Т-клетки являются важнейшими эффекторами адаптивного иммунитета. Для реализации своих функций они оснащены Т-клеточным рецептором (ТКР), который участвует в распознавании пептидных антигенов, представленных собственными молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). ТКР представляет собой гетеродимер, в преобладающем типе Т-клеток состоящий из α- и β-цепи. Согласно классической парадигме, обе цепи ТКР вносят равный вклад в распознавание МНС/пептидных комплексов. Однако для ряда ТКР было показано, что α- или β-цепь может доминировать во взаимодействии с антигеном и определять специфичность всего рецептора [1]. Около десяти лет назад был введен термин «цепецентричность ТКР» для описания данного феномена и ТКР с асиметричной функциональной активностью цепей получили название цепецентрических рецепторов [2, 3]. Это свойство некоторых ТКР может значительно упростить и повысить эффективность получения терапевтических Т-клеточных продуктов для иммунотерапии инфекционных и онкологических заболеваний [1, 4].

На сегодняшний момент не известно, является ли цепецентричность врожденным свойством некоторых ТКР и каков механизм формирования подобных рецепторов. В большинстве исследований цепецентрические ТКР идентифицировали в  иммунном репертуаре человека или мыши [2, 3, 5–7], что может указывать на экспрессию таких рецепторов преимущественно антигенпримированными Т-клетками. Ранее было показано, что естественно сформированный пул Т-клеток памяти мыши содержит около 20% цепецентрических рецепторов [4], но до конца не ясно, какова их доля в репертуаре эффекторов, вовлеченных в первичный иммунный ответ. Выяснение данного вопроса позволит установить важные аспекты природы цепецентрических ТКР: 1) является ли цепецентричность свойством, исходно присущим некоторым рецепторам; 2) какова роль антигенной стимуляции в формировании или отборе таких ТКР.

Цель данной работы заключалась в определении частоты встречаемости ТКР с доминантно-активной α-цепью в репертуаре первично активированных эффекторов и рестимулированных клеток памяти мыши. 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самок мышей инбредной линии C57BL/6 (гаплотип H2-K^b) (весом 18–20 г, 6–8-недельного возраста) из экспериментально-биологической лаборатории НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ФГБУ «НМИЦ онкологии имени Н. Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия). Животных содержали при стандартных условиях (20–24 °C, 40% относительной влажности, 12-часовой световой режим) и выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации. Для генерации клеток памяти in vivo девять мышей C57BL/6 иммунизировали клетками аллогенной мастоцитомы P815 (K^dD^d) путем однократного внутрибрюшинного введения 1 × 10⁷ опухолевых клеток/мышь. Через два месяца после иммунизации [8] животных выводили из эксперимента, как указано выше, и стерильно извлекали селезенку. Клетки селезенки осторожно выдавливали из стромы органа в гомогенизаторе Поттера  (DWK Life Sciences, Германия) в 3 мл PBS. Затем проводили цитометрический анализ спленоцитов на приборе FACSCantoII (BD, США) с использованием флуоресцентно меченых антител (BioLegend, США) к поверхностным маркерам Т-клеток: CD3-PE, CD8-Pacific blue, CD44-APC и CD62L-APC-Cy7. Клеточный дебрис исключали из анализа по показателям светорассеяния и включению пропидий йодида (BD, США). Долю Т-клеток (%) в общей популяции живых лейкоцитов селезенки определяли по экспрессии маркера CD3. Относительное количество (%) цитотоксических CD8⁺-Т-клеток анализировали в пуле CD3⁺-лимфоцитов. Сформированные после иммунизации in vivo долгоживущие CD8⁺-Т-клетки памяти определяли по коэкспрессии маркеров CD44 и СD62L (рис. 1). Клетки селезенки Р815-иммунизированных мышей без предварительной сортировки рестимулировали in vitro антигенами иммунизирующей опухоли [9]. Для этого спленоциты высевали в триплетах в круглодонные 96-луночные планшеты (Corning Costar, Sigma Aldrich, США) в количестве 4 × 10⁵ клеток/лунку. Клетки мастоцитомы Р815 обрабатывали цитостатиком митомицином С (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.; Япония) в дозе 50 мкг/мл в течение 60 мин при 37 °C и вносили к спленоцитам в соотношении 1 : 10. Клетки культивировали в 200 мкл среды RPMI1640 («ПанЭко», Россия), обогащенной 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, GE Healthcare, США), 0,01 мг/мл ципрофлаксацина (KRKA, Словения) и 10 мкМ 2-меркаптоэтанола (Merck, Германия), в течение 72 ч при 37 °C, 5% CO₂. Для индукции первично активированных CD8⁺-эффекторов клетки селезенки шести интактных (без иммунизации мастоцитомой Р815) мышей C57BL/6 культивировали in vitro с клетками P815 в течение 72 ч, как описано выше. Для оценки фоновой пролиферации клетки селезенки интактных и иммунизированных мышей аналогично культивировали без Р815. Уровень пролиферации (counts per minute) клеток в культуре спленоцитов измеряли по включению ³Н-тимидина (1 мкКи/лунку) («Изотоп», Россия), который вносили за 8 ч до окончания культивирования. Индекс антигениндуцированного ответа рассчитывали как соотношение уровня пролиферации спленоцитов в присутствии P815 к соответствующей фоновой пролиферации (рис. 2).

Клетки первично активированных эффекторов и рестимулированных клеток памяти, полученные, как описано выше, от одной интактной (неиммунизированной) и одной иммунизированной мыши соответственно, использовали для создания библиотек кДНК ТКР методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq (Illumina, США) [9].

Полноразмерную кДНК α-цепи ТКР из каждого репертуара клонировали в ретровирусный вектор MigRI, содержащий промотор PGK [4]. Трансфекцию пакующей линии HEK293Т проводили кальцийфосфатным методом. Для получения Т-лимфоцитов, трансдуцированных индивидуальным вариантом ТКРα, проводили предварительную активацию Т-клеток интактных (неиммунизированных) мышей. Для этого животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, стерильно извлекали селезенку и брыжеечный лимфатический узел и выделяли клетки из этих органов, как описано выше. Полученные клетки затем активировали in vitro Т-клеточным митогеном конканавалином А (3 мкг/мл) (Sigma Aldrich, США) в течение 24 ч и проводили трансдукцию путем двух спинокуляций с ретровирусами, содержащими индивидуальный вариант ТКРα, при 2000 × g в течение 2 ч (22 °C) [10]. Уровень модификации лимфоцитов определяли через 48 ч методом проточной цитофлуориметрии по измерению экспрессии репортерного белка GFP в контрольной пробе Т-клеток,  аналогично трансдуцированных GFP-ретровирусом [10]. Эффективность трансдукции составила 40–70% (данные не представлены).

Через 48 ч после трансдукции Т-клетки высевали в триплетах в плоскодонные 96-луночные планшеты (Corning Costar, Sigma Aldrich, США) в количестве 1 × 10⁵ кл./лунку. Клетки сингенной для мышей C57BL/6 лимфомы EL-4 и иммунизирующей мастоцитомы Р815 обрабатывали митомицином С, как описано выше. Для определения уровня пролиферации модифицированных Т-клеток в присутствии сингенных стимуляторов, обработанные цитостатиком клетки EL-4 вносили к Т-лимфоцитам в соотношении 1 : 2. Для оценки уровня специфической антигениндуцированной пролиферации модифицированные Т-клетки аналогично сокультивировали с клетками P815, обработанными митомицином С.  Клетки культивировали в 200 мкл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), обогащенной как описано выше, в течение 72 ч при 37 °C, 5% CO₂. В качестве контролей использовали нетрансдуцированные лимфоциты (НТЛ) и GFP-модифицированные Т-клетки. Для оценки уровня фоновой пролиферации Т-лимфоциты (НТЛ, ТКРα- и GFP-трансдуцированные) аналогично культивировали  без опухолевых клеток. Уровень клеточной пролиферации оценивали с помощью набора CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Оптическую плотность (OD) измеряли на микропланшетном спектрофотометре Infinite F50 (Tecan, Швейцария). Скрининг in vitro каждого варианта ТКРα проводили минимум в двух независимых экспериментах.

На рис. 1 и рис. 2 представлены данные трех независимых экспериментов как средняя ± стандартная ошибка среднего (mean ± SEM) (n = 6–9). На рис. 3 представлены частоты уникальных клонотипов ТКРα в каждом из исследуемых репертуаров. На рис. 4 представлены данные одного из двух репрезентативных экспериментов как mean ± SEM для трех технических повторов. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента после проверки нормальности распределения выборки по критерию Колмогорова–Смирнова. Различия признавали достоверными при p < 0,05. Статистический анализ проводили в программе Prism, v.8.1.2 (GraphPad, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе использовали экспериментальную модель генерации долгоживущих Т-клеток памяти, которая предусматривает in vivo иммунизацию мышей C57BL/6 (H2-K^b) клетками аллогенной мастоцитомы P815 (K^dD^d). В силу аллогенных различий в молекулах МНС класса I у реципиента развивается преимущественно CD8⁺-Тклеточный ответ на трансплантируемую опухоль. В селезенке иммунизированных животных не отмечали увеличения относительного количества Т-клеток по сравнению с интактными мышами (рис. 1А), однако доля CD8⁺-Т-клеток была достоверно увеличена после иммунизации по сравнению с контролем (рис. 1Б). Кроме того, среди CD8⁺-Т-клеток селезенки иммунизированных мышей отмечено накопление лимфоцитов с фенотипом эффекторных клеток памяти (CD44⁺CD62L^–), доля которых возросла в 1,9 раза по сравнению с аналогичной популяцией CD8⁺-Т-клеток в селезенке интактных мышей (рис. 1В). Полученные данные свидетельствуют о формировании пула долгоживущих CD8⁺-клеток памяти по завершении первичного иммунного ответа in vivo.

Учитывая, что поверхностный активационный фенотип Т-клетки напрямую не коррелирует с опытом ее взаимодействия с антигеном и функциональным статусом [11], для подтверждения генерации истинных Т-клеток памяти в ходе in vivo иммунизации лимфоциты селезенки иммунизированных мышей рестимулировали in vitro антигенами иммунизирующей опухоли. В культуре in vitro был получен первичный пролиферативный ответ спленоцитов интактных мышей на клетки аллогенной матоцитомы Р815, который в два раза превышал значения фоновой пролиферации (рис. 2). При  этом уровень антиген-индуцированной пролиферации спленоцитов иммунизированных животных в 3 раза превышал соответствующее значение в культуре клеток интактных мышей (рис. 2). Таким образом, функциональный тест in vitro показал первичный иммунный ответ на клетки аллогенной опухоли и усиленный вторичный ответ Т-клеток памяти.

Эту экспериментальную систему использовали для генерации эффекторов первичного и вторичного иммунного ответа на клетки аллогенной опухоли и создания библиотек их α-цепей ТКР (ТКРα). Для выявления клонотипов ТКРα, вовлеченных в иммунный ответ на антигены P815, репертуар первично активированных эффекторов и рестимулированных клеток памяти сравнили соответственно с репертуаром ТКРα неиммунизированных мышей и иммунизированных мышей без антигенной стимуляции in vitro. В каждой библиотеке были определены варианты ТКРα, частота которых после стимуляции минимум в три раза превышала частоту этого же клонотипа в соответствующем репертуаре без антигенной стимуляции [9]. Для дальнейших исследований были отобраны по 10 вариантов ТКРα, уникальных для репертуара первично активированных эффекторов или рестимулированных клеток памяти (рис. 3).

Доминантно-активные ТКРα определяли в тестсистеме in vitro. Для этого Т-клетки интактных мышей, модифицированные каждым вариантом ТКРα, помещали в культуру с сингенными стимуляторами (клетки EL-4) или специфическими аллогенными стимуляторами (клетки P815) (рис. 4). Соответствующую α-цепь считали доминантно-активной, если уровень пролиферации трансдуцированных лимфоцитов в присутствии P815 достоверно превышал уровень пролиферации этих же клеток без антигенной стимуляции (фон), в присутствии EL-4 (стимуляция сингенной опухолью), а также если он был достоверно выше значений антиген-индуцированной пролиферации НТЛ и GFP-модифицированных Т-клеток (рис. 4).

В результате скрининга была выявлена одна доминантноактивная ТКРα из репертуара первично активированных эффекторов (#3; рис. 4А): уровень пролиферативного ответа Т-клеток, модифицированных α-цепью ТКР #3, в присутствии специфического аллогенного стимулятора (клеток Р815) в 1,3 раза (p < 0,05) превышал уровень их пролиферации в культуре с сингенными стимуляторами (клетками EL-4). В репертуаре реактивированных клеток памяти были выявлены три доминантно-активных варианта ТКРα: при специфической антигенной стимуляции клетками Р815 Т-лимфоцитов, трансдуцированных ТКРα #2, ТКРα #5 и ТКРα #9, наблюдалось достоверное в 1,3 раза (p < 0,05) превышение уровня пролиферации по сравнению с пролиферацией в присутствии сингенных клеток EL-4 (рис. 4Б).

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что репертуар первично активированных эффекторов содержит 10% цепецентрических ТКР, тогда как доля таких рецепторов в репертуаре рестимулированных клеток памяти составляет 30%. Эта оценка предварительна и ее уточнение путем дальнейшего накопления данных продолжается.

В ходе скрининга in vitro были также выявлены отдельные варианты α-цепей ТКР (#9 в репертуаре первично активированных эффекторов (рис. 4А) и #1 в репертуаре рестимулированных Т-клеток памяти (рис. 4Б)), модификация которыми приводила к усиленной пролиферации Т-клеток в присутствии сингенной EL-4. Возможным объяснением этому может быть формирование рецептора с новой специфичностью в результате взаимодействия трансдуцированной α-цепи с эндогенной β-цепью ТКР в зрелом Т-лимфоците.  

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Используя ранее разработанную экспериментальную модель, мы проследили последовательные изменения в репертуаре ТКР мыши в ходе иммунного ответа на опухолевые аллоантигены, начиная с первичного ответа и заканчивая формированием иммунологической памяти и индукции вторичного ответа клеток памяти [8, 9]. Полученные данные показали, что ТКР с доминантно-активными α-цепями экспрессируют как первично активированные эффекторы, так и рестимулированные Т-клетки памяти. Исходя из этого, можно предположить, что цепецентричность является врожденным свойством некоторых ТКР.

Интересную аналогию этому явлению можно найти в работе Dietrich et al., в которой исследовали преимунный репертуар Т-лимфоцитов, специфичных к меланомаассоциированному аутоантигену melan-A. Было показано, что в melan-A-специфичных  тимоцитах и зрелых периферических Т-клетках преимущественно используется определенный V-сегмент α-цепи (Vα 2.1) [12]. Таким образом, сужение репертуара в пользу использования данного варианта α-цепи происходит в ходе внутритимусной селекции melan-A-специфичных Т-клеток, хотя преимущественное использование ими данного варианта ТКРα не указывает на функциональное доминирование α-цепи. Мы полагаем, что причины этого явления могут заключаться в возможности повторных реаранжировок генов α-цепей ТКР в ходе позитивной селекции в тимусе, приводящих к отбору их вариантов, способных к установлению большего числа контактов с эндогенными комплексами MHC/пептид и тем самым к более эффективной позитивной селекции.

Стоит отметить, что в наших экспериментах доля цепецентрических рецепторов в репертуаре реактивированных клеток памяти была выше (30% против 10% в репертуаре первично активированных эффекторов), что может указывать на селекцию клонотипов ТКР с доминантно-активными α-цепями в ходе вторичной специфической антигенной стимуляции. Биоинформатический анализ всего репертуара ТКР этих двух функциональных групп показал, что физико-химические характеристики ТКРα в пуле реактивированных клеток памяти существенно отличались от свойств α-цепей ТКР эффекторов, вовлеченных в первичный иммунный ответ [9]. Согласно полученным данным, во вторичном ответе репертуар ТКР обогащается рецепторами, содержащими α-цепь с повышенной силой взаимодействия с МНС/пептидными комплексами и кроссреактивностью [9].

Известно, что ТКР клеток памяти обладают повышенной аффинностью к антигену [13, 14]. Результаты наших исследований указывают на то, что это может быть обусловлено, в том числе, и экспрессией доминантноактивной ТКРα. Таким образом, отбор цепецентрических ТКР может быть одним из механизмов созревания функциональной авидности антиген-примированных Т-клеток [15–17].

В свете имеющихся на сегодняшний день данных мы полагаем, что функционально истинные Т-клетки памяти могут быть наиболее перспективным источником терапевтических ТКР. Ранее в экспериментальных моделях in vivo было показано, что доминантно-активные α-цепи цепецентрических ТКР клеток памяти можно успешно использовать для получения Т-клеточных продуктов для адоптивной иммунотерапии онкологических и инфекционных заболеваний [4, 7].

Описанную в данной работе систему скрининга in vitro можно также применять для оценки возможной аутореактивности модифицированных Т-клеток. При трансдукции индивидуальной α-цепи ТКР в Т-лимфоциты происходит ее связывание с эндогенно реаранжированными β-цепями, в результате чего может сформироваться рецептор с новой специфичностью, в том числе потенциально аутореактивный ТКР. Так, в нашем исследовании мы обнаружили повышенную пролиферативную активность Т-клеток, модифицированных двумя вариантами ТКРα, в присутствии сингенных стимуляторов (рис. 4А, #9; рис. 4Б, #1). Однако установление аутореактивности этих трансдуцированных Т-клеток выходило за рамки данной работы. Между тем, ранее мы показали, что Т-лимфоциты, модифицированные доминантно-активной ТКРα, не проявляют неспецифической цитотоксичности при адоптивном переносе сингенным реципиентам, что подтверждает отсутствие или низкую долю потенциально аутореактивных клонов в полученном Т-клеточном продукте [18].

ВЫВОДЫ

В данном исследовании была разработана система скрининга in vitro цепецентрических ТКР мыши. С ее помощью идентифицированы доминантно-активные антигенспецифичные α-цепи в репертуаре эффекторов, вовлеченных в первичный иммунный ответ, и в репертуаре клеток памяти после вторичной специфической антигенной стимуляции. Результаты работы показали, что 10% ТКР первично активированных эффекторов являются цепецентрическими. Таким образом, данное свойство изначально присуще некоторым Т-клеточным рецепторам. При этом в ходе вторичного иммунного ответа доля таких рецепторов увеличивается в три раза, что может свидетельствовать об обогащении репертуара цепецентрическими ТКР вследствие антиген-индуцированной селекции клонотипов с такими рецепторами. Полученные данные позволят усовершенствовать процесс идентификации и отбора цепецентрических антиген-специфичных ТКР, которые являются привлекательным источником терапевтических рецепторов для адоптивной иммунотерапии.