Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), относящийся к классу злокачественных лимфом, происходит из малых В-лимфоцитов. ХЛЛ разделяют на два клинических варианта: лимфоидная гиперплазия с клональным лимфоцитозом ≥ 5000/мкл; гипертрофия лимфоидных органов без лимфоцитоза. Увеличение лимфоузлов, миндалин и селезенки — проявление лимфомы из малых В-лимфоцитов, которая вместе с ХЛЛ входит в одну нозологическую единицу [1]. Согласно эпидемиологической обстановке ежегодная заболеваемость ХЛЛ в Европе составляет около 5 случаев на 100 тыс., в России — около 3–4 на 100 тыс. [2]. ХЛЛ является второй по распространенности среди неходжкинских лимфом. При ХЛЛ риск снижения костной массы достигает 66%, что в дальнейшем приводит к переломам трубчатых костей и инвалидизации. Снижение минеральной плотности кости (МПК) приводит к развитию остеопороза у 16% и остеопении у 35% пациентов с ХЛЛ [3]. В динамике разрушение костного скелета при ХЛЛ начинается в проксимальных отделах бедренных костей, переходя на позвоночник и остальные кости; связано это, скорее всего, с локализацией опухолевых клеток в костном мозге тазовых костей и взаимодействием с клетками стромы [4].

Чрезмерная генерация активных форм кислорода (АФК) лейкемическими клетками, снижение функциональной активности антиоксидантной системы могут быть одними из ключевых механизмов потери костной массы при ХЛЛ [5]. Окислительный стресс при ХЛЛ обусловлен большим количеством митохондрий в опухолевых клетках, а их выживаемость связана с устойчивостью к окислительному стрессу и ассоциирована с высоким содержанием внутриклеточных антиоксидантов, которые связывают АФК и ингибируют апоптоз, что приводит к увеличению количества злокачественных лимфоцитов [6].

Процесс остеорезорбции связан с окислительным стрессом, в частности с воздействием АФК на молекулы белков, которое приводит к повреждению окружающих клеток в костной ткани. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливающиеся в тканях, используют как маркеры окислительного стресса при многих онкологических заболеваниях, а их уровень в тканях свидетельствует о функциональной активности антиоксидантной системы при ХЛЛ [7]. Патогенез остеодеструктивного процесса при ХЛЛ остается неясным, а анализ исследований по данной теме показал, что снижение МПК является частью комплекса событий, затрагивающего иммунную систему, внутриклеточные сигнальные пути и редокс-статус, в связи с чем требуется дальнейшие изучение механизма потери костной массы для усовершенствования диагностики и терапии у таких пациентов.

Цель работы — исследовать взаимосвязь содержания продуктов перекисного окисления липидов, антиоксидантного статуса в сыворотке и в костной ткани и показателей минеральной плотности кости у больных с ХЛЛ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на базе ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России и ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Критерии включения в исследование: только мужчины в возрасте 50–70 лет, подписавшие информированное согласие.  Критерии исключения: все заболевания и состояния, при которых доказано может снижаться МПК, а именно терминальная почечная недостаточность, генетические заболевания (муковисцидоз, синдром Элерса-Данло, несовершенный остеогенез, порфирия и др.), заболевания эндокринной системы (сахарный диабет 1-го и 2-го типов, заболевания щитовидной железы и др.), длительное лечение глюкокортикостероидами, заболевания желудочнокишечного тракта (ЖКТ) (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, первичный билиарный цирроз, целиакия, мальабсорбция и др.), хирургические вмешательства на ЖКТ, наличие онкогематологических заболеваний, кроме хронического лимфолейкоза, ревматологические заболевания, наличие вируса иммунодефицита человека, невозможность самообслуживания.

Контрольную группу (группа 1) составили 14 условно здоровых мужчин, группу 2 — 54 пациента с ХЛЛ с нормальными показателями костной системы и группу 3 — 22 пациента с ХЛЛ со значимым снижением МПК. Все группы были сопоставимы по возрасту (р > 0,05): группа 1 — 59,0 [55,7; 63,5] лет, группа 2 — 62,0 [59,7; 65,3] лет, группа 3 — 65,0 [59,0; 66,1] лет. Диагноз ХЛЛ верифицировали с помощью проточного цитофлуориметра «BD FACSCanto II» (BD Biosciences; США) методом иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови следующей клональности: CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD23⁺, CD22⁺, CD23⁺, CD43⁺, CD200⁺, легких цепей иммуноглобулинов каппа или лямбда. Пациентов распределили по стадиям (классификация Binet): стадия А — 28 пациентов (37%), стадия В — 36 пациента (47%), стадия С — 12 пациентов (16%) [1]. Средний стаж заболевания составлял 10,5 месяцев, длительность исследования — 6 месяцев. На старте исследования оценивали показатели МПК, Т- и Z-критериев в поясничном отделе позвоночника (ПОП), шейке проксимального отдела бедренной кости (ШПОБК), проксимального отдела бедренной кости (ПОБК) на остеоденситометре «DEXXUM 3» (OsteoSys Co; Южная Корея). 10-летний риск перелома костей рассчитывали с помощью международного общепринятого инструмента оценки риска переломов Fracture Risk Assessment Tool (FRAX) [8]. Всем пациентам с ХЛЛ проводили трепанобиопсию задней верхней ости подвздошной кости для подтверждения диагноза. Биоптат костной ткани гомогенизировали в течение 3 мин при температуре 4 °C (1 : 10) с добавлением 0,9%-го раствора натрия хлорида. Содержание продуктов ПОЛ исследовали в сыворотке во всех группах и в гомогенате костной ткани у пациентов с ХЛЛ экстракционно-спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра «СФ-56» («ЛОМОСпектр»; Россия) [9]. Определяли оптическую плотность продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта против соответствующего контроля при 220 нм (содержание продуктов с изолированными двойными связями), 232 нм, 278 нм, 400 нм. Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.): Е232/ Е220 — относительное содержание диеновых конъюгатов (ДК), Е278/Е220 — кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ) и Е400/Е220 — оснований Шиффа (ШО). Общий антиоксидантный статус (ОАС) исследовали при помощи автоматического анализатора «Chem Well 2910 Combi» (Awereness Technology; США) тест-системой «В-7501 Общий антиоксидантный статус» («Вектор-Бест»; Россия), результат выражали как общее количество содержания антиоксидантов в ммоль/л.

На второй точке исследования, через 6 месяцев, во всех группах оценивали остеоденситометрические показатели, ПОЛ и ОАС в сыворотке. По результатам двух точек исследования сгенерированы три математические модели, прогнозирующие изменения МПК на основании показателей ПОЛ, ОАС в костной ткани и сыворотке.

Результаты обрабатывали с использованием «IBM SPSS Statistics v. 23» (SPSS: An IBM Company; США), представляли в виде медианы и интерквартильного диапазона (Ме [Q₁; Q₃]). Значимость различий оценивали при помощи критерия Манна–Уитни. Для сравнения медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела–Уоллиса. Отличия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05. Линейный регрессионный анализ был использован для выявления статистической зависимости между показателями. Качество моделей оценивали по коэффициенту детерминации R², характеру распределения регрессионных остатков. Корреляционный анализ был выполнен с помощью коэффициента Спирмена (R). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 

На момент начала исследования у 29% пациентов с ХЛЛ (группа 3) выявлено значимое снижение в поясничном отделе позвоночника Т-критерия в 4,8 раза по медиане в сравнении с группой 1, Z-критерия — на 100% по медиане, МПК — на 10% по медиане; снижение в шейке проксимального отдела бедренной кости Т-критерия — в 8 раз по медиане в сравнении с группой 1, Z-критерия — в 3 раза по медиане, МПК — на 16% по медиане; в проксимальном отделе бедренной кости снижение Т-критерия произошло в 4,2 раза по медиане, Z-критерия — в 1,3 раза, МПК — на 13% по медиане (табл. 1). В соответствии с Национальными рекомендациями, снижение Т-критерия в ШПОБК в группе 3 может быть расценено как остеопения. По сравнению с группой 2 пациенты с ХЛЛ и остеопенией имели статистически значимое снижение показателей в ПОП: Т-критерий — в 6 раз по медиане, Z-критерий — на 100%, МПК — на 13,5%; показателей в ШПОБК: Т-критерий — в 7 раз по медиане, Z-критерий — в 2,1 раза, МПК — на 15% по медиане и показателей в ПОБК: Т-критерий — в 8 раз по медиане, Z-критерий — в 4,5 раза по медиане, МПК — на 14% по медиане. Риск десятилетней вероятности перелома костей скелета, рассчитанный по алгоритму FRAX и включающий показатель МПК во всех группах, не имел значимых различий (р > 0,05). В группе 2 в динамике 6-месячного наблюдения значимые изменения зафиксированы в ПОП: Т-критерий снизился в 6,5 раз по медиане, МПК — на 9% по медиане и в ШПОБК: Т-критерий снизился в 4 раз по медиане. Однако остеоденситометрические показатели, в том числе и Т-критерий в ПОП и ШПОБК, соответствовали норме по параметрам, указанным в Национальных рекомендациях. Через 6 месяцев по сравнению с группой 2 у пациентов с ХЛЛ и остеопенией были значимо снижены в ПОП: Т-критерий — в 3,7 раза по медиане, Z-критерий — в 1,05 раза, МПК — на 2% по медиане; в ШПОБК: Т-критерий — в 1,5 раза по медиане, Z-критерий — в 1,7 раз, МПК — на 13% по медиане; в ПОБК: Т-критерий — в 22 раза по медиане, Z-критерий — в 1,2 раза, МПК — на 12% по медиане. При детальном анализе динамики показателей остеоденситометрии через 6 месяцев в группе 3 показатели МПК были снижены до показателей остеопении во всех локализациях исследования: в ПОП Т-критерий был снижен в 4 раза по медиане, Z-критерий — в 0,1 раз; в ШПОБК: Т-критерий — в 1,5 раза по медиане, Z-критерий — в 1,2 раз; в ПОБК: Т-критерий — в 2,1 раза по медиане, Z-критерий — в 9,3 раза.

Окислительный стресс в костной ткани у пациентов с ХЛЛ оценивали по содержанию окисленных остатков липидных молекул и общего антиоксидантного статуса. В группе 3 на старте исследования в гептановой фазе липидного экстракта статистически значимо увеличено содержание кетодиенов и сопряженных триенов (на 5,5% по медиане по сравнению с группой 2) и оснований Шиффа (в 24 раза по медиане) (табл. 2).

В изопропанольной фазе липидного экстракта значимо увеличивается уровень оснований Шиффа (на 41% по медиане по сравнению с группой 2). Не обнаружено у больных с ХЛЛ и остеопенией в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта костной ткани значимых изменений концентрации диеновых конъюгатов, а также в изопропанольной фазе кетодиенов и сопряженных триенов. В костной ткани в группе 3 был значимо снижен общий антиоксидантный статус (на 30% по медиане в сравнении с группой 2).

Показатели окислительного стресса в сыворотке во всех группах представлены в табл. 3.

Установлено, что на старте исследования при сравнении с группой 2 у пациентов с ХЛЛ и снижением МПК в гептановой фазе липидного экстракта было выявлено значимое увеличение содержания диеновых конъюгатов на 14% по медиане, кетодиенов и сопряженных триенов — на 9% по медиане. В изопропанольной фазе в сыворотке определялось значимо высокое содержание диеновых конъюгатов (на 15% по медиане), кетодиенов и сопряженных триенов (на 13% по медиане), однако ШО были снижены на 20% по медиане. В группе 3 был значимо снижен общий антиоксидантный статус в сыворотке на старте исследования на 47% по медиане в сравнении с группой 2.

В группе 3 по сравнению с группой 2 через 6 месяцев наблюдения выявлено значимое увеличение в гептановой фазе липидного экстракта сыворотки диеновых конъюгатов на 28%, кетодиенов и сопряженных триенов — на 29% и оснований Шиффа — на 31% по медиане, а в изопропанольной фазе диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов — на 29% и оснований Шиффа — на 28% по медиане. ОАС в группе 3 через 6 месяцев наблюдения был значимо ниже на 74% по медиане в сравнении с группой 2.

На старте исследования в группе 3 при сравнении с группой 1 в гептановой фазе липидного экстракта сыворотки зафиксированы значимо увеличенные концентрации диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов на 98%, оснований Шиффа на 95%, в изопропанольной фазе ДК, КД и СТ на 92%, ШО на 62% по медианам. В группе 3 ОАС был снижен на 53% по медиане в сравнении с группой 1.

Через 6 месяцев при сравнении с группой 1 в гептановой фазе липидного экстракта у пациентов с ХЛЛ и остеопенией значимо увеличивались концентрации сывороточных ДК на 98,7%, КД и СТ — на 99% и ШО — на 96% по медиане, в изорпопанольной фазе ДК — на 96%, КД и СТ — на 98% и ШО — на 86% по медиане. ОАС сыворотки в группе 3 через 6 месяцев значимо снизился на 73% по сравнению с группой 1.

Через 6 месяцев в группе 3 в гептановой фазе значимо увеличивались концентрации ДК, КД и СТ в сыворотке крови на 40% по медиане, в изопропанольной фазе экстракта ДК — на 53% по медиане, КД и СТ — на 74,5% и ШО — на 64%. Также в группе 3 в динамике шестимесячного наблюдения снижался ОАС в сыворотке (на 43% по медиане).

При использовании математического моделирования с применением критерия Спирмена выявлена значимая отрицательная взаимосвязь изменений минеральной плотности костной ткани в шейке бедренной кости и уровнем диеновых конъюгатов в гептановой фазе липидного экстракта сыворотки на старте исследования (табл. 4). Модель можно описать следующим уравнением:

х = 1,396 ‒ 0,62 × ДК (г),

где х — показатель МПК ШПОБК, ДК (г) — диеновые конъюгаты в гептановой фазе.

Метод линейного регрессионного анализа позволил сопоставить показатели окислительной деструкции липидов в костной ткани с показателями ПОЛ в сыворотке крови на момент начала наблюдения с помощью математического моделирования, что позволило отказаться от повторного исследования редокс-статуса костной ткани в динамике и исключить дополнительную медицинскую травматизацию пациентов, связанную с проведением трепанобиопсии гребня подвздошной кости. Модель можно описать следующим уравнением:

х = 0,5 ‒ 0,41 × КД и СТ (г) + 0,66 × ШО (г),

где х — концентрация диеновых конъюгатов в костной ткани в изопропанольной фазе, КД и СТ (г) — кетодиены и сопряженные триены в гептановой фазе, ШО (г) — основания Шиффа в гептановой фазе.

Согласно другой модели, уровни сывороточных диеновых конъюгатов в гептановой и оснований Шиффа в изопропанольной фазах экстракта на момент начала исследования имели значимую отрицательную взаимосвязь с уровнем МПК ПОПБК через 6 месяцев после начала наблюдения. Модель можно  описать следующим уравнением:

х = 2,39 ‒ 1,99 × ДК (г) ‒ 3,12 × ШО (и) + 0,27 × Остеопения,

где х — вероятность снижения МПК ПОБК (г/см²), ДК (г) — диеновые конъюгаты в гептановой фазе, ШО (и) — основания Шиффа в изопропанольной фазе. Признак наличия остеопении был включен в модель, так как улучшал качество прогноза, но не показал статистической значимости (1 — есть, 0 — нет).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Стандартизованным показателем при проведении остеоденситометрии считается Т-критерий, он представляет собой количество стандартных отклонений от максимальной МПК, используется у женщин в постменопаузе и мужчин старше 50 лет. Z-критерий представляет количество стандартных отклонений от среднего показателя МПК у лиц той же возрастной группы [8].

При ХЛЛ наиболее распространенной локализацией снижения МПК считается шейка бедренной кости. Однако при тяжелых стадиях заболевания изменения показателей МПК могут обнаруживаться в других областях скелета, включая позвоночник [4].

Механизм развития остеопении в той или иной локализации, вероятно, связан с негативным влиянием большого количества свободных радикалов, синтезируемых опухолевыми клетками, на молекулы белков и липидов и образованием продуктов вследствие их окислительной деструкции [10, 11].

Как известно, диеновые конъюгаты, кетодиены и сопряженные триены являются продуктами ранних стадий пероксидации липидов. Их концентрация отражает активность процессов ПОЛ и интенсивность окислительного стресса. Шиффовы основания не подвергаются метаболизму и являются маркерами дистрофических процессов в клеках и тканях. Биомаркерами окислительного стресса в тканях при ХЛЛ в настоящее время принято считать карбонильные остатки окисленных липидов, образующиеся после гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот, например 4-гидроксиноненаль или малоновый диальдегид [7]. Выживание клональных В-клеток связано с окислительным фосфорилированием (превращением АФК в менее вредные формы), усилением антиокислительной защиты, а именно активацией изоформ супероксиддисмутазы (SOD, SOD1 (Cu/Zn SOD), SOD2 (Mn-SOD)), системы тиоредоксина и ферментного каскада, индуцирующего биосинтез и рециркуляцию глутатиона [12]. АФК при ХЛЛ преимущественно синтезируются в митохондриях в отличие от других опухолей, где эту функцию выполняют НАДФН-оксидазы [12]. АФК буферизируются под действием антиоксидантных факторов, экспрессия которых находится под контролем факторов транскрипции, регулирующихся окислением и фосфорилированием [12].  Окислительный стресс рассматривают как основной механизм потери костной массы [13–15]. Окислительный стресс опосредованно, через активацию сигнальных путей (FGF23, Nrf-2, JNK, ERK1/2, NF-κB, RANKL/OPG) стимулирует дифференцировку остеокластов, влияет на пролифирацию и продолжительность жизни, снижает активность остеобластов и участвует в их апоптозе [15]. В частности, при избыточной экспрессии Nrf-2, активации гемоксигеназы-1 (НО-1) и RUNX2-зависимой транскрипционной активности при ХЛЛ снижается дифференцировка остеобластов [16, 17]. Так же механизм снижения минерализации костной ткани в условиях окислительного стресса связан с повышенной экспрессией FGF23 в костной ткани из-за апоптоза остеоцитов и остеобластов, активации митоген-активированных протеинкиназ (MAPK) [18, 19].

Как следствие, в результате окислительного стресса, индуцированного опухолью, зрелые остеокласты резорбируют костный матрикс, позволяя опухолевым клеткам расти и мигрировать в тканях. Дисфункция антиоксидантной защиты при ХЛЛ способствует апоптозу остеобластов и остеоцитов, вызывая еще большее снижение МПК, ведущее к остеопении и остеопорозу [20].

На основе полученных данных нами была создана компьютерная программа «Моделирование изменений минеральной плотности кости в зависимости от редоксстатуса у пациентов с хроническим лимфолейкозом», позволяющая спрогнозировать развитие остеопении или остеопороза у пациентов с ХЛЛ за период в 6 месяцев в зависимости от показателей ПОЛ сыворотки. Апробация данной модели по результатам наших исследований позволила продемонстрировать высокую чувствительность и специфичность созданной программы и имела высокое прогностическое значение. Практическое применение программы специалистами здравоохранения позволит выделить подгруппу пациентов с ХЛЛ у которых может возникнуть остеопения.

ВЫВОДЫ

У больных с ХЛЛ с частотой 29% выявляется остеопения по данным остеоденситометрии в шейке проксимального отдела бедренной кости.  В динамике шестимесячного наблюдения признаки остеопении определяются уже у 55% больных во всех локализациях инструментального исследования. У больных ХЛЛ и остеопенией в костной ткани наблюдаются признаки окислительного стресса: накапливаются в гептановой фазе липидного экстракта вторичные и конечные продукты, в изопропанольной фазе — конечные продукты окисления липидов, снижается общий антиоксидантный статус. Так же у пациентов с ХЛЛ и остеопенией констатирован системный окислительный стресс, который сопровождается повышенной концентрацией первичных и вторичных продуктов окислительной деструкции липидов в гептановой фазе, первичных, вторичных и конечных продуктов в изопропанольной фазе, сниженным общим антиоксидантным статусом в сыворотке крови. Через 6 месяцев относительно показателей на старте исследования зафиксировано прогрессирование окислительного стресса в сыворотке крови: увеличивается содержание первичных, вторичных и конечных продуктов окислительной деструкции липидов в гептановой и изопропанольной фазах, снижается общий антиоксидантный статус. Показатели редокс-статуса в сыворотке крови и костной ткани достоверно сопоставимы, а сывороточные показатели окислительного стресса могут использоваться для прогноза возникновения остеопении. Проведенное исследование может оказать влияние на выбор тактики ведения пациентов, подготовить лечебнопрофилактические мероприятия, например назначение антиоксидантной терапии или терапии бисфосфонатами.