Привычный выкидыш (ПВ) — это гетерогенное состояние, определяемое как две и более клинические потери беременности в сроках до 22 недель гестации [1] и имеющее место у 2–5% беременных женщин [2]. После двух предыдущих выкидышей риск прерывания беременности возрастает более чем в два раза и достигает 36–38% [3].

Среди этиологических факторов ПВ выделяют такие, как хромосомные аномалии (2–6%), анатомические изменения матки (10–15%), инфекционно-воспалительные (2–6%), эндокринные (17–20%), аутоиммунные (20%) заболевания [4], тромбофилические состояния (10%) [5]. Тем не менее, причины около 50% случаев ПВ являются необъяснимыми (идиопатическими) [6]. Идиопатический привычный выкидыш (ИПВ) остается актуальной проблемой репродуктивной медицины во всем мире [7].

В свете современных представлений одним из центральных звеньев патогенеза ИПВ является абберантное продуцирование провоспалительных цитокинов, сопровождающееся дисрегуляцией иммунного ответа [8, 9]. В данном аспекте особый интерес представляют фактор некроза опухоли альфа (TNFα) [10] и интерлейкин IL17 [11], обладающие эмбриотоксической и антитрофобластной активностью [12]. Есть данные, что значительное повышение уровня TNFα в периферической крови характерно для женщин с ИПВ (на 40–70% по сравнению с контролем) [13], в том числе связано с инициированием апоптоза [14] и ингибированием инвазии трофобласта [15], активацией тромбокиназы [16] снижением экспрессии нуклеотид-связывающего домена олигомеризации [17] и усилением цитотоксичности клеток dNK [18], что, в свою очередь, приводит к недостаточному ремоделированию спиральной артерии [16], тромбозам, инфарктам трофобласта и его отслойки [16], нарушению функций децидуальных клеток [17], иммунологическому отторжению плода [18], и, как следствие, к выкидышу. Большинство исследователей считает, что уровень IL17 в сыворотке крови у женщин с ИПВ повышен [11] и служит независимым прогностическим фактором ИПВ [19]. Повышенный уровень IL17 обратно коррелирует с содержанием T_reg-клеток в периферической крови и децидуальной оболочке [20], снижение уровня которых потенцирует процессы отторжения эмбриона [21]; независимо связан с активацией экспрессии транскрипционного ядерного фактора NF-kB, сокращением уровня экспрессии рецепторов прогестерона и ослаблением его функциональной активности, что, приводит к децидуадисплазии, недостаточной нутриетивной поддержке эмбриона, стимуляции сократимости миометрия и, в конечном счете, к выкидышу [22].

Вместе с тем иммунная система тесно сопряжена с нейроэндокринной. В литературе активно обсуждается вовлеченность дисрегуляции эпифизарно–гипофизарно– надпочечниковой оси в повышении риска ИПВ, и при этом особое значение имеют изменения секреции мелатонина и кортизола [23, 24]. Оценка гормонального профиля крови у женщин с ИПВ позволила обнаружить повышенные уровни кортизола и сниженные уровни мелатонина [25, 24]. Кроме того, изменения уровня кортизола были связаны с важными этиологическими факторами ИПВ, такими как снижение фибринолитической активности сосудистой стенки, нарушение процессов полноценной инвазии и функций трофобласта [26, 27], индукция апоптоза [28], ингибирование секреции прогестрерона [29]. В свою очередь снижение уровня мелатонина в крови ассоциировано с иммунологическим отторжением трофобласта (за счет ингибирования секреции прогестерона) и стимуляцией сократимости миометрия (путем усиления синтеза простагландинов) [30].

Современные исследования свидетельствуют о роли кишечной микробиоты в патофизиологии ИПВ, что объясняется ее ключевой ролью в формировании и модуляции нейро-иммунно-эндокринных реакций. Так, представлены убедительные данные о качественных изменениях микробного ландшафта у женщин с ИПВ [31]. В целом, у женщин с ИПВ зафиксирована тенденция к уменьшению видового разнообразия бактерий, истощению полезных комменсалов и обогащению патобионтами [32–33], однако информация о родовом составе фрагментарна и противоречива. Кроме того, в литературе имеются лишь единичные сообщения о сопряженности между микробиотой кишечника и воспалительными биохимическими маркерами у женщин с ИПВ. Отсутствуют работы, оценивающие взаимосвязь представителей микробиоты кишечника с концентрацией кортизола и мелатонина при ИПВ.

Таким образом, проблема взаимосвязи микробиоты кишечника и ИПВ остается актуальной. Целью нашего исследования было изучить изменения таксономического состава микробиоты кишечника и оценить на уровне родов его взаимосвязь с показателями в сыворотке крови кортизола, мелатонина, TNFα и IL17 у женщин с ИПВ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на базе гинекологического отделения Структурного подразделения Перинатального центра ГБУЗ РКБ им. Н. А. Семашко (г. Симферополь). В проспективное сравнительное одномоментное исследование были включены 55 женщин с первичным ИПВ (медиана возраста — 31,6 [26,9; 33,9] года), которые составили основную группу (ОГ), и 60 женщин с физиологически протекающей беременностью (ФПБ) (медиана возраста — 30,3 [25,9; 33,2] года), обратившихся по поводу проведения аборта (контрольная группа, КГ).

Критерии включения в ОГ: подтвержденный диагноз ИПВ; возраст женщин — до 35 лет; нормальный кариотип пары.

Критерии невключения в ОГ: дефицит или избыточная масса тела; наличие генетических и анатомических причин ПВ; хронические инфекционные, воспалительные, эндокринные, аутоиммунные, тромбофилические, онкологические заболевания; синдром раздраженного кишечника; хронические заболевания пищеварительной и гепатобилиарной системы; бактериальные, вирусные и грибковые инфекционные заболевания; психическая патология; злоупотребление табакокурением; изменения стула (диарея/запоры) и прием средств, влияющих на стул в предшествующие 30 дней до включения в исследование; вакцинация за 60 дней до включения в исследование; прием антибактериальных, пробиотических, пребиотических, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих средств в предшествующие 90 дней до включения в исследование.

Критерии включения в КГ: возраст — до 35 лет; физиологически протекающая беременность; неосложненный гинекологический и акушерский анамнез; наличие в анамнезе как минимум одной успешной беременности; отсутствие хронической экстрагенитальной патологии и аллергических реакций в анамнезе; отсутствие психической патологии в анамнезе; частота респираторных инфекций — не более трех раз в год; отсутствие инфекционных и острых заболеваний, изменений стула (диарея/запоры); неприем средств, влияющих на стул, за 60 дней до включения в исследование; неприем антибактериальных, пробиотических, пребиотических, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих средств в предшествующие 90 дней до включения в исследование. 

Критерии невключения в КГ: прегравидарный дефицит или избыточная масса тела; беременность, наступившая при помощи вспомогательных репродуктивных технологий; высокий риск выкидыша; повышение температуры тела более чем 36,9 °С.

Диагноз ПВ устанавливали по кодификационным критериям Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE) [34].

У всех женщин с ИПР и КГ был проведен анализ таксономического состава микробиоты кишечника.

Образцы кала брали в день госпитализации, в утренние часы (8.00–11.00), после чего замораживали и хранили в пластиковых емкостях при температуре –80 °C до момента выполнения метагеномного анализа. Для выделения тотальной ДНК использовали метод фенольной экстракции. Библиотеки ДНК фрагментов генов 16S рРНК готовили по стандартному протоколу, рекомендованному производителем секвенатора MiSeq SOLiD5500 Wildfire (AppliedBiosystems; США) с использованием праймеров на вариабельные регионы V3 и V4 гена 16S рРНК [35]. Фильтрацию качества прочтений и их таксономическую классификикацию проводили с использованием программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 [36]. Идентификацию таксономической принадлежности прочтений осуществляли в два этапа: на первом этапе подбирали референсный набор операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основе сравнения полученных нами прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 [37]; на втором этапе идентифицировали таксономическую принадлежность данных ОТЕ с помощью алгоритма RDP на основании специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb [38].

Оценку качественного и количественного состава микробиоты кишечника осуществляли на основе идентификации видов, родов и фил микроорганизмов. При этом α-разнообразие сообщества оценивали с помощью вычисления индекса Chao1, показатель числа обнаруженных таксонов (Sobs) и показатель, отражающий реальное количество таксонов (ACE), — с помощью программы Mothur v.1.22.0 (https://www.mothur.org).

Концентрацию кортизола, мелатонина, TNFα и IL17 в сыворотке крови определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тестсистем фирм «Вектор-Бест» (Россия) и «Immuno Biological Laboratories» (Германия). Забор крови осуществляли пункцией кубитальной вены утром (7.00–10.00), натощак в состоянии покоя (как минимум 15 мин).

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft.Inc.; США). Количественные показатели представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (при нормальном распределении признака) и в виде медианы (Ме) и 25-го и 75-го процентилей (при распределении признака, отличном от нормального). Качественные признаки описывали с помощью абсолютного количества значений и процентных долей. Сравнение между группами по количественным показателям осуществляли c использованием параметрического t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна–Уитни, по качественным — с использованием критерия χ² (хи-квадрат). Направление и тесноту взаимосвязи между показателями оценивали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми различия считали при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика женщин с ИПР и КГ представлена в табл. 1. Группы были сопоставимы по возрасту (р = 0,122) и индексу массы тела (р = 0,087).

Анализ таксономического состава микробиоты кишечника позволил выявить в группе женщин с ИПВ в сравнении с женщинами КГ статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1, р = 0,014) и тенденцию к снижению индексов ACE и Sobs (р = 0,053 и р = 0,051 соответственно) (рис. 1).

Изменения родового состава кишечной микробиоты в группе женщин с ИПВ в сравнении с группой женщин КГ характеризовались статистически значимым cнижением представленности Bifidobacterium (р < 0,001), Lachnospira (р = 0,032), Roseburia (р = 0,003), Coprococcus (р = 0,012) и повышением представленности Ruminococcus (р < 0,001) и Klebsiella (р = 0,002) (рис. 2).

У женщин с ИПВ в сравнении с женщинами КГ плазменные значения кортизола, TNFα и IL17 были статистически значимо выше, а уровень мелатонина статистически значимо ниже (табл. 2).

Установлены статистически значимые корреляционные связи значений кортизола с представленностью бактерий Lachnospira (r = –0,51, p = 0,002). Так же удалось установить связь между значением мелатонина и представленностью бактерий Coprococcus (r = –0,49, p = 0,012). Выявлены взаимосвязи концентрации TNFα и IL17 с индексом Chao1 (r = –0,51, p = 0,002; r = –0,54, p = 0,001 соответственно). Концентрация TNFα положительно коррелировала с представленностью бактерий Ruminococcus (r = 0,51; p = 0,002), а концентрация IL17 имела обратную корреляционную связь с представленностью бактерий Bifidobacterium (r = –0,52, p = 0,001).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данном исследовании уточнены изменения таксономического состава микробиоты кишечника и изучена на уровне родов их связь с плазменными концентрациями кортизола, мелатонина, TNFα и IL17 в группе женщин с ИПВ.

В ряде ранее выполненных работ сообщается об изменении состава микробиоты кишечника у женщин с ИПВ [31–33]. Результаты данного исследования также показали, что состав микробиоты кишечника у женщин с ИПВ значительно отличается от такового у женщин с физиологически протекающей беременностью.

По нашим данным, у женщин с ИПВ в сравнении с женщинами с физиологически протекающей беременностью наблюдается более низкое бактериальное α-разнообразие, что подтверждалось статистически более низким индексом Chao1 и согласуется с результатами ранее выполненных исследований [33, 39]. Кроме того, у женщин с ИПВ дисбиотические изменения кишечника характеризовались снижением представленности бактерий с иммуномодулирующим потенциалом, а именно представителей родов Bifidobacterium, Lachnospira, Roseburia, Coprococcus и Prevotella, являющихся, как известно, продуцентами короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) бутирата и пропионата. Понижение содержания последних сопровождается активацией гистондеацетилазы и ингибированием G-белковых рецепторов GPR41, GPR43 и GPR109А, и, как следствие — развитием хронического воспаления [40]. В то же время нами обнаружена повышенная представленность потенциальных патобионтов, а именно бактерий рода Ruminococcus и Klebsiella. Представленные нами результаты отчасти согласуются с данными других авторов. Так, для женщин с ИПВ было характерно снижение представленности бактерий Prevotella, Roseburia, Lachnospirа и повышение представленности бактерий Ruminococcus, Klebsiella [32]. В других работах показано снижение численности Lachnospira, Roseburia, Prevotella [33] и снижение представленности Prevotella [31]. Противоречивость данных во многом может определяться тем фактом, что работы выполняли в разных географических областях, а также различиями в методологии включения обследованных в исследование. Мы не включали в настоящее исследование женщин с отягощенным гинекологическим анамнезом и коморбидной экстрагенитальной патологией, а также принимавших пробиотики, пребиотики, симбиотические средства в предшествующие три месяца до проведения исследования, чтобы исключить их влияние на результаты исследования. Также важно отметить малый размер выборки в ранее описанных исследованиях [32, 33].

Как уже указывалось, у женщин с ИПВ обнаруживаются в крови высокие концентрации кортизола, TNFα, IL17 и снижение концентрации мелатонина, роль которых в патогенезе ИПВ подтверждена [13, 11, 23, 24]. Полученные нами результаты сопоставимы с данными литературы: у женщин с ИПВ в сравнении с женщинами с физиологически протекающей беременностью зафиксированы статистически значимые различия по плазменным концентрациям кортизола, мелатонина, TNFα и IL17. Принципиально, что некоторые представители микробиоты кишечника у женщин с ИПВ сопряжены с плазменными концентрациями исследованных биомаркеров; этот факт может указывать на существование связи между составом, численностью микробиоты кишечника и ИПВ. Отрицательный характер корреляции с плазменной концентрацией кортизола был показан для рода Lachnospira, что свидетельствует о возможном активном участии этих бактерий в нарушении регуляции активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (ГГНО) при ИПВ. Мы не обнаружили работ, в которых бы изучали связь между микробиотой кишечника и кортизолом у женщин с ИПВ. Вместе с тем показано, что у больных с синдромом Кушинга Lachnospira отрицательно коррелировала с экспрессией кортизола [41]. Подобная закономерность представлена в другом исследовании: сокращение представленности бактерий Lachnospira было тесно ассоциировано с более высокой концентрации кортизола у здоровых детей в возрасте 8–16 лет [42]. В литературе нами была найдена вероятная интерпретация этой корреляции. Известно, что Lachnospira является одной из основных бактерий, продуцирующих бутират. Поскольку КЦЖК способны пересекать гематоэнцефалический барьер (через циркумвентрикулярные структуры), можно обсуждать их участие в модуляции активности ГГНО путем непосредственного влияния на секреторный тонус в гипофизарных нейронах медиального паравентрулярного ядра [43]. Указания на то, что КЦЖК обладают способностью воздействовать на экспрессию, кортизола были получены в экспериментальных и клинических исследованиях. Так, показано, что применение КЦЖК (67,5 мМ ацетата + 25 мМ пропионата + 25 мМ бутирата) на протяжении семи дней у мышей сопровождалось ингибированием потенцированной острым стрессом секреции кортикостерона [44]. В свою очередь семидневное введение физиологических доз КЦЖК непосредственно в толстую кишку обеспечивало увеличение их концентрации в системном кровотоке и ослабление интенсивности реакции кортизола на острый психо-социальный стресс у здоровых лиц [45].

Обнаружена корреляция показателя мелатонина с представленностью бактерий Coprococcus, что может быть опосредовано блокировкой сигналов в системе р-CREB-связывающего белка — арилалкиламин-Nацетилтрансферазы за счет ингибирования триптофана [46], являющегося предшественником серотонина, из которого в последующем синтезируется мелатонин. В литературе описаны схожие ассоциации у больных ювенильным идиопатическим артритом [47] и сахарным диабетом 2-го типа [48], что подтверждалось прямыми тесными корреляциями представленности Coprococcus с уровнями метаболитов триптофана [48] и плазменного мелатонина [47, 48].

Обсуждая полученные нами результаты в отношении связи микробиоты кишечника с показателями в крови TNFα и IL17 в группе женщин с ИПВ, важно отметить, что только некоторые из них согласуются с данными литературы. Ранее уже была оценена взаимосвязь между микробиотой кишечника и провоспалительными цитокинами [33]. Было выявлено, что у пациенток с ИПВ уменьшение бактериального разнообразия ассоциировалось с повышением в крови концентрации TNFα и IL17 [33]. Полученные нами данные также не противоречат результатам приведенных исследований. Этот факт может указывать на то, что у пациенток с ИПВ провоспалительные эффекты микробиома, вероятно, вызваны целостным дисбиозом кишечника. Кроме того, в своем исследовании мы обнаружили прямую связь между уровнем в крови TNFα и представленностью Ruminococcus. Как известно, бактерии Ruminococcus синтезируют воспалительный липополисахарид глюкорамнан, который посредством активации TLR4-опосредованных реакций индуцирует выработку дендритными клетками костного мозга провоспалительных цитокинов, включая TNFα [49]. К настоящему времени накоплен достаточный пул исследований, указывающих на то, что Bifidobacterium способны влиять на выраженность воспалительных реакций [50–54]. Так, снижение численности Bifidobacterium сопряжено с развитием преэклампсии [51], сокращением сроков жизни аллотрансплантата сердца [50] повышенным риском развития аутоиммунных состояний [52] и воспалительных заболеваний кишечника [53]. Как известно, снижение представленности бактерий рода Bifidobacterium сопряжено с активацией ацетилирования гистонов и подавлением метилирования ДНК, что, в свою очередь, приводит к усилению активации транскрипции, опосредованной NF-kB и интенсификации экспрессии IL17 [50]. Отрицательная корреляция между концентрацией в крови IL17 и численностью Bifidobacterium, обнаруженная в нашем исследовании, является дополнительным доказательством этой ассоциации. Вместе с тем, полученные нами результаты не согласуются с данными исследования [33], в котором была установлена отрицательная связь между концентрацией в крови IL17 и представленностью Prevotella у женщин с ИПВ. Несогласованность полученных нами результатов с данными сопоставляемой работы, как указывалось ранее, скорее всего, является следствием различий в дизайне исследования, а именно, включением женщин с ИПВ без гинекологической патологии и метаболических нарушений. В то время как в исследовании [33] наличие синдрома поликистозных яичников и инсулинорезистентности у участниц не являлись факторами исключения. Этот факт мог повлиять на отличия ассоциаций TNFα и IL17 с представителями микробиоты кишечника у женщин с ИПВ от имеющихся в литературе. Тем не менее, ранее опубликованные данные [33] и результаты настоящего исследования позволяют предположить значимую роль микробиоты кишечника в иммуногенезе ИПВ. По-видимому, причинно-следственные связи между микробиотой кишечника и уровнем провоспалительных цитокинов в крови при ИПВ требуют более детальной проработки и продолжения исследований в этом направлении.

ВЫВОДЫ

У женщин с ИПВ установлены выраженные нарушения представленности и таксономического состава микробиоты кишечника. Обнаруженные статистически значимые корреляционные связи между некоторыми представителями микробиоты и гормональными и воспалительными маркерами подтверждают постулат о сопряженности представленности и состава микробиоты кишечника с ИПВ. Коррекция микробиоты кишечника может иметь потенциальную профилактическую и терапевтическую значимость для женщин с ИПВ.