Опухоли центральной нервной системы относят к числу наиболее требовательных к прецизионности хирургического вмешательства. Объем и полнота резекции являются одними из ключевых параметров, влияющих на исход комплексного лечения и общую долговременную выживаемость [1–3]. Таким образом, точность интраоперационного определения границ опухоли — важнейший параметр, контролируемый в ходе хирургического вмешательства, а хирург вынужден балансировать между требованием удаления максимального объема патологической ткани и сохранением прилежащих незатронутых функциональных областей головного мозга. Особенно сложны с этой точки зрения глиальные опухоли, характеризующиеся диффузным распространением опухолевых клеток. Интраоперационная компьютерная и магнитно-резонансная томографии и экспрессгистологический анализ широко применяют в качестве методов, облегчающих принятие решений оперирующим хирургом, однако существенные затраты времени не позволяют применять их для непрерывного мониторинга в зоне резекции [4, 5]. Удобны и эффективны ультразвуковой контроль и флуоресцентное контрастирование, однако для ряда опухолей точность и специфичность этих методов уменьшаются до 50% [6, 7]. Методы молекулярного профилирования, основанные на массспектрометрическом детектировании, в настоящее время развиваются в быстрый и универсальный инструмент для сопровождения нейрохирургических операций [4, 8]. Вне зависимости от конкретной реализации метода пробоотбора и ионизации, масс-спектрометрические методы опираются на анализ метаболических особенностей опухолевых тканей, затрагивающие как изменение липидного состава пролиферирующих клеток, так и набор и концентрацию специфических метаболитов, таких как N-ацетиласпартат, 2-гидроксиглутарат и глютаминовая кислота [9–11].

Масс-спектрометрические профили, собираемые в ходе разработки подобных методов, позволяют создавать классификационные и регрессионные модели, различающие опухолевые и неопухолевые ткани с высокой чувствительностью и специфичностью [12, 13]. Следует отметить, что подобные модели в большинстве своем опираются не на единичный маркер, а на комбинацию многочисленных пиков в спектрах, отражающих процесс метаболического перепрограммирования, происходящий в процессе малигнизации ткани [14]. Раковым клеткам для пролиферации требуется большой объем биомассы, однако гиповаскуляризация опухоли приводит к недостатку питательных веществ. Активация анаэробного гликолиза даже в присутствии кислорода (эффект Варбурга) [15] приводит также к активации синтеза жирных кислот и ускорению липогенеза. Синтез насыщенных и недостаток поступающих с пищей ненасыщенных жирных кислот приводят к значительному изменению липидного состава клеток, в том числе перераспределению жирнокислотных остатков между триглицеридами и фосфолипидами [16]. Хотя биохимические основы, объясняющие отличия липидного состава клеток глиом от здоровых глиальных клеток, известны, детального исследования липидома опухолей до сих не проведено, поскольку подобные работы выполняют обычно на клеточных линиях, либо ксенографах, что не в полной мере отражает естественную биологическую вариабельность опухолей, а также их физиологическое окружение [17]. Опухоли диффузной природы остаются сложным объектом для метаболомных исследований ввиду трудностей в получении достаточного для исследования объема опухолевого материала, не содержащего включений клеток других типов.

Значительный объем данных, накапливаемый с применением методов молекулярного профилирования на основе масс-спектрометрии, позволяет исследовать метаболические изменения даже гетерогенных образцов, поскольку применение современных математических подходов дает возможность выделить характерные особенности молекулярных профилей, различающих ткани, отделив эти особенности от естественной биологической вариабельности и вклада иных клеток, присутствующих в образце [16, 18]. Цель данной работы — выявить различия липидного состава астроцитом 2-й и 3-й степени злокачественности с целью подтверждения предполагаемых метаболических изменений, сопровождающих злокачественное перерождение тканей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все образцы, включенные в исследование, были собраны выделенным для этой цели нейрохирургом, наблюдавшим за ходом операции с использованием систем нейронавигации и визуально. Основной критерий отбора — состав образца, который должен был включать в себя преимущественно опухолевую ткань. Участки, содержащие признаки некроза и большое количество сосудов не отбирали для исследования. Образцы тканей промывали стерильным физраствором для удаления остатков крови и разделяли на две визуально схожие части. Одну часть замораживали и хранили при –80 °C до проведения исследования. Вторую часть подвергали гистологическому исследованию профессиональным патоморфологом в рамках стандартных протоколов. На основании гистологического заключения образцы, содержащие менее 75% опухолевых клеток, а также образцы с признаками некроза исключали из исследования. Таким образом, было отобрано 28 образцов тканей анапластической астроцитомы (3-я степень злокачественности; получены от 23 пациентов) и 15 образцов диффузной астроцитомы (2-я степень злокачественности; получены от 12 пациентов).

Все собранные образцы анализировали в случайном порядке, при этом различные образцы, полученные от одного пациента, не анализировали в один день для минимизации возможной систематической погрешности. Каждый образец ткани размораживали непосредственно перед анализом и разделяли на 2–4 части, в зависимости от размера, которые немедленно подвергали масс-спектрометрическому профилированию. Всего был собран 81 масс-спектрометрический профиль образцов анапластической астроцитомы и 46 массспектрометрических профилей образцов диффузной астроцитомы.

Все образцы анализировали с использованием картриджной микроэкстракции (Inline Cartridge Extraction, ICE) [19]. Образец ткани объемом около 1 мм³ помещали в одноразовый картридж, представляющий собой трубку из нержавеющей стали, на одном конце которой располагается кварцевый эмиттер электрораспыления, а с противоположной стороны трубка запечатывается при помощи входного капилляра из полиэфирэтилкетона. Кварцевый эмиттер защищен от попадания частиц ткани благодаря фильтру из стеклянного волокна. Образец в картридже промывали 100 мкл раствора, состоящего из изопропанола, метанола, ацетонитрила и воды (3 : 3 : 3 : 1 об.) с добавлением 0,1% (об.) муравьиной кислоты, после чего картридж помещали в ионный источник массспектрометра. Экстракцию осуществляли непрерывной подачей упомянутого ранее растворителя со скоростью потока, равной 3 мкл/мин. Регистрацию масс-спектров проводили с использованием масс-спектрометра LTQ XL Orbitrap ETD (ThermoFisher Scientific; Сан-Хосе, США) с разрешением 30 000 (при m/z 400) в диапазоне m/z 500–1000, в двух полярностях последовательно.

В масс-спектрах удаляли пики с соотношением сигнал– шум менее 2, после чего удаляли пики, присутствующие менее чем в 25% индивидуальных сканов в каждой группе. В дальнейшем анализировали только пики, интенсивность которых в спектрах была выше медианной. Выделение пиков, характеризующих каждую из групп образцов, проводили с помощью дискриминантного анализа со сжатием (shrinkage discriminant analysis) [20]. Значимость каждого из выделенных пиков оценивали при помощи критерия lfdr (local false discovery rate), показывающего вероятность того, что индивидуальный пик не будет оказывать влияния на классификацию образцов. Пороговое значение lfdr было выбрано 33%.

По два образца ткани наибольшего объема из каждой группы были также использованы для идентификации липидов. Для этого примерно 10 мг ткани гомогенизировали в 400 мкл указанного ранее раствора на льду. Гомогенат обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение 5 мин и центрифугировали при 21 000 g в течение 15 мин при 4 °C. Супернатант переносили в хроматографическую виалу и выпаривали под вакуумом. Липиды перерастворяли в 20 мкл раствора, состоящего из н-бутанола, изопропанола и воды (8 : 21 : 69 об.)  с добавлением 5 мМ ортофосфорной кислоты. Анализ липидов проводили с применением обращенно-фазовой нанопоточной ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения с использованием указанного выше масс-спектрометра. Идентификацию липидов проводили с использованием ПО LipiDex.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ограниченный динамический диапазон масс-анализаторов не позволяет делать однозначных количественных выводов о содержании молекул в исходной биологической пробе. Однако изменение относительных интенсивностей пиков между собой пропорционально изменению содержания соответствующих молекул на фоне других соединений выбранного класса. Используемая в работе смесь растворителей эффективно растворяет липиды, особенно полярные липиды клеточных мембран, которые легко ионизируются и детектируются в выбранном диапазоне масс. Таким образом, молекулярные профили, собираемые в рамках данного исследования, соответствуют преимущественно липидной компоненте клетки. Применение SDA [20], подвида линейного дискриминантного анализа, учитывающего внутренние корреляции, вызываемые наличием естественного распределения стабильных изотопов в биологических молекулах (для липидов это преимущественно 13C), позволяет выделить ионы, интенсивность которых различается между образцами анализируемых групп. Рассчитываемый при этом CAT-score (correlation adjusted t-score) является аналогом t-статистики Стьюдента, учитывающим как внутренние корреляции и высокую размерность исходных данных, так и отклонение распределения интенсивности пиков от нормального. Величина CAT-score демонстрирует отклонение интенсивности индивидуального пика от среднего в сторону соответствующей группы. В результате, было выделено 13 ионов липидов, уровень которых повышен, в образцах диффузной астроцитомы по сравнению с образцами анапластической, и три иона липида, повышенных в спектрах, соответствующих образцам анапластической астроцитомы (таблица). Химическую идентификацию ионов проводили при помощи тандемной хромато-массспектрометрии на основе экстракции липидов из образцов тканей, отличающихся наибольшим размером, что было бы невозможно для большинства образцов, ввиду малого объема доступного биоматериала. Таким образом, за счет применения масс-спектрометрического профилирования тканей без пробоподготовки была решена задача сохранения естественной биологической вариабельности анализируемых опухолей и учета межпациентной вариабельности.

Все выделенные пики не относятся к наиболее интенсивным в масс-спектрах и принадлежат ко второму и третьему квартилям распределения по интенсивностям. Это связано с тем, что наиболее и наименее интенсивные пики сильно связаны с естественной вариабельностью и могут значительно изменяться между пациентами, что делает их внутригрупповую вариабельность сравнимой с межгрупповой на данном размере выборки. Однако полученные результаты демонстрируют снижение разнообразия в липидном составе по мере роста злокачественности, что соответствует общей картине, представленной ранее при сравнении глиальных опухолей 4-й степени злокачественности с образцами неопухолевого контроля [16].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наблюдаемые различия в липидном составе между астроцитомами 2-й и 3-й степени злокачественности демонстрируют снижение содержания фосфолипидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, что свидетельствует о росте доли de novo синтезированных жирных кислот в мембранах клеток глиом при повышении степени их злокачественности. Наблюдается также снижение содержания фосфолипидов с полностью насыщенными жирнокислотными остатками, поскольку, согласно предыдущим исследованиям, наиболее злокачественные клетки глиом накапливают насыщенные жирные кислоты в липидных каплях, чтобы использовать их для поддержания метаболической активности на более поздних стадиях развития заболевания, при которых доступность питательных веществ будет снижена в еще большей степени [15, 21].

Следует отметить, что относительное содержание фосфатидилихолинов PC(32:1), PC(34:1) и PC(34:2) не однозначно соотносится с общей картиной роста астроцитом. Так, было показано, что эти липиды в значительной мере характеризуют именно высокозлокачественную, а не неопухолевую, мозговую ткань [16], в то время как при сравнении диффузных и анапластических астроцитом эти липиды оказались характерны для менее злокачественной формы. Это наблюдение свидетельствует о неравномерности уменьшения содержания липидов различных классов по мере роста злокачественности, что приводит к увеличению наблюдаемой доли перечисленных выше лецитинов в диффузных астроцитомах, и одновременно демонстрирует ограничение, накладываемое прямым массспектрометрическим профилированием на возможность анализировать липидный состав без дополнительного применения более информативных методов хромато-массспектрометрии. Анализ суммарного жирнокислотного состава отдельных липидов, который возможен с использованием прямой масс-спектрометрии, не позволяет различать изомерные липиды. Так, например, фосфолипид PC(34:1) может состоять из остатков пальмитолеиновой и стеариновой кислот, равно как и из остатков пальмитиновой и олеиновой кислот. Среди жирных кислот именно пальмитиновая наиболее доступна для включения в состав липидов по мере роста злокачественности, поскольку является основным продуктом, выделяющимся в ходе функционирования НАДФ⋅H-зависимой синтазы жирных кислот [14]. Следует отметить, что активируемый благодаря эффекту Варбурга пентозофосфатный путь приводит к повышенной генерации НАДФ⋅H опухолевой клеткой [22]. Таким образом, при повышении злокачественности можно наблюдать как расходование пула фосфолипидов, содержащих 32–34 атома углерода в жирнокислотных цепях [21, 23], так и их активное замещение изомерными липидами, содержащими синтезированные de novo жирнокислотные цепи, при переходе к астроцитомам 4-й степени злокачественности.

ВЫВОДЫ

Применение методов молекулярного профилирования позволяет исследовать изменения в липидном составе опухолевых тканей различной степени злокачественности с учетом их естественной биологической вариабельности. По мере роста злокачественности астроцитом прослеживается тенденция к уменьшению разнообразия полярных липидов в составе клеточных мембран. Уменьшаются также длина и степень ненасыщенности жирнокислотных остатков, составляющих эти липиды. Данный эффект связан с активацией синтеза жирных кислот вследствие метаболического перепрограммирования глиальных клеток в процессе их малигнизации, а в случае с высокозлокачественными глиальными опухолями и с активацией пути бета-окисления жирных кислот для поддержания жизнедеятельности клетки.