Рекомбинантные хромосомы (rec) выявляются у потомства носителей таких сбалансированных структурных хромосомных перестроек (ХП), как инверсии и инсерции, и сопровождаются изменением количества генетического материала — вариациями числа копий участков ДНК (copy number variations, CNV) в виде делеций и дупликаций, ассоциированных с аномальным фенотипом [1, 2]. 

Большинство патогенных микроделеций и микродупликаций представляют собой рекуррентные CNV, возникновение которых связано с особенностями геномной архитектуры и приводит к формированию спорадических случаев хромосомного дисбаланса [3]. В отличие от этого, нерекуррентные CNV могут быть следствием и других механизмов формирования, например, рекомбинационных событий в мейозе I у фенотипически нормальных гетерозиготных носителей инверсий, а также интра- и интерхромосомных инсерций. Межплечевая интрахромосомная инсерция представляет собой сегмент хроматина одного плеча, вставленный в точку разрыва другого плеча [4]. Так, после формирования бивалента между хромосомой с межплечевой инсерцией и ее нормальным гомологом инсертированный сегмент разворачивается таким образом, чтобы обеспечить максимальную степень синапсиса бивалента.  Один или любое нечетное число кроссинговеров в центромерном сегменте (часть хромосомы, содержащая центромеру) приведет к образованию рекомбинантных хромосом: одной с дупликацией инсерционного сегмента, а другой с делецией. Гаметы (впоследствии зиготы) с рекомбинантными хромосомами приводят к образованию интерстициальных CNV у потомства (рис. 1).

Вклад сбалансированных внутрихромосомных инсерций в структуру хромосомной патологии значителен, поскольку теоретический риск формирования гамет с рекомбинантными хромосомами и риск рождения ребенка с хромосомным дисбалансом в семье носителя могут достигать 50%, что имеет ключевое значение для медикогенетического консультирования [4, 5].

На этом фоне особый интерес представляет хромосома 22, отличающаяся высокой концентрацией низкокопийных повторов (LCR), что предрасполагает к формированию широкого спектра сбалансированных и несбалансированных ХП в результате неаллельной гомологичной рекомбинации (NAHR) [6]. Наиболее изучены синдромы реципрокных делеции и дупликации 22q11.2, известные также как сестринские геномные болезни [7, 8]. Но важно отметить, что особую ценность демонстрируют нерекуррентные CNV на хромосоме 22, так как такие случаи раскрывают сложные и разнообразные механизмы структурной организации генома, включая репликационноопосредованные и многоступенчатые геномные события, и могут быть представлены множественными участками хромосомного дисбаланса [9, 10]. Такие наблюдения не только расширяют представления о структурной вариабельности хромосомы 22, но и имеют практическое значение для медико-генетического консультирования, особенно при выборе тактики пренатальной и преимплантационной диагностики в семьях с больным ребенком [11].

В настоящей работе мы представляем уникальный случай рекомбинантной хромосомы 22 у пациента с аномальным фенотипом. Цель исследования — молекулярно-цитогенетическая характеристика редкой rec(22) с тремя интерстициальными дупликациями вследствие мейотического кроссинговера в гаметогенезе матери-носительницы сложной интрахромосомной перестройки.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Клинические данные

Пациентка — девочка 7 месяцев, направлена на обследование в медико-генетический научный центр им. Н. П. Бочкова в связи с задержкой психомоторного развития и особенностями фенотипа (черепно-лицевые дизморфии). В семье есть старший ребенок — девочка 5 лет — без видимых клинических проявлений, здорова (со слов родителей). Родители здоровы, брак некровнородственный, в гинекологическом анамнезе — две замершие беременности (рис. 2А).

Роды на 36-й неделе беременности. Оценка по шкале Апгар — 7/7 баллов. Масса тела при рождении составляла 2260 г, длина тела — 45 см, окружность головы — 32 см. После рождения ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных с диагнозом церебральная ишемия 1–2-й степени, синдром двигательных нарушений. С рождения отмечались задержка моторного развития, двусторонняя тугоухость. На момент первого осмотра (в возрасте 7 месяцев) были отмечены следующие фенотипические особенности: глазной гипертелоризм, обратный эпикант, укороченные глазные щели, закругленный кончик носа, трапецевидная верхняя губа, удлиненный фильтр, высокое небо, длинные пальцы рук. Рост/вес: 68 см (50–75 перцентиль)/6000 г (<3 перцентиля). Моторное развитие с грубой задержкой: ребенок удерживал голову только в положении лежа на животе, не переворачивался. Повторный осмотр был проведен в 2 года, у пациентки сохранилась выраженная задержка моторного развития: села в 1,5 года, стоит и переступает у опоры с 2 лет. Навыки самообслуживания не сформированы, речевое развитие с легкой задержкой — говорит несколько простых слов.

Молекулярно-цитогенетические исследования

Для детекции CNV был проведен хромосомный микроматричный анализ образца ДНК периферической крови пациента, выполненный с использованием олигонуклеотидных микроматриц CytoScan HD Array (Affymetrix, Santa Clara, США) в соответствии с протоколами производителя. Анализ вариаций числа копий геномных участков проводили с помощью программного обеспечения Chromosome Analysis Suite (ChAS), версия 4.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.; США), а результаты интерпретировали в соответствии с Международной системой цитогеномной номенклатуры (ISCN, 2020). Выявленные CNV сопоставляли с данными, опубликованными в научной литературе, а также с информацией из общедоступных баз данных: Database of Genomic Variants (DGV) (http://dgv.tcag.ca/dgv/ app/home), DECIPHER (http://decipher.sanger.ac.uk/) и OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim). Геномные координаты представлены в соответствии со сборкой Human Genome February 2009 (GRCh37/hg19). Оценку клинической значимости вариантов проводили в соответствии со стандартами American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) [12].

FISH с коммерческими ДНК-зондами проводили на хромосомных препаратах из культивированных лимфоцитов периферической крови c локус-специфичным (22q11.2 LSI TBX1/ 22q13 SHANK3) и субтеломерным (Subtelomere 22qter) ДНК-зондами (Kreatech, Нидерланды), а также с ДНК-зондом, специфичным для коротких плеч акроцентрических хромосом (Acro-p) (MetaSystems, Германия) по соответствующим протоколам фирмпроизводителей. Денатурацию и гибридизацию проводили с использованием гибридизационной системы ThermoBrite (StatSpin, США), анализ — с помощью эпифлуоресцентного микроскопа «AxioImager M.1» (Carl Zeiss, Германия) и компьютерной программы обработки цифровых изображений «Isis» (MetaSystems, Германия).

Важным этапом исследования была разработка несерийных ДНК-зондов с целью уточнения структуры рекомбинантной хромосомы 22 у пациента и обследования родителей. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer-BLAST NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/) и базы данных UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu). Для проверки специфичности выбранных праймеров использовали программу OligoAnalyzer™ Tool (https://eu.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer/). Праймеры были синтезированы в ЗАО «Евроген» (Россия). Нуклеотидные последовательности подобранных ДНК-праймеров представлены в таблица.

С помощью последовательностей подобранных ДНК-праймеров проводили LR-ПЦР с использованием набора BioMaster LR HS-PCR (2x) («БиолабМикс», Россия) на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя. Полученные ампликоны очищали на колонках с использованием набора diaGene для очистки ДНК из реакционных смесей (Диаэм, Россия) согласно инструкции производителя, с последующим объединением в одну пробирку очищенных продуктов ПЦР для получения ДНК-зонда размером 30 т.п.н. С целью введения флуоресцентной метки в ДНК-зонд использовали метод nick-трансляции. Для проведения FISH с несерийными ДНК-зондами использовали раздельную денатурацию ДНК на хромосомном препарате и ДНК-зонда [13–15].

Для контрокрашивания хромосом использовали DAPI I (Abbott Molecular, США) в растворе Vectashield (Vector Labs, США) в соотношении 1:20. Для анализа изображений метафазных хромосом применяли программу обработки цифровых изображений Isis (MetaSystems, Германия), установленную в комплексе с эпифлуоресцентным микроскопом AxioImager M.1 (Carl Zeiss, Германия).       

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе молекулярно-цитогенетического обследования пациентки с задержкой моторного и психоречевого развития, черепно-лицевыми дизморфиями и тугоухостью провели ХМА, при котором выявили три интерстициальные микродупликации, локализованные на длинном плече хромосомы 22: arr[hg19] 22q11.21(18037572_21915207)x3,22q12.3q13.1(36793141_ 40756125)x3,22q13.2(41818449_43449759)x3 (рис. 2Б) размером 3,9 млн.п.н, 4 млн.п.н. и 1,6 млн.п.н. соответственно.

С целью верификации полученных данных проводили FISH-анализ хромосомных препаратов пациентки, родной сестры и их родителей с коммерческим ДНКзондом на хромосомный локус 22q11.21 (ген TBX1). Установлено, что мать пациентки является носительницей внутрихромосомной межплечевой инсерции участка 22q11.2 в район ядрышкового организатора (р12) (рис. 2В). Таким образом, дупликация, включающая ген TBX1, является следствием материнского меойтического кроссинговера в центромерном сегменте хромосом 22, что привело к формированию такой рекомбинантной хромосомы 22 у пациентки (рис. 2Г). При обследовании бабушки и дедушки по материнской линии инсерцию не выявили, что позволяет заключить, что хромосомная перестройка у матери была сформирована de novo.

Для верификации второй и третьей микродупликации была выдвинута гипотеза о существовании «единой» дупликации в регионе 22q12.3q13.2. Для этой задачи были разработаны несерийные локус-специфичные ДНКзонды на два участка хромосомы 22: (hg19): 36,911,962– 36,938,387 и (hg19):41,525,966–41,555,314. Дизайн праймеров представлен в таблица. Проведенный FISH-анализ показал наличие у матери и внутрихромосомной инсерции области q12.3q13.1 в район ядрышкового организатора (р12) хромосомы 22 (рис. 3Б). Таким образом, рекомбинантная хромосома 2 у пациентки содержит не только дупликацию, включающую ген TBX1 (22q11.2), но и дупликацию q12.3q13.1 материнского происхождения (рис. 3В).

На основании полученных данных была выдвинута гипотеза о сложном механизме формирования хромосомной перестройки у матери пациентки. Между первой (22q11.21) и второй (22q12.3) дупликациями у пробанда была выявлена протяженная область дисомии размером 14,9 млн.п.н. (рис. 3А).  Это позволило предположить, что у матери в длинном плече хромосомы 22 районы q11.21 и q12.3q13.1 могли оказаться рядом вследствие парацентрической инверсии (chr22( hg19):18,037,572–36,793,141). Поэтому обе эти области вместе были инсертированы в район ядрышкового организатора (р12) хромосомы 22 как следствие первоначальной de novo перестройки в мейозе одного из ее родителей, кариотипы которых были исследованы и оказались нормальными. Для верификации этой гипотезы были дополнительно разработаны еще два несерийных локус-специфичных ДНК-зонда на регионы q11.23 и q12.3 хромосомы 22 (chr22(hg19):24,426,053–24,452,928 и chr22 (hg19):34,120,020–34,162,291 (таблица). Схема сложной хромосомной перестройки представлена на рис. 4.

В результате комплексного молекулярноцитогенетического анализа с использованием как комерческих, так и несерийных ДНК-зондов гипотеза сложного механизма формирования хромосомной перестройки у матери была подтверждена. Показано, что у пациентки рекомбинантная хромосома 22 с двумя микродупликациями явилась следствием двух последовательных событий в материнском мейозе: инициирующей парацентрической инверсией 22q11.21q12.3 и последующей межплечевой инсерцией районов 22q11.21 и 22q12.3q13.1 в область ядрышкового организатора 22p12. В рамках настоящей работы исследование третьей дупликации не проводилось, изучение планируется продолжить с целью объяснения полного механизма формирования сложной ХП у матери пациентки.

Таким образом, сочетание ХМА и FISH c коммерческими и несерийными ДНК-зондами позволило визуализировать механизм формирования хромосомного дисбаланса. Согласно родословной семьи, включающей три поколения, эмпирический риск повторного рождения ребенка с хромосомным/геномным дисбалансом или спонтанного прерывания беременности оценивается в 75%, что является высоким генетическим риском (рис. 2А).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Представленный случай демонстрирует редкий пример формирования рекомбинантной хромосомы 22 вследствие мейотической сегрегации сложной материнской внутрихромосомной перестройки — сочетания инверсии и инсерции. Похожие механизмы ранее описывались в исследованиях rec(22), возникающих вследствие материнских внутрихромосомных перестроек. Так, описаны случаи rec(22), при которых материнские внутрихромосомные инверсии приводили к дупликации дистальных участков 22q у потомства [16, 17]. Есть сообщение о пациентке с дупликацией 22q13.1q13.2, размером 7 млн.п.н., которая оказалась продуктом материнской инсерции [18]. Наш случай дополняет эти наблюдения, демонстрируя возможность образования рекомбинантной хромосомы 22 с несколькими CNV в результате наследования материнской комплексной внутрихромосомной межплечевой инсерции в сочетании с инверсией.

Акроцентрическая хромосома 22 является одной из самых коротких хромосом человека и при этом имеет самую высокую плотность LCR в ее длинном плече.

LCR представляют собой блоки ДНК размером 10–400  т.п.н., имеющие высокую степень (95–97%) идентичности нуклеотидных последовательностей, вследствие чего в этих районах происходит неаллельная гомологичная рекомбинация (НАГР), лежащая в основе типичных делеций и дупликаций 22q11.2 [6, 19]. Оптическое геномное картирование подтвердило значительную вариабельность LCR22 в популяции, что повышает вероятность нерекуррентных и сложных хромосомных перестроек [20]. В то же время для объяснения сложных многоэтапных событий, подобных описанному нами, полагают, что имеют место и другие, репликационно-опосредованные механизмы их формирования, а именно остановка вилки репликации и переключение микроматрицы (Fork Stalling and Template Switching -FoSTeS) или репликация, индуцированная микрогомологией в точках разрыва (Microhomology-Mediated Break-Induced Replication (MMBIR) [3, 9, 10, 21].

В нашем случае у матери выявлена сложная внутрихромосомная перестройка: сочетание инициирующей парацентрической инверсии 22q11.21q12.3 (с координатами chr22(hg19):18,037,572–36,793,141) и последующей межплечевой инсерции районов 22q11.21 и 22q12.3q13.1 в область ядрышкового организатора 22p12. Проксимальная точка разрыва инверсии локализуется в зоне LCR22 A–B (~18–21 млн.п.н.), являющейся одной из «горячих точек» геномной нестабильности, приводящей к хромосомным перестройкам, опосредованным НАГР. Инверсии, охватывающие блоки низкокопийных повторов LCR22A–B или LCR22B–D/C, по данным литературы способны инициировать нерекуррентные хромосомные перестройки [6, 22]. Дистальная точка разрыва инверсии в длинном плече хромосомы 22 (~36,8 млн.п.н.) выходит за пределы классических LCR22 и расположена в области уникальных последовательностей 22q12.3, что делает вероятным участие репликационно-опосредованных механизмов (FoSTeS/MMBIR) [21–23]. Инсерция протяженного хромосомного участка 22q в короткое плечо хромосомы 22 (22p) тоже объяснима. Известно, что p-плечи акроцентрических хромосом, содержащие район ядрышкового организатора (ЯОР) и многочисленные блоки повторов — динамичные регионы генома [24]. Таким образом, сочетание инверсии с участием LCR22 и инсерции в ЯОР-область 22p формирует уникальный структурный фон, способный приводить к множественным дупликациям при мейотической сегрегации.

Наш случай расширяет спектр ранее описанных rec(22) и демонстрирует, что при сложной материнской ХП возможно формирование нескольких интерстициальных дупликаций у потомства. Этот механизм объединяет два ключевых момента — вариабельную архитектуру генома вследствие обогащенности хромосомы 22 блоками низкопийных повторов ДНК с одной стороны, и динамичность рибосомных повторов района ядрышкового организатора ее короткого плеча, с другой стороны.

Клинические проявления у нашего пациента с множественными CNV на хромосоме 22 включают задержку моторного и психоречевого развития, краниофациальные дизморфии, гипотонию и тугоухость, соответствующие фенотипическому спектру 22q11.2 дупликационного синдрома, для которого характерны задержка развития, поведенческие расстройства, нарушения слуха, черепнолицевые аномалии и вариабельная степень когнитивных нарушений. Аномалии фенотипа при дупликации 22q11.2 отличаются выраженной гетерогенностью, что связывают как с дозозависимыми эффектами ключевых генов, включая TBX1, так и с влиянием дополнительных дуплицированных сегментов 22q12–q13, которые могут вносить вклад в нейроразвитие и слуховую функцию [8, 25, 26].

С точки зрения методологии, представленный случай подчеркивает необходимость комплексного цитогеномного анализа. Стандартное кариотипирование не позволяет выявлять CNV размером менее 10 млн.п.н., поэтому в данном исследовании ключевую роль сыграли ХМА и FISH. ХМА продемонстрировал наличие трех интерстициальных микродупликаций, однако не дал ответа на вопрос об их механизме формирования. Только применение FISH с использованием как коммерческих, так и разработанных несерийных ДНК-зондов позволило определить топологию хромосомной перестройки и показать, что две из трех дупликаций возникли вследствие патологической мейотической сегрегации материнской сложной внутрихромосомной ХП. Важно подчеркнуть, что применение несерийных локус-специфичных ДНКзондов, полученных методом ПЦР длинных фрагментов, оказалось принципиально значимым: они позволили дифференцировать гипотезу о «единой» дупликации от наличия двух отдельных дупликаций и подтвердить парацентрическую инверсию в длинном плече хромосомы 22 как ключевой, стартовый момент в формировании комплесной хромосомной перестройки у матери.

Таким образом, цитогеномный подход при использованиии как коммерческих, так и разработанных собственных несерийных ДНК-зондов, позволил определить происхождение, механизм формирования и реконструировать сложную внутрихромосомную перестройку у пациентки с задержой моторного и психоречевого развития и признаками дисэмбриогенеза. Полученные данные позволили также установить высокий повторный риск рождения ребенка с хромосомной патологией в данной семье.

ВЫВОДЫ

Настоящее исследование представляет собой молекулярно-цитогенетическую характеристику редкого случая формирования множественных интерстициальных дупликаций хромосомы 22 в результате мейотической сегрегации сложной внутрихромосомной инсерции, возникшей de novo у матери пробанда. Показано, что сочетание парацентрической инверсии и последовательных инсерционных событий может приводить к формированию рекомбинантных хромосом с несколькими CNV, определяющими клинически значимый хромосомный дисбаланс.