Неонатальный скрининг на протяжении десятилетий доказывает свою эффективность в выявлении врожденных и наследственных заболеваний (ВНЗ) на раннем доклиническом этапе. 1 января 2023 г. в Российской Федерации (РФ) было положено начало массового обследования новорожденных. В настоящее время оно разделено на неонатальный скрининг (НС) и расширенный неонатальный скрининг (РНС). В регионах НС проводят для выявления пяти ВНЗ: фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, муковисцидоза, галактоземии, врожденной дисфункции коры надпочечников (ФКУ, ВГ, МВ, ГАЛ, ВДКН соответственно). РНС осуществляется на базе 10 межрегиональных центров РНС 3А уровня для диагностики 29 наследственных болезней обмена (НБО), спинальной мышечной атрофии (СМА) и тяжелых Т- и В-клеточных первичных иммунодефицитов (ПИД) [1].

Постановлением Правительства Республики Северная Осетия — Алания (РСО-Алания) утверждена региональная программа реализации НС и РНС, разработаны нормативные документы, регламентирующие данное исследование, определены лица, ответственные за проведение всех этапов скрининга, и организована маршрутизация пациентов в рамках существующей инфраструктуры.

Цель данной работы — оценить результаты НС и РНС в РСО-Алания в период с 01.01.2023 по 31.12.2024, выявить клинические и популяционно-генетические особенности скринируемых заболеваний.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

На I этапе скрининга забор капиллярной крови из пятки новорожденного осуществляют на вторые сутки жизни у доношенных и на седьмые сутки для недоношенных детей на два тест-бланка: один — с пятью пятнами крови для НС, второй — с тремя пятнами крови для РНС. Направление с сопроводительной информацией формируют с использованием модуля — Вертикально-интегрированная медицинская информационная система «Акушерство и Неонатология» (ВИМИС АКиНЕО). Данные о детях из группы риска в течение суток передают ответственным за организацию РНС в субъекте. В последующие 48 ч у детей из группы риска организовывают повторный забор биоматериала и его направление для подтверждающей диагностики в референсный центр 3Б уровня — ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени Н. П. Бочкова» (МГНЦ), где устанавливают точный диагноз ВНЗ или его исключают [2].

Первичное обследование детей, родившихся на территории РСО-Алания, в рамках НС проводят на базе Медико-генетической консультации (МГК) РДКБ МЗ РСО-Алания. Определение уровней биохимических маркеров в образцах цельной крови осуществляется методом иммунофлюоресценции с разрешением по времени с использованием реактивов «DELFIA Neonatal» (Финляндия) и ФАВР (Россия) на оборудовании «Wallak» (Финляндия). Уровень флюоресценции измеряют на приборе «Виктор-2» (Wallak, Финляндия). Результаты измерений поступают в компьютерную программу для обработки и получения данных. Для установления диагноза значения биохимических маркеров должны быть следующими: фенилаланин (ФА) > 2 мг% — для диагностики ФКУ; тиреотропный гормон (ТТГ)  > 20 мкМЕ/л — для ВГ, иммунореактивный трипсин (ИРТ) > 70 нг/мл — для МВ, 17-оксипрогестерон (17-ОПГ) > 30 нмоль/л — для доношенных и > 60 ммоль/л — для недоношенных для ВГКН, галактоза  > 400 нмоль/л (7 мкмоль/л) — для ГАЛ.

Первичное обследование в рамках РНС осуществляют на базе МГК ГБУЗ «Научно-исследовательский институт — Краевая клиническая больница № 1 имени профессора С. В. Очаповского» Министерства здравоохранения Краснодарского края (МГК ГБУЗ «НИИ — ККБ № 1»): на НБО (в том числе и ФКУ) — методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС); на СМА и ПИД — путем проведения исследования на качественное выявление гомозиготной делеции экзона 7 гена SMN1 и количественное определение ДНК TREK, KREK — тестсистемой Неоскрин SMA/TREK/KREK («ДНК-Технология ТС», Россия).

На II этапе обследования в МГНЦ должны быть предоставлены необходимые образцы биоматериала:

• для НБО — сухие пятна крови на тест-бланке, жидкая кровь в пробирке с ЭДТА (незамороженная, не менее 2,5 мл) и моча (не менее 5 мл);
• для СМА — сухие пятна крови на тест-бланке, жидкая кровь в пробирке с ЭДТА (незамороженная, не менее 2,5 мл);
• для ПИД на I этапе — сухие пятна крови на тест-бланке, на II этапе — жидкая кровь в пробирке с ЭДТА (незамороженная, две пробирки) для иммунофенотипирования и ДНК-диагностики.

Подтверждающую диагностику осуществляют с помощью повторного анализа аминокислот и ацилкарнитинов методом МС/МС, определения уровня органических кислот мочи — методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ-МС)  и проведением ДНК-диагностики. На втором этапе обследования на ПИД проводят иммунофенотипирование (ИФТ) на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева Министерства здравоохранения Российской Федерации (НМИЦ ДГОИ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В течение исследуемого периода в республике родилось 15 153 ребенка. Подлежало обследованию с учетом умерших до сроков забора 15 059. Родители 65 новорожденных подписали информированный отказ от скрининга, и забор крови осуществлен у 14 994 детей. Обследованием было охвачено 99,56% новорожденных.

Во всех 14 994 случаях на I этапе проведена тандемная масс-спектрометрия, из них в 355 случаях (2,36%) результаты скрининга оказались положительными.

Как в регионе с высоким этнокультурным разнообразием и тесными связями с кавказскими и закавказскими территориями в республике традиционно рождается большое количество детей, переезжающих затем в другие регионы РФ (Чеченская Республика, Республика Ингушетия, Ставрапольский край и др.) и за ее пределы (Южная Осетия, Грузия, Армения и т. д.). В связи с этим в 31 (8,8%) случае информация о результатах обследования в рамках РНС была передана ответственным лицам по реализации скрининга в соседние субъекты РФ. С учетом этого на II этапе обследовано 324 из 355 новорожденных, что составило 91,2%.

Исследование на аминоацидопатии

В связи с тем что обследование на ФКУ проводили в рамках НС биохимическим методом и в рамках РНС методом МС/МС, у нас появилась возможность сравнить данные проводимых исследований и сделать вывод о большей информативности МС/МС для выявления ФКУ.

По данным ДНК-диагностики выявлены изменения в нуклеотидной последовательности гена РАН, характерные для ФКУ, в гомо- или компаунд-гетерозиготном состоянии у 13 пациентов. Частота встречаемости ФКУ по результатам тандемной масс-спектрометрии составила 1 : 1165 родившихся и 1 : 1153 обследованных новорожденных (95%-й ДИ: 1 : 675 – 1 : 2166). Все дети состоят на «Д»-учете у врачадиетолога МГК. Определение уровня ФА в динамике и определение тактики лечения осуществляют в соответствии с Федеральными клиническими рекомендациями. Только двое из них нуждаются в специализированных продуктах лечебного питания (СПЛП), у остальных пациентов показатели ФА не превышают 6 мг% (360 мкМ/л) [3].

Биохимические и молекулярно-генетические характеристики выявленных пациентов представлены в табл. 1.

Наиболее распространенной оказалась «тяжелая» мутация c.842C>T (p.Pro281Leu), при которой остаточная активность фермента PAH составляет 2%, количество гетерозиготных аллелей — 6, гомозиготных — 0. Среди общей выборки частота встречаемости — 23%, среди представителей осетинской национальности — 27%.

Вторым по частоте генетическим вариантом был c.529G>A (p.Val177Met),  данных по активности PAH в литературе не представлено, частота гетерозиготного носительства — 5, что составило 19% в общей выборке и 22% среди титульной нации.

На третьем месте оказались два варианта: «тяжелая» мутация c.1222C>T (p.Arg408Trp) (остаточная активность PAH — 2%) и «мягкая» с.631C>A (p.Pro211Thr) (остаточная активность РАН — 72%): по одному гомозиготному случаю и по два гетерозиготных носительства. На их долю пришлось по 15% от общей выборки и по 18% среди осетин.

Остальные варианты встречаются в единичных гетерозиготных вариантах и демонстрируют высокую остаточную активность белка PAH. Пациенты не нуждаются в диетотерапии, в связи с чем мутации могут быть классифицированы как «мягкие» [4, 5]. Так из 13 пациентов только двое (15,3%), имеющие генотипы с двумя тяжелыми мутациями (R408W/R408W и P281L/R408W), нуждаются в диетотерапии.

Нарушения митохондриального β-окисления жирных кислот

По результатам данных МС/МС и ДНК-диагностики 19 пациентам установлен диагноз из группы наследственных нарушений митохондриального β-окисления жирных кислот (НОЖК): недостаточность ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот со средней длиной углеродной цепи (МСАDD).

Частота встречаемости данной патологии в РСО-Алания составила 1:789 (95%-й ДИ: 1 : 506 – 1 : 1310). Данные МС/МС и молекулярно-генетические характеристики пациентов с МСАDD представлены в табл. 2.

У 20 новорожденных на II этапе диагностики выявлены значения ацилкарнитинов, превышающие референсные, однако в случае 18 выявлена одна гетерозиготная мутация c.985A>G (p.Lys329Glu), в отношении данной семьи запланировано проведение полного секвенирования генома в формате «трио», и в дальнейшем обсуждении этот случай не учитывается.

Из 19 пациентов с двумя верифицированными мутациями 16 являются осетинами и родились не в близкородственных браках. Пациенты 15 и 16 — монозиготные близнецы, родители по национальности — русские. Пациент 12 рожден в межэтническом браке между осетином и табасаранкой.

Вариант c.388-19T>A представлен в пяти случаях в гомозиготном состоянии. Также было выявлено 11 компаундгетерозиготных носителей, что составило 55,26% в общей выборке и около 65,62% среди представителей титульной нации.

Второй по частоте вариант с.985A>G (p.Lys329Glu) представлен у одного пациента в гомозиготном состоянии и в четырех случаях выявлен в виде гетерозиготного носительства, что составило 15,78% в общей выборке и 18,75% среди осетин.

Третий по частоте вариант c.134А>С (p.Gln45Arg) зарегистрирован в четырех случаях в компаундгетерозиготном состоянии и составил 10,52 и 12,5% в общей и титульной группе соответственно.

Остальные варианты встречаются единично и составляют 18,44% в общей группе и 3,13% среди осетин.

Следует отметить, что наиболее выраженные изменения уровней С6, С8 и С10 (от 9 до 22 мкмоль/л) наблюдались при генотипах, содержащих варианты c.985A>G (p.Lys329Glu) и c.388-19T>A — как в гомозиготном состоянии, так и в компаунд-гетерозиготном состоянии.

Все дети состоят на «Д» учете в МГК у врача-диетолога и генетика. Определение уровня ацилкарнитинов методом МС/МС в динамике проводят в соответствии с общепринятыми рекомендациями, состояние детей стабильно, метаболических кризов, гипогликемических состояний не наблюдалось. В рамках дополнительного соглашения между РДКБ РСО-Алания и МГНЦ имени Н. П. Бочкова родителям выявленных пациентов, проведено секвенирование по Сэнгеру в формате «трио», родители являются здоровыми носителями выявленных вариантов. В ходе медико-генетического консультирования семей проведены беседы о профилактике длительных голодных пауз, особенно на фоне интеркуррентных инфекционных заболеваний, с целью недопущения развития метаболических кризов, а в случаях их возникновения — о необходимости срочной госпитализации в стационар РДКБ и в/в капельного введения растворов глюкозы [4, 6].

Еще один случай выявления заболевания из группы органических ацидурий — диагностика недостаточности 3-метилкротонил-КоА-карбоксилазы у ребенка кумыкской национальности с мутацией в гене МССС2 с.1082G>A (p.Arg361Gln) в гомозиготном состоянии. Состояние ребенка стабильное, развитие соответствует возрасту. Состоит на «Д» учете у диетолога МГК РДКБ.

Исследования на спинальную мышечную атрофию

За исследуемый период на I этапе РНС в группу риска вошли пять новорожденных, из них диагноз СМА установлен в трех случаях. Частота СМА составила 1 : 4998 новорожденных (95%-й ДИ: 1 : 1711 – 1 : 24235), что в целом сопоставимо с данными мировой и отечественной литературы. Распространенность СМА в мире в среднем составляет 1 : 6000 – 1 : 10000 новорожденных, в Саудовской Аравии — 1 : 7000, в Египте и Ливии — 1 : 12 500, в РФ — 1 : 5184 [7]. Диагностику СМА осуществляют в соответствии с имеющимися диагностическими алгоритмами в рамках клинических рекомендаций [8].

В табл. 3 представлены результаты обследования пациентов со СМА и назначенная терапия.

По результатам обследования и в соответствии с рекомендациями федерального консилиума ФГАУ «НМИЦ Здоровья детей» МЗ РФ двум пациентам введен препарат онасемноген абепарвовек  в возрасте 1,5 месяцев и 1 месяц, а в одном случае рекомендован рисдиплам.

Пациенты состоят на диспансерном учете у невролога и генетика.

Исследования на первичные иммунодефицитные состояния (ПИД)

За исследуемый период в регионе диагноз ПИД не диагностирован ни у одного ребенка, при этом на I этапе РНС выявлено 30 случаев низкого уровня TREK/KREK, из них семь детей умерли до момента повторного забора крови или, в случае недоношенности, в последующем, до достижения постконцептуального возраста 37 недель. В 23 случаях в рамках дальнейшего планового обследования все показатели были в пределах референсных значений. Частота встречаемости ПИД в регионе предположительно реже, чем 1 : 14 994 новорожденных (95%-й ДИ: 0 – 1 : 4065).

Исследование в рамках неонатального скрининга на пять ВНЗ

Исследование проведено в 14 994 случаях. Мы освещали и ранее эпидемиологические и молекулярно-генетические характеристики скринируемой патологии РСО-Алания [9]. Представленные значения, полученные в ходе традиционного биохимического скрининга, подтверждают ранее полученные результаты по ВГ, МВ, ГАЛ и ВГКН. В табл. 4 представлены результаты двухлетнего исследования в рамках НС на базе МГК РДКБ РСО-Алания, которые демонстрируют низкую выявляемость ФКУ по НС по сравнению с данными РНС.

Сравнение НС и РНС в диагностике ФКУ демонстрирует более высокую чувствительность МС/МС, способствующую выявлению больных с мягкими формами ФКУ, с подтвержденными генетическими вариантами в гене РАН, которые нуждаются в мониторировании и диспансерном наблюдении.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Аминоацидопатии

В рамках РНС представилась возможность исследовать в формате МС/МС, в числе прочих 28 показателей, и уровень ФА. Полученные данные кардинально изменили имеющиеся представления о популяционно-генетических особенностях ФКУ в регионе. Так, в 2012 г. частоту встречаемости ФКУ в республике интерпретировали как 1 на 23 000 новорожденных. Это свидетельствовало о редкой распространенности данной патологии в регионе, так как диагноз ФКУ рассматривали как вариант тяжелой гиперфенилаланинемии (ГФА) при уровне ФА более 10 мг%, при котором обязательно назначают диетотерапию [10]. В последующем, в процессе сотрудничества с МГНЦ у нас появилась возможность проведения ДНКдиагностики всем детям, выявленным по скринингу (уровень ФА выше 2 мг%) и состоящим на учете с диагнозом ГФА. По результатам исследования частота встречаемости всех форм ФКУ оказалась в соотношении 1 : 4864 (95%-й ДИ), при этом частота случаев с тяжелыми вариантами, требующими диетотерапии, составила 1 : 22374 (95%-й ДИ), легкими формами — 1 : 6216 (95%-й ДИ). Специфическим оказался и спектр выявленных молекулярногенетических особенностей данной патологии в связи с распространенностью двух мутаций c.842C>T (p.Pro281Leu) (остаточная активность ФАГ — 0–2%) и c.631C>A (p.Pro211Thr) (остаточная активность ФАГ 72%), которые нигде в мире не встречаются с такой частотой. Также ранее нами было зафиксировано носительство мутаций p.Pro281Leu и p.Pro211Thr в популяции с частотой 1 : 26 (95%-й ДИ), что позволяло предположить гораздо более высокую распространенность данной аминоацидопатии в РСО-Алания [5, 10], что и было подтверждено результатами РНС.

По итогам двухлетнего исследования в рамках НС выявлено пять случаев ФКУ, а в рамках РНС доказан факт высокой распространенности мягких форм ФКУ в регионе — 1 на 1363 (95% ДИ) новорожденных, высокой частоты всех форм ФКУ — 1 :  1153 (95%-й ДИ) и 1 : 7497 (95%-й ДИ) для тяжелых форм, при которых были зарегистрированы варианты двух тяжелых мутаций.

Органические ацидурии

Распространенность MCAD-дефицита в странах Европы и США, по разным сведениям, составляет 1 : 8300 – 1 : 15000 новорожденных. Распространенность данной патологии по результатам нашего исследования составила 1 : 789 обследованных новорожденных. Согласно литературным данным, частота этого НБО в мире составляет: 1 : 22 000 в Чехии, 1 : 27 139 в Норвегии, более высокая частота представлена в Германии от 1 : 4900 до 1 : 8500, в Италии — 1 : 23 000, в США от 1 : 10 000 до 1 : 30 000, а наибольшая частота представлена в Катаре — 1 : 4000 [11–12]. Точные эпидемиологические данные по России не опубликованы, но предварительные расчеты не выявили значимых особенностей [4].

В 90–95% случаев встречается точечная мутация в 11-м экзоне, при которой аденин заменяется на гуанин в 985 положении данного гена (c.985A>G). Описаны также другие генетические варианты, встречающиеся гораздо реже [13–16]. Показана высокая распространенность носительства варианта c.985A>G в странах Европы (1 : 52 в Швейцарии, 1 : 58 в Великобритании) и снижение ее с севера на юг, что, возможно, обусловлено «эффектом основателя» в древней германской  популяции [17].

Клиническая картина заболевания весьма вариабельна — от бессимптомной до быстро развивающейся тяжелой [6, 18].

По данным, полученным в ходе реализации РНС, в регионе был выявлен уникальный спектр вариантов в гене ACADM. Так, самый распространенный по данным мировой и отечественной литературы [4, 15, 19, 20] вариант c.985A>G (p.Lys329Glu), в нашем исследовании был зарегистрирован лишь в одном случае в гомозиготном состоянии и в четырех случаях — в виде компауд-гетерозиготного состояния, т. е. составил всего лишь 15,78% в общей выборке и 18,75% среди осетин. Тогда как вариант c.388-19T>A оказался наиболее распространенным в исследуемой популяции: 55,26% в общей выборке и около 65,62% — среди представителей титульной нации. Этот вариант отсутствует в популяционных базах данных (gnomAD без частоты). В ClinVar присутствует описание этой мутации и ссылка на два исследования из большого количества публикаций в мировой литературе, где упоминалась данная патология [16, 21].

Впервые вариант с.388-19T>A описан в 2012 г. по результатам крупного Датского исследования, посвященного MCADD, как ранее не зарегистрированный и выявленный по результатам скринингового обследования у двух новорожденных с генотипом c.388-19T>A/c.244_245dup (не являющихся родственниками) [21]. Доказано, что мутационные изменения последовательности происходят в интроне 5 гена ACADM. Они резко снижают силу акцепторных сайтов сплайсинга дикого типа, одновременно создавая новые конкурирующие, более сильные акцепторные сайты сплайсинга, которые вызывают серьезные нарушения расщепления, вплоть до деградации мРНК в результате нонсенс-опосредованного распада и напрямую изменяют кодируемую аминокислотную структуру белка ACADM.

В настоящее время все выявленные пациенты не достигли трехлетнего возраста, но метаболические кризы ни у одного из них не зафиксированы. Возможно, это связано с мягким вариантом выявленных мутаций и профилактическими действиями родителей в отношении недопущения длительных голодных пауз.

Следует отметить тот факт, что в доскрининговый период ни одного случая MCADD в республике не выявлено, но пациенты с гипогликемическими состояниями, неясными метаболическими кризами, особенно на фоне респираторных или острых кишечных инфекционных заболеваний, конечно же, встречались в практике детских эндокринологов, педиатров, инфекционистов и реаниматологов, но причины данных состояний не верифицировались в связи с отсутствием возможности проведения МС/МС в регионе и недостаточной настороженностью врачей в отношении данной патологии.

Весьма интересным, на наш взгляд, является случай редкого сочетания ФКУ и MCADD у одного пациента (№ 6 в табл. 1 и № 3 в табл. 2), который в силу наличия «мягких» мутаций по обеим нозологиям не нуждается в диетотерапии с ограничением поступления ФА и у которого не наблюдается метаболических кризов.

ВЫВОДЫ

В целом реализацию НС и РНС в РСО-Алания можно признать эффективным методом ранней доклинической диагностики ВНЗ, который считают результативным при выявлении 0,1% патологии из всей когорты обследованных детей. В нашем исследовании 37 установленных диагнозов составляют 0,25% от всех детей, охваченных скринингом на I этапе, что однозначно свидетельствует об успешности и результативности данной программы. Продемонстрирована более высокая чувствительность МС/МС в выявлении мягких форм ФКУ по сравнению со стандартным биохимическим методом, используемым в НС. С одной стороны, при проведении диагностики в формате тандемной масс-спектрометрии значительно снизился процент ложноположительных результатов, с другой стороны — повысилась выявляемость данной патологии даже на фоне показателей ФА, незначительно превышающих нормативные значения. В ходе исследования удалось также верифицировать спектр мутаций, характерных для ФКУ и MCADD, и определить их распространенность в регионе. Частота всех форм ФКУ составила 1 : 1153 новорожденных, а частота MCADD — 1 : 789 новорожденных. Возможности, которые предоставляются научному сообществу и практикующим специалистам по мере развития научно-технического прогресса, в частности внедрение РНС, напрямую влияют на эволюцию наших взглядов в отношении спектра мутаций ВНЗ и их популяционно-генетических особенностей в разных этнических группах. Комплексное обследование пациентов и их родителей в рамках РНС не только способствует доклинической диагностике и своевременному началу лечения редких заболеваний, которые до сих пор оставались не диагностированными, но и позволяет в рамках медико-генетического консультирования информировать родителей больного ребенка в отношении дальнейшего планирования семьи и профилактики распространения ВНЗ в популяции.