Рис. 1. Профиль хроматографии I (IMAC на Ni-INDIGO, Cube Biotech)

Рис. 2. Образцы хроматографии I, 10% SDS–PAGE. Дорожки: 1 — супернатант; 2 — нерастворимый остаток; 3 — проскок; 4 — промывка; M — маркер молекулярной массы белка со значениями полос, кДа; 5–9 — элюат, фракции 2, 5, 8, 10 и 11 соответственно

Рис. 3. Рибонуклеаза A (RibA) взаимодействует с коровым ингибитором Rnh1 (серая поверхность). A. Фермент контактирует с ингибитором своей лигандсвязывающей бороздкой; остатки, образующие активный центр, выделены цветом (PDB id: 1DFJ) [10]. Б. Увеличенное изображение C-конца Rnh1 в тесном контакте с остатками активного центра РНКазы (показано синим), стерически препятствующем связыванию РНК. C-концевой His-тэг (показано оранжевым) нарушает взаимодействие, «врезаясь» в RibA; наложение модели ингибитора с His тэгом на C-конце и кристаллической структуры комплекса Rnh1/RibA в AlphaFold3 (PDB id: 1DFJ)

Рис. 4. Структурное моделирование химерного ингибитора Trx::Rnh1 в AlphaFold3. A. Нативный и несвязанный продукт, состоящий из подковообразного корового ингибитора, соединенного линкером с компактным Trx. Цветовая схема соответствует индексу достоверности модели из расчета на аминокислотный остаток: pLDDT > 90 (синий), моделирование с высокой степенью точности; pLDDT 70–90 (светло-голубой), высокая точность для основной цепи; pLDDT 50–70 (желтый) представление нестабильной структуры с низкой степенью точности; pLDDT < 50 (оранжевый), неупорядоченная область. Соответственно, функциональные модули Rnh1 и Trx отображены с высокой точностью, тогда как представление линкера является условным: он может быть ориентирован и расположен по-разному, например, снаружи подковы. Б. Рибонуклеаза A (показана стрелкой), взаимодействующая с химерным ингибитором, выглядит зажатой между модулями Trx и Rnh1

Рис. 5. Анализ стабильности РНК, пилотный эксперимент. Дорожка 1: маркер длин Thermo Scientific™ GeneRuler 1kb DNA Ladder. Дорожки 2–6: 1 мкг РНК + Обработка проведена при температуре 37 °С в течение 30 мин

Рис. 6. Данные ПЦР с обратной транскрипцией для анализа стабильности РНК при 40–57 °C с использованием 1 мкг РНК + 2 мкг LoRI с РНКазой А (2,5 нг) или без нее; время обработки — 30 мин

Рис. 7. Анализ стабильности РНК при 40–57 °C, время обработки — 30 мин. Дорожка 1: маркер длин Thermo Scientific™ GeneRuler 1kb DNA Ladder. Дорожки 2–9: 1 мкг РНК + 2,5 нг РНКазы A + 2 мкг LoRI при