследование, в котором все пациенты с РРС на момент обследования не получали данные препараты [17]. Кроме того, авторы другой работы зарегистрировали у 32 пациентов РРС высокую концентрацию IL33 до начала терапии ГК или ПИТРС [16]. При исследовании с помощью мультиплексного анализа концентрации 41-го цитокина у 56 наивных пациентов РС было обнаружено снижение, по сравнению со здоровыми донорами, значений  IL2, IL4, IL7, IL8, IL17A, ФНО-α и sCD40L [15].

Во время обострения РС, как правило, повышены уровни IL1β, IL2, IL6, IL17, IL23, ФНО-α, ИНФ-γ и снижены IL4 и IL10 [2, 3, 30]. Однако, по некоторым данным, в эту фазу болезни имело место снижение IL17, а уровень ФНО-α и IL10 не отличался от контроля [31], а у пациентов с РРС в период ремиссии обнаружено достоверное снижение концентрации IL10 [32]. У наших пациентов при обострении концентрация IL10 значимо выше, чем в ремиссию, наблюдались также гиперпродукция IL31 и повышение уровня IL33 вместе с уровнем других (IL17А, IL17F, IL21, IL31) цитокинов.

Одной из основных задач настоящего исследования была оценка влияния герпетической инфекции на уровень цитокинов у пациентов с РС. В доступной нам литературе не найдены исследования взаимосвязи их продукции с реактивацией герпес-вирусной инфекции.

При РС наибольшие доказательства участия в качестве этиологического фактора получены для γ-герпесвирусов, в частности ВЭБ [10, 33] и ВГЧ-6 [7], которые вызывают хроническую латентную инфекцию в В-клетках и Т-клетках [12].  Инфицирование этими вирусами пациентов подросткового возраста, имеющих генетическую предрасположенность, приводит к развитию РС [11, 12, 33]. Рецидивы РС, возможно, связаны с дефектным контролем реактивации ВЭБ со стороны CD8⁺-Т-клеток [34]. Напротив, β-герпесвирусная инфекция ЦМВ может играть защитную роль при РС и снижает риск его возникновения [35].

Однако α-герпесвирусы (ВПГ 1- и 2-го типа и ВЗВ) тоже участвуют в патогенезе РС. Вирусы данной группы способны к длительной персистенции в нейронах, периодической реактивации и литической репликации, что сопровождается развитием рецидивов с коротким репродуктивным циклом и быстрым разрушением инфицированных клеток-хозяев [36]. В исследовании «случай–контроль» ДНК ВПГ-1 в моноцитах периферической крови была обнаружена у 45,1% пациентов с РРС и только у 3,4% здоровых людей [37]. ВПГ-1 чаще обнаруживают в ткани мозга пациентов с РС, чем у здоровых [38].

У пациентов c РС отмечается преобладание герпесвирусной микст-инфекции над моноинфекцией. Наиболее распространено сочетание четырех герпесвирусов: ВПГ-1 и -2 + ВВЗ + ВЭБ + ЦМВ [39]. Во время развития клинических обострений РРС обнаружена реактивация ВПГ-1 в моноцитах периферической крови [40]. Серопозитивность по ВПГ-1 связана с повышенным риском развития РС у лиц, не имеющих аллеля DRB1*15 [41]. Эти данные подтверждают возможное участие ВПГ-1 и ВПГ-2 и ВЗВ в развитии РС и его обострений у пациентов с определенной генетической предрасположенностью.

При анализе клинических признаков группы пациентов с реактивацией ПГВИ нами был выявлен ряд характерных для нее особенностей, который заключался в более раннем возрасте дебюта заболевания и наличии частых обострений. Это согласуется с данными других исследователей [42] и результатами, опубликованными нами ранее [39]. У наших пациентов с РРС с клиническими проявлениями ПГВИ были достоверно выше средние значения IL1β, IL23 и IL33, а также преобладала продукция IL4. При этом повышение IL1β и IL23 не обнаружено в других группах пациентов. При ПГВИ значимо чаще встречались высокие значения IL33, как изолированно, так и в сочетании с IL17А, IL17F, IL21 или IL31. Высокие значения IL33 достоверно ассоциировались с клиническими проявлениями рецидивов инфекции, характерными для группы α-герпесвирусов ВПГ-1 и ПВПГ-2 и ВЗВ.

Полученные нами результаты позволяют обсуждать особое участие цитокинов в патогенезе РС, ассоциированного с вирусом герпеса, что очевидно связано с реализацией их биологических функций. Так, IL10 обладает мощным противовоспалительным эффектом, влияет на врожденный и на приобретенный иммунный ответ. Под его воздействием происходит снижение выработки IL1β, IL6, IL8, IL12, IL23 и ФНО-α, который тоже обладает нейропротективным действием [43]. Традиционно повышение концентрации IL10 при РС связывают с развитием ремиссии заболевания, на фоне подавления продукции IL17, IL23 и IL25 [2]. По нашим данным, при обострении РРС одновременно можно наблюдать увеличение IL10 и провоспалительных цитокинов.

Эти отличия могут быть обусловлены использованием нами для определения цитокинов технологии мультиплексного анализа, которая в отличие от наиболее распространенных униплексных методик, применяемых ранее, позволяет одновременно определять комплекс молекул, а не отдельные показатели. Например, при использовании техники мультиплексного анализа у пациентов РРС в стадии ремиссии обнаружено как увеличение IL10, так и повышение IL17 и IL23 [21].

В то же время избыточный синтез IL10 можно наблюдать при вирусных инфекциях, что имеет особое значение при РС. В активную фазу воспаления его выработка направлена на ограничение нежелательных для организма последствий, возникающих при чрезмерной активации механизмов врожденного иммунитета в ответ на патоген [44]. Тем не менее, в процессе эволюции вирусы разработали механизмы, использующие иммунорегуляторную функцию IL10 для уклонения от иммунной системы хозяина и способствующие их собственному выживанию. В активную фазу воспаления противовирусные CD4- и CD8-Т-клетки становятся основными источниками IL10 [45], который, однако, подавляя функцию Th1-клеток, уменьшает их способность к представлению антигена. Повышенный синтез IL10 в условиях длительного воздействия антигена может истощить резервы противовирусных Т-клеток и переключить их фенотип в преимущественно IL10-продуцирующие клетки, которые неспособны активироваться при повторном представлении антигена [44].

Кроме того, ВЭБ кодирует синтез белка, который является гомологом человеческого IL10 (вирусный гомолог IL10 (вэбIL10), а также синтез клетками обычного IL10 (кIL10) [46].  Вэб IL10, белок поздней литической фазы, кодируемый геном BCRF-1, примерно на 80% гомологичен человеческому IL10. Гомологи IL10 позволяют вирусу ускользать или ограничивать противовирусный ответ хозяина. ВэбIL10 индуцирует значительно более низкое, чем IL10, фосфорилирование STAT3 в моноцитах периферической крови и менее эффективен в подавлении воспалительных генов [47]. Он снижает экспрессию CD163 на моноцитах, что сопровождается ингибированием их поляризации в М2-клетки, обладающие противовоспалительной активностью. Нарушается также участие моноцитов в процессе клиренса апоптотических клеток, накопление которых приводит к усилению вторичного некроза. Полагают, что IL10, синтезирующийся клетками при инфекции ВЭБ, и вэбIL10 действуют одновременно и функционально скоординированным образом, помогая вирусу длительно находиться в В-лимфоцитах и нивелировать противовирусный потенциал Т-клеток [46]. ВэбIL10 может активировать В-клетки [48]. Оба этих цитокина присутствуют в ЦНС и поддерживают резервуар латентно ВЭБ-инфицированных В-клеток, которые локально стимулируют патогенные Т-клетки. Учитывая наличие у всех пациентов РРС серологических маркеров перенесенной инфекции ВЭБ, возможно, что эти механизмы вовлечены в продукцию IL10 и в нашем случае.

Известно, что IL17 является одним из ключевых цитокинов в патогенезе РС [2]. Он также играет важную роль в иммунном ответе на вирусные инфекции [12]. Стимуляция ВПГ Th17-клеток сопровождается выработкой ими IL17 [49]. Установлено, что экспрессия KIR2DL2рецептора на NK-клетках у пациентов с РС делает их более восприимчивыми к инфекции ВПГ-1 [50]. При этом основное количество IL17A секретируется именно KIR2DL2+NK-клетками [51]. В нашем исследовании при РРС концентрации IL17А и IL17F не были повышены по сравнению с контролем, не различались между собой в фазу обострения или ремиссии заболевания, в группах пациентов с реактивацией ПГВИ и без таковой.

IL23 также участвует в патогенезе РС. Пациенты с РРС имеют значительно более высокие значения IL23 в сыворотке крови по сравнению с донорами [52]. Кроме того, IL23 играет важную роль при инфекции ВПГ. Он индуцирует пролиферацию Т-клеток памяти [53] и может быть обнаружен уже на 3-й день заражения в нервных ганглиях мышей, инфицированных ВПГ [54]. IL23 стимулирует выработку IL17 NK-клетками, способствует привлечению нейтрофилов в очаг воспаления и локальному синтезу провоспалительных цитокинов IL1β, IL6 и ФНО-α Нами зарегистрировано достоверное, в отличие от IL17, повышение IL23 в группе пациентов с реактивацией герпетической инфекции.

IL31 является членом семейства IL6, его синтез осуществляют преимущественно Th2-клетки и он зависит от IL4 [55, 56]. Действие IL31 опосредуется через гетеродимерный рецептор, состоящий из цепи IL31RA и β-цепи рецептора онкостатина М, и направлено на тучные клетки, которые присутствуют в периферических тканях, иннервируемых чувствительными нервными волокнами малого калибра, и в эндоневральном отделе периферических нервов, а также в мозговых оболочках и кровеносных сосудах головного мозга [57]. Экспрессия IL31RA выявлена на различных субпопуляциях лейкоцитов, эпителиальных, стромальных клетках, спинно-мозговых ганглиях, кератиноцитах и фибробластах [20, 58]. IL31 и его рецептор принимают важное участие в регуляции нейровоспаления. IL31 способствует ремоделированию тканей и воспалению за счет индукции синтеза IL6, хемокинов и матриксных металлопротеиназ [59, 60]. У пациентов с РРС выявлены высокие, по сравнению с донорами, значения IL31 в сыворотке крови, которые снижались во время ремиссии заболевания [19, 52]. У наших пациентов гиперпродукция IL31 тоже происходила в фазу обострения заболевания, но не была связана с реактивацией ПГВИ.

IL33, член семейства IL1, которое включает IL1β и IL18, играет важную роль в иммунопатогенезе различных заболеваний, включая РС [55]. У пациентов с РРС, по сравнению с контролем, обнаружено достоверное увеличение уровня IL33 в сыворотке крови [16, 18] и спинномозговой жидкости [17, 61]. Действие IL33 реализуется через связывание со своим рецептором — ST2, который представлен растворимой (рST2) и мембранносвязанной (ST2) формами. Первая является рецепторомприманкой, изолирует свободный IL33, что приводит к локальному ограничению активности для внеклеточного IL33 и позволяет избежать нежелательных последствий воспалительных реакций [62]. IL33 оказывает влияние на разные типы клеток, имеющих на своей поверхности ST2-рецепторы, такие как эозинофилы и базофилы, тучные клетки, Th1- и Th2-лимфоциты, цитотоксические Т-лимфоциты, естественные киллеры (NK) и врожденные лимфоидные клетки типа 2 (ВЛК типа 2) [63]. Мембранносвязанная форма ST2 активирует сигнальный путь MyD88/ NF-κB для усиления функций тучных клеток, Th2-клеток, регуляторных Т-клеток и ВЛК типа 2 [62].

Полагают, что важную роль в развитии РС играет полиморфизм генов IL33 и его рецептора ST2. По некоторым данным, однонуклеотидный полиморфизм rs1929992 в гене IL33 связан с различными вариантами течения РС [64]. Другие авторы не выявили существенных различий, по сравнению с контролем, в частоте обнаружения трех однонуклеотидных полиморфизмов: IL4 (rs2070874), IL17A (rs2275913) и IL33 (rs7044343) у пациентов с РС [65]. Показано, что на фоне повышения уровня IL33 только генетический полиморфизм rs10204137 гена его рецептора ассоциирован с РС [66].

Несмотря на то что IL33 — один из наиболее изученных цитокинов при патологии нервной системы и РС, его участие в нейровоспалении и нейродегенерации неоднозначно. Экспрессию IL33 наблюдают не только на астроцитах и олигодендроцитах, но и на нейронах и клетках микроглии [67]. Его рецептор ST2 обнаруживают преимущественно на нейронах и олигодендроцитах. Наличие перекрестной экспрессии IL33 и ST2 на различных клетках ЦНС свидетельствует о сложных аутокринных и паракринных механизмах сигнализации IL33/ST2 в ЦНС в дополнение к его иммуномодулирующей роли при воспалении [67].

IL33 усиливает проникновение в ЦНС иммунных клеток из кровотока и активацию резидентных иммунных клеток [55]. IL33 оказывает прямое воздействие на олигодендроциты и активирует астроциты [67–69].

При РС периферические лейкоциты и астроциты являются важным источником повышенной продукции IL33, который активирует клетки микроглии [16, 70]. Высвобождаемый глиальными клетками IL33 активирует соседние клетки для производства воспалительных молекул, оказывающих неблагоприятное действие на нейроны [71, 72]. Фактор созревания глии также вызывает повышенную продукцию астроцитами IL33, который в свою очередь действует синергично с ним и способствует синтезу этими клетками ФНО-α [73]. Инкубация смешанных астроцитов и нейронов или только нейронов с IL33 приводит к уменьшению их количества, потере нейронами своих отростков, разрушению их сети и формированию невритоподобных внешних изменений клеток [73].

IL33 также принимает участие в повреждении и нарушении репарации миелина. В экспериментальных исследованиях, проводимых на кокультурах миелинизирующих клеток ЦНС крысы, показано, что IL33 не влияя на плотность аксонов, способен значительно подавлять их миелинизацию [67]. При РС уровни мРНК IL33 и самого IL33 резко повышены в очагах активных поражений [16]. В них также обнаружена усиленная локальная экспрессия ST2 в аксонах и в поврежденном миелине, в отличие от его диффузного распределения в нормальной коре головного мозга человека [67].

При этом обсуждаются и нейропротекторные эффекты IL33. Показано, что  плазменные уровни IL33 повышены у пациентов с легкой формой РРС, а его концентрация в плазме крови отрицательно коррелирует с количеством Т2-гиперинтенсивных поражений на МРТ [21]. Увеличение IL17A и IL33 в сыворотке крови пациентов с РС не связано с EDSS [65]. Известно, что макрофаги активно участвуют в воспалении при РС [74]. IL33 модулирует поляризацию микроглии в M2-фенотип и способствует нейропротекции [75].

Введение рекомбинантного IL33 мышам с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ) после начала заболевания переключает иммунный ответ с провоспалительного, опосредованного Th1 и Th17клетками, на противовоспалительный Th2-зависимый. На фоне уменьшения выработки М2-поляризованными макрофагами IL17 и ИНФ-γ увеличивается продукция ими IL5 и IL13 [76]. При ЭАЭ высокие уровни циркулирующего IL33 рассматривают в качестве механизма самоограничения хронического воспаления. Недостаточные эффекты низкой концентрации IL33 могут быть компенсированы выработкой других цитокинов, таких как IL1. По-видимому, эти механизмы имеют универсальное значение и также важны для предотвращения развития генерализованного энцефалита на фоне герпетической инфекции, что подтверждается увеличением уровня IL1β и IL33 в группе пациентов РС с реактивацией ПГВИ.

Определенное значение имеют и гендерные различия. В экспериментах на мышах линии SJL (модели ЭАЭ) показано, что у самцов концентрация тестостерона увеличивается при иммунизации пептидом миелина (PLP139-151) и стимулирует выработку IL33 тучными клетками, несущими на своей поверхности андрогеновый рецептор [77].  IL33 активирует IL13-продуцирующие ВЛК типа 2, которые накапливаются в лимфатических узлах, мозговых оболочках и ЦНС и способствуют протективному Th2-зависимому ответу. У самцов IL33-чувствительные ST2+-тучные клетки и базофилы за счет выработки IL4 и IL13 усиливают поляризацию Th2-клеток.

В условиях низкого тестостерона тучные клетки самок экспрессируют вместо IL33 молекулы IL1β и ФНО-α, а при его недостатке не происходит активация ВЛК типа 2. Известно, что ВЛК типа 2 способствуют восстановлению тканей, отличаются высокой экспрессией на своей мембране рецептора для IL33 и способностью вырабатывать IL4, IL5, IL9, IL13 [63, 78]. Без подавляющего влияния IL33 у самок преобладает энцефалитогенный Th17-зависмый иммунный ответ, который может быть ингибирован введением экзогенного IL33.

IL33 через активацию ВЛК-типа 2 контролирует накопление регуляторных Т-клеток в очагах воспаления, их эффекторные функции и поляризацию макрофагов [79]. IL33 стимулирует также регуляторные В-клетки, которые играют важную роль в поддержании периферической толерантности и подавлении воспалительных аутоиммунных реакций, а введение IL33 мышам увеличивает количество IL10-продуцирующих В-клеток [80, 81].   

IL33 участвует во врожденном иммунном ответе на повреждение тканей, возникающем при инфекциях. При этом механизмы появления в циркуляции и функциональные свойства IL33 отличны от тех, которые характерны для IL1β и IL18 [79]. IL33 в основном высвобождается из клеток в виде биологически активной полноразмерной молекулы в процессе некроза или некроптоза, но не апоптоза клеток [82, 83]. Для формирования биологически активной формы IL33, в отличии от IL1β и IL18, не требуется предварительная обработка каспазой-1 и участия инфламмасомы. Напротив, его молекула может подвергаться расщеплению каспазами-3 и -7, связанными с апоптозом, что приводит к сокращению периода полураспада IL33 и снижению его биологической активности [84]. Инактивация IL33 через каспазы подавляет, не усиливает иммунный ответ. IL33 содержится также в ядре клеток в виде хроматин-ассоциированного фактора, который быстро высвобождается при их некрозе [85, 86]. Взаимодействуя непосредственно с NF-κB, ядерный IL33 изолирует его и предотвращает передачу сигнала, действуя как ядерный супрессор транскрипции, чем снижает провоспалительную активность клеток [87].

Другие ферменты, такие как нейтрофильные сериновые протеазы, катепсин G и эластаза, способны расщеплять IL33 и, в отличие от каспаз, в 10–30 раз увеличивают его биологическую активность, по сравнению с полноразмерной формой [88, 89]. Специфичные для тучных клеток химаза и триптаза генерируют форму IL33 с повышенной способностью активировать ВЛК типа 2 [90], которые в отличие от ВКЛ типа 1 и типа 3 не присутствуют в активных очагах поражения при РС [12], но участвуют в ВПГ-IL2-индуцированной демиелинизации ЦНС на мышиной модели РС [91].

При РС обнаружены явления некроптоза [92]. Так, в образцах тканей из корковых поражений на фоне дефекта активации каспазы-8 установлены характерные для него медиаторы  RIPK1, RIPK3. MLKL. Механизмы некроптоза, индуцированные ФНО-a, приводят к дегенерации олигодендроцитов, а ингибирование рецептора протеинкиназы-1 (RIPK1) предотвращает их гибель [92].

Некроз и некроптоз клеток характерны и для инфекции, вызванной ВПГ [93]. Во время нее различные молекулы, включая геном вирусной ДНК, виды РНК, полученные при транскрипции, некодирующие клеточные РНК, активируют трансмембранные (tollподобные) и цитозольные рецепторы распознавания образов, связанные с патогенами, для передачи сигналов через отдельные адаптерные белки для инициации врожденного противовирусного иммунитета. Это приводит к выработке цитокинов, некроптозу клеток через механизмы, аналогичные для РС, связанные с протеинкиназой-3 ее рецептором (RIPK3), активацией пути NF-κB [94].

Запрограммированная некротическая гибель клеток ограничивает репликацию вируса и распространение вирионов [95]. При этом в циркуляции появляется IL33, который выступает в качестве «тревожного» сигнала, инициирует биологические эффекты, направленные на устранение угрозы для организма, включая увеличение продукции провоспалительных цитокинов [55]. Активация NF-kB через toll-подобные рецепторные сигнальные пути приводит к секреции ФНО-α и IL1-β, которые опосредуют транскрипцию IL33 [96, 97]. Сам IL33 также индуцирует экспрессию мРНК в микроглии ФНО-α и IL1-β.

Во многих случаях совместное повышение IL33 и IL31 коррелирует с выраженностью признаков воспаления [55]. Полагают, что IL33, секретируемый вследствие повреждения клеток, способствует IL4-зависимому высвобождению IL31 Th-2 клетками [98]. Эти данные, возможно, объясняют выявленную нами ассоциацию IL33 и IL31 при обострении РС, а также совместную продукцию IL33 и IL1-β, IL4, IL23 в группе пациентов с реактивацией герпетической инфекции.

Существует тонкий баланс между прямым повреждением (некрозом) клеток при инфекции ВПГ и иммунным ответом на нее [99]. При рецидивах инфекции избыточная продукция цитокинов может приводить не только к ограничению распространения вируса, но и активировать механизмы некроптоза клеток с нарушением функции органов, что особенно важно для ЦНС, где условия для регенерации тканей снижены [12, 99, 100].

Отражением этих процессов, по-видимому, является обнаруженное нами увеличение концентрации IL33 преимущественно при реактивации ПГВИ. Возможно, что α-герпесвирусы, ВПГ-1 и ВПГ-2, а также ВЗВ в большинстве случаев следует рассматривать не в качестве этиологической причины РС, а, скорее, как фактор, способствующий чрезмерной активации иммунной системы у генетически предрасположенных лиц, что играет решающую роль в прогрессировании демиелинизирующих заболеваний. Такие процессы, как молекулярная мимикрия, регуляция эндогенных ретровирусов или нарушение ремиелинизации, могут быть опосредованы данным патогеном [101], а частые рецидивы этой инфекции создают условия для прогрессирования нейродегенерации и переходу течения РРС в ВПРС.

Наши данные согласуются с мнением других исследователей о важной роли оси IL31/IL33/ST2 в развитии РС, возможно, через ее участие в процессах демиелинизации в ЦНС, в отличие от защитной противовоспалительной функции вводимого рекомбинантного IL33. Кроме того, они расширяют наше представление об участии герпетических инфекций в иммуновоспалительных реакциях и процессах демиелинизации или нарушения ремиелинизации, характерных для РС. Дальнейшее изучение особенностей функционирования систем IL10, IL31 и IL33/ST2, являющихся важным связующим звеном между иммунными клетками, нервной системой и эпителиальными тканями, в условиях вирусной нагрузки герпесвирусами будет иметь решающее значение для развития новых подходов к терапии РС [102].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящей работы свидетельствуют о важном участии IL10, IL31 и IL33 в патогенезе РС, но их роль неоднозначна. Мы полагаем, что повышение IL10 при РС и при обострении в большей мере обусловлено реализацией его биологической роли в воспалении при инфекции ВЭБ. Напротив, совместное увеличение IL1β, IL23 и особенно IL33 при реактивации ПГВИ, по-видимому, обусловлено ВПГ и ВЗВ.

Наше исследование носило поисковый характер, без проведения формальной оценки размера выборки и поправки на множественное сравнение, в связи с чем полученные результаты/тенденции должны быть подтверждены в будущих работах. Тем не менее, в нем отражены данные реальной клинической практики ведения пациентов РРС, которые позволяют подойти к более полной расшифровке механизмов, участвующих в обострении РС и прогрессировании заболевания.