Известно, что важным компонентом ниши костного мозга являются гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые в результате созревания и дифференцировки формируют пул клеток крови на протяжении всей жизни. Ниша — особое микроокружение с гуморальными факторами и специфическими клеточными контактами для ГСК, обеспечивающими строго регулируемые процессы самоподдержания или самообновления и дифференцировки клеток. ГСК обладают уникальным клеточным циклом с асимметричным делением для поддержания и обновления пула плюрипотентных ГСК и, одновременно, для генерирования необходимых общих или более дифференцированных предшественников. Активность ГСК зависит напрямую от клеточного цикла, от его продолжительности или времени до входа в клеточный цикл, а также частоты клеточных делений. Важно, что в гомеостатических условиях большинство ГСК в значительной степени должны находиться в фазе G0 клеточного цикла или в фазе покоя (до 95%), чтобы предотвратить преждевременное истощение клеток, при этом самообновление клеток и дифференцировка наступают в фазу G2 [1]. Поскольку обычно ГСК находятся в условиях ниши в состоянии покоя, опосредованном внутри- и внеклеточными механизмами, включая некоторые ингибиторы пролиферации, например CXCL4 и TGFβ, секретируемые мегакариоцитами [2], изменения в межклеточном контакте или концентрации, а также появлении новых гуморальных факторов способны вывести ГСК из состояния покоя, индуцировать их пролиферацию и дифференцировку, аналогичную пролиферации ГСК во время кровопотери, облучения или действия провоспалительных цитокинов [3]. В свою очередь, это приведет к снижению их функциональности, аберрантной регуляции клеточного цикла и даже злокачественности [4, 5]. Интересно, что деление клеток при этом не является обязательным этапом перед дифференцировкой в общие миелоидные, мегакариоцитарно-эритроидные и пре-мегакариоцитарные предшественники [6]. Наряду с данными предшественниками в гемопоэтическом процессе выделяют общие мультипотентные и лимфоидные предшественники. Каждую клетку можно отличить по маркерам дифференцировки, которые ГСК приобретает в процессе специализации и действия различных стимулов, в частности комбинации колониестимулирующих факторов. Классическим вариантом стимулов являются также цитокины, однако они могут оказывать негативное и позитивное влияние на дифференцировку. Так, индуцировать миелопоэз способны GM-CSF, G-CSF, M-CSF, EPO, TPO, SCF/KL, FL, TNF, LIF, IL12, IL11, IL6, IL5, IL4, IL3, IL1, SDF-1, FGF-4, а угнетать TNF, IL4, TGFβ, IFN, MIP-1, IL10, IL13, и для активации лимфопоэза необходимы IL2, IL4, IL7, а угнетения — TGFβ, IL4 [7]. В микроокружении опухоли, благодаря наличию большого количества опухоль- ассоциированных клеток, синтезируется широкий спектр факторов, который потенциально способен направлять дифференцировку ГСК в те или иные общие или более специализированные предшественники. Таким образом, при определенных условиях возможно расширение пула самих ГСК, предшественников ГСК и соответственно изменение их функциональной активности, которое может привести к развитию патологического процесса в организме или ухудшению течения имеющегося. Так, например, при опухолевом процессе формируется специфическое микроокружение, в котором по последним данным гемопоэтические стволовые клетки играют немаловажную роль. Известно, что опухоль способна рекрутировать клетки в процессе онкогенеза, ГСК не являются исключением, при этом все клетки, произошедшие из ГСК в микроокружении солидных опухолей, участвуют в процессах опухолевой инвазии, ее росте, прогрессировании и химиорезистентности к препаратам [8]. Нередко ГСК или так называемые опухоль- ассоциированные ГСК являются опухоль инициирующими клетками и в процессе могут вызывать дифференцировку других клеток в фибробласты, макрофаги и эндотелиальные клетки, которые поддерживают рост и рецидив опухоли посредством продукции и секреции факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса в дополнение к запуску процесса ангиогенеза [9]. Таким образом, наряду с другими опухоль-ассоциированными клетками, гемопоэтическая стволовая клетка принимает активное участие в поддержании и прогрессировании опухолевого процесса, однако на сегодняшний день аспекты взаимодействия гемопоэтических стволовых клеток и опухолевых остаются малоизученными. Поэтому необходимо исследовать влияние не только межклеточного контакта, но и гуморальных факторов опухоли на ключевые этапы жизнедеятельности ГСК, такие как пролиферативная способность, клеточный цикл и дифференцировка, что и явилось целью нашего исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

CD34+-сепарированные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) доноров (n = 10, средний возраст — 38,1 ± 3,4 года) были получены в Клинике иммунопатологии НИИФКИ. В исследовании в качестве материала использовали также клеточную линию человеческого Т-клеточного лейкоза 1301, клеточную линию человеческого хронического миелоидного лейкоза K562 (Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур, Sigma Aldrich, Merck KGaA, Германия) и клеточную линию человеческой меланомы Sk-mel-37, любезно предоставленную Лабораторией клеточных технологий НИИФКИ (Новосибирск, Россия).

Культивирование ГСК

Процедуру размораживания и промывания криоконсервированных CD34-положительных образцов ГСК проводили в соответствии со стандартными рекомендациями для замороженных первичных клеток [10, 11]. HSC подсчитывали в 0,01%-м (10 мг/мл) растворе метиленового синего («Биолот», Россия) для определения жизнеспособности клеток с использованием камеры Горяева. Полученные клетки культивировали в различных количествах (от 100 000 до 1 000 000 кл./мл) с соответствующей средой RPMI-1640 («Панэко», Россия) или средой для размножения гемопоэтических стволовых клеток Stemline II (STEM) (Sigma Aldrich Co. LLC, США) в качестве положительного контроля, дополненных 50 мг/мл гентамицина (Dalfarma, Россия), 25 мг/мл тиенама (Merck Sharp & Dohme Corp., Кенилворт, Нью-Джерси, США) в течение различного времени в зависимости от серии экспериментов при 37 °C, 5% CO² и увлажненной атмосфере.

Культивирование линий опухолевых клеток

Суспензионные линии опухолевых клеток K562 и 1301 и адгезионную линию SK-mel37 культивировали в стандартных условиях с использованием полной культуральной среды RPMI-1640 + 2 мМ глутамина + 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США). Культуры поддерживали в диапазоне от 100 000 до 1 000 000 кл./мл, при 5% CO² и 37 °C. Кондиционные среды отбирали с расчетом на серию эксперимента в экспоненциальную фазу роста опухолевых линий и замораживали для дальнейшего использования.

Жизнеспособность и пролиферация ГСК

ГСК в количестве 1 × 105 кл./250 мл инкубировали с кондиционными средами опухолевых линий от 1301, K562, Sk-mel 37 в различных разведениях 100%, 50%, 10% с дополнением до установленного объема полной культуральной средой RPMI-60 с 10%-м человеческим альбумином (Октафарма Фармацевтика Продуктионсгес м.б.Х., Австрия) в плоскодонном 96-луночном планшете (TPP, Швейцария) в триплетах в течение 3, 5 и 7 дней. В качестве положительного контроля использовали специализированную клеточную среду STEM. В качестве отрицательного контроля — DMSO. Условия культивирования ГСК были стандартными: при 37 °C, 5% CO², 90% относительной влажности.

Также ГСК в количестве 1 × 10⁵ кл./250 мл инкубировали с опухолевыми линиями в специальных планшетах для полного исключения клеточного контакта — в 12-луночных трансвеллах с размером пор 0,4 мкм, диаметром вставки 6,5 мм (Corning Incorporated, Costar, Аризона, США) в течение трех дней в тех же условиях.

Жизнеспособность и пролиферативную активность ГСК оценивали при помощи реагента WST-1 (Takara Bio Inc., Кусацу, Япония). Анализ образцов проводили колориметрически с помощью микропланшетного ридера Tecan Infinite F50 (Австрия) с длиной волны 450 нм (эталон 650 нм).

Клеточный цикл ГСК

Предварительно ГСК окрашивали CFSE-красителем (Invitrogen, Юджин, Орегон, США) согласно протоколу производителя для отличия их от опухолевых клеток в ко- культуре в планшете.

ГСК в соотношении 1 : 1 — 1 × 10⁵ кл./мл и 10 : 1 — 1 × 10⁶ кл./мл к опухолевым клеткам инкубировали в 24-луночном планшете как ко-культуру для оценки влияния прямого контакта опухолевых клеток на стволовые и в 12-луночных трансвеллах для оценки влияния только гуморальных факторов в течение трех суток в тех же условиях, в качестве контроля использовали интактные клетки в средах RPMI и STEM. Затем клетки переносили в цитометрические пробирки и фиксировали в ледяном 70% спирте на льду в течение 2 ч, трижды отмывали, потом добавляли красящий раствор на основе EtBr (Serva Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Германия) 1 мг/мл, RNAазу А («Микроген», Россия) 5 мкг/мл, 10% фетальной бычьей сыворотки и PBS + ЭДТА, окрашивали в течение 30 мин при температуре 37 °C. Готовые образцы анализировали с помощью 14-цветного проточного цитофлуориметра LongCyte (Challenbio, Китай) с программным обеспечением ModelFlower.

Дифференцировка ГСК

ГСК в соотношении 10 : 1 — 1 × 10⁶ кл./мл к опухолевым клеткам (поскольку для оценки коммитированных предшественников необходимо большее количество клеток) инкубировали в 24-луночном планшете как ко-культуру и в 12-луночных трансвеллах в тех же условиях. Затем клетки переносили в цитометрические пробирки и окрашивали с помощью моноклональных антител к CD10 PE (BioLegend, США), CD34 APC (BioLegend, США), CD38 PE-Cy7 (ElabScience, Китай), CD45RA PerCP (ElabScience, Китай), CD90 APC-Cy7 (Сloud-Сlone Сorp., США), Lin- (коктейль CD3/14/16/19/20/56) FITC (BioLegend, США). Опытные образцы анализировали с помощью 14-цветного проточного цитофлуориметра LongCyte (Challenbio, Китай) с программным обеспечением ModelFlower. При оценке флуоресценции для каждого моноклонального антитела был выполнен Fluorescent minus one контроль (FMO). Клетки- предшественники типировали по поверхностным маркерам следующим образом: плюрипотентные гемопоэтические стволовые клетки (пГСК) Lin–CD34+CD38–CD45RA–CD90+; общие мультипотентные предшественники (оМПП) Lin-CD34+CD38–CD45RA–CD90–; общие предшественники лимфоцитов (ОЛП) Lin–CD34+CD38+CD45RA+CD90–; миелоидные и мегакариоцитарно-эритроидные предшественники. (Э-МП) Lin–CD34+CD38+CD45RA–CD10–; гранулоцитарно-моноцитарные-предшественники (Г-МП) Lin–CD34+CD38+CD45RA+CD10–; предшественники B- и NK- клеток (B-NK-П) Lin–CD34+CD38+CD45RA+CD10+. Также относительное количество предшественников оценивали до посадки в культуру в качестве контроля дифференцировки («до»).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.0.0. Тест Фридмана использовали для оценки различий между группами, где значение p < 0,05 считали статистически значимым. Данные были представлены как медиана (25-й персентиль; 75-й персентиль) ± межквартильный размах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первым шагом мы оценили жизнеспособность и пролиферативную активность стволовых гемопоэтических клеток в трех временных точках с разной долей гуморальных факторов от опухолевых линий различного генеза. Так, мы продемонстрировали, что в кондиционных средах с различной концентрацией от опухолевых линий поддерживалась жизнеспособность ГСК на уровне контроля на 3-и сутки. На 5-е сутки сохранялась не только жизнеспособность, но и началась пролиферация во всех разведениях кондиционных сред, на 7-е сутки поддерживался примерно тот же уровень пролиферации (рис. 1). При этом на 3-и и 5-е сутки жизнеспособность ГСК была выше в 50%-й и 100%-й кондиционной среде от SK-mel37 (рис. 1А, Б), однако на 7-е сутки резко снизилась их жизнеспособность (рис. 1В). Возможно, это связано с тем, что ГСК активнее пролиферировали в кондиционной среде от SK-mel37, и к 7-м суткам, предположительно, из-за отсутствия питательных веществ клетки начали погибать.

В пользу важности гуморального влияния на свойства ГСК говорят и результаты, полученные при культивировании ГСК с опухолевыми линиями в условиях, исключающих клеточный контакт, так на уровне достоверных различий, было установлено, что пролиферативная активность ГСК была выше в трансвеллах, чем в контроле при одинаковом количестве клеток (рис. 2Б). Обращает на себя внимание и то, что SK-mel 37 обладает более высокой пролиферативной способностью в трансвеллах с ГСК по сравнению с линией 1301 в эквивалентных количествах (рис. 2А).

Далее мы оценили влияние сокультивирования на фазы клеточного цикла ГСК, так количество клеток, находящихся в фазе G2–M, было выше в сокультуре с SK-mel37 по сравнению с другими опухолевыми линиями. Большее количество клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, наблюдалось при клеточном контакте с 1301. Мы также продемонстрировали резкое снижение количества ГСК, культивируемое в трансвеллах с SK-mel37, это связано с гибелью клеток, поскольку 89,4% клеток находятся в фазе Sub-G1 (таблица), интересно, что и в кондиционных средах от SK-mel жизнеспособность и пролиферативная активность ГСК также снижалась, однако к 7 суткам.

На заключительном этапе при оценке дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток мы обнаружили, что соотношение предшественников было различным, так через трое суток увеличилось количество ГСК и общих мультипотентных предшественников (рис. 3А), при этом в большей степени увеличилось количество последних (рис. 3В), а вот количество общих лимфоидных, мегакариоцитарных, эритроидных и миелоидных предшественников, наоборот, снизилось (рис. 3Б). Интересно, что при этом количество ГСК и МПП было достоверно ниже на 20,3% в трансвеллах с К562 по сравнению с другими опухолями в трансвеллах (рис. 3А), а значение плюрипотентных гемопоэтических клеток с фенотипом Lin–CD34+CD38–CD90+CD45RA– было выше по сравнению не только с другими опухолями в тех же условиях, но и контрольными образцами (рис. 4). Примечательно, что большее относительное количество гранулоцитарно- моноцитарных предшественников наблюдалось в ко-культуре с 1301 и К562, по сравнению с культурами в трансвеллах с теми же опухолями и контрольной средой (рис. 4). Количество общих предшественников тромбоцитов, эритроцитов и клеток миелоидного ряда снижалось при культивировании с клетками меланомы SK-mel-37 в условиях как прямого клеточного контакта, так и при обмене гуморальными факторами, при этом достоверной разницы между трансвеллами и ко-культурой в планшете получено не было (рис. 4).

Таким образом, под действием гуморальных факторов опухоли К562 относительное количество плюрипотентных ГСК увеличивалось, при клеточном контакте ГСК с К562 и с 1301 увеличивалось количество предшественников гранулоцитарно-моноцитарного ряда.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Микроокружение опухоли — сложная, динамичная структура, являющаяся регулятором онкогенеза. Проблема изучения микроокружения опухоли в экспериментальных моделях остается актуальной на сегодняшний день. Можно выделить две основные составляющие микроокружения опухоли — синтез и обмен гуморальными факторами, а также образование перекрестных связей между клетками в условиях «клеточного соседства». Под влиянием опухоли клетки способны изменять свои свойства и функции. Известно о специфических клетках с собственным фукнкционалом в микроокружении опухоли, это так называемые опухоль-ассоциированные макрофаги, фибробласты, дендритные клетки и другие [12–14], участвующие в процессе онкогенеза. Эти клетки на сегодняшний день могут быть рассмотрены и как информативный маркер, и как терапевтическая мишень. Поскольку мы говорили о том, что в микроокружении опухоли обнаруживаются гемопоэтические стволовые клетки, немаловажным было оценить влияние опухоли на свойства ГСК.

По нашим данным, дифференцировка ГСК в культуре наступала на 3-и сутки, когда к 3-м суткам клетки активировались и начинали пролиферировать, а к 7-м суткам начинали дифференцироваться. Примечательно то, что ГСК способны вступать в раннюю дифференцировку на 3-и сутки под влиянием различных факторов [15]. В целом, количество клеток и дифференцировка ГСК зависят от того, взаимодействует она с опухолевой клеткой напрямую или опосредованно через гуморальные факторы. Общий паттерн в дифференцировке ГСК наблюдался у 1301 и К562, скорее всего, потому что оба типа опухоли являются по происхождению клонами гемопоэтических клеток, также следует отметить, что сдвиг в сторону гранулоцитарно-моноцитарного ряда связан с высоким риском метастазирования [16], что в целом характерно для лейкозов. Между тем ГСК при культивации с солидной опухолью меланомой имели несколько отличающееся соотношение клеток со снижением общих предшественников миелопоэза и увеличением мультипотентных предшественников (p = 0,05). Интересно, что, согласно литературным источникам, дифференцировка ГСК направляется не только в сторону клеток миелоидного ряда при солидных опухолях, в частности миелоидных супрессоров [17], но и в сторону менее дифференцированных клеток с сохранением мультипотентности [18], что согласуется с нашими данными.

ВЫВОДЫ

В зависимости от типа опухоли меняются пролиферативная активность, деление клеток и дифференцировка. Опухолевые линии лейкозов К562 и 1301 аналогично влияют на жизнеспособность и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток, тогда как солидная опухоль — меланома SK-mel-37 оказывает другой эффект на те же процессы, что говорит нам как о частных, так и об общих закономерностях влияния опухолей на жизнедеятельность гемопоэтической стволовой клетки. Для более полного понимания влияния опухоли на свойства ГСК необходимо использовать более комплексный подход, включающий изучение секретома клеток, маркеров рекрутинга и ассоциированности с опухолевым процессом, а также использовать более сложные и релевантные методы сокультивирования клеток, учитывающие сложную, динамичную и гетерогенную структуру опухолевого микроокружения.