Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, вплоть до 2021 г. грипп оставался третьей по значимости причиной смерти от инфекций, вызывая до 350 тыс. смертей во всем мире [1]. Пандемия COVID-19 изменила эпидемиологию респираторных вирусных инфекций, однако на сегодняшний день грипп является весьма распространенной причиной возникновения тяжелых пневмоний, особенно у детей и людей старше 70 лет. Вирусы гриппа, обладающие высоким зоонозным потенциалом и способностью преодолевать межвидовые барьеры, несут в себе серьезную угрозу возникновения новых пандемий.

Современная стратегия противодействия гриппу в значительной степени основана на вакцинопрофилактике. Однако эффективность этого подхода ограничена сложностью прогнозирования штаммов, которые будут доминировать в следующем эпидемическом сезоне. Эти ограничения подчеркивают необходимость разработки новых терапевтических подходов.

Моноклональные антитела, благодаря своей способности специфично связываться с молекулярными мишенями и модулировать биологические функции, в том числе блокируя взаимодействия между белками, являются перспективными кандидатами для создания противовирусных препаратов. Существующие методы терапии с использованием моноклональных антител в значительной степени ограничены воздействием на внеклеточные мишени. Современные генноинженерные подходы и технологии позволяют, тем не менее, оценить терапевтический потенциал внутриклеточного применения рекомбинантных антител или их фрагментов. Такая стратегия дает возможность использовать в качестве мишеней консервативные и функционально более уязвимые антигены вируса, обычно недоступные для стандартных терапевтических подходов.

В работах 1980–1990-х гг. было показано, что зрелые антитела стабильны и функциональны при введении их непосредственно в цитозоль [2–4], что открыло новые возможности использования антител для подавления функций антигенов внутри живых клеток. Так, два моноклональных антитела, специфично связывающих альфа- и бета-тубулин, в течение 1,5 ч после микроинъекции в живую клетку вызывали разрушение и агрегацию микрофиламентов [3].

Тем не менее системная доставка внутрь клетки достаточно крупных белков, таких как антитела, все еще представляет большую проблему [5]. Подход, основанный на использовании стабильной экспрессии моноклональных антител неиммунными клетками млекопитающих для инактивации антигенов непосредственно внутри клетки, кажется более перспективным [6].

Известно, что формирование правильной конформации антител обеспечивают шапероны, локализованные в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), куда цепи антител направляются посредством сигналов активного транспорта [7]. Еще в процессе синтеза белка на рибосоме локализованные на его N-конце сигнальные пептиды (SP), состоящие из 5–30 аминокислот, связываются сигнальной распознающей частицей, которая обеспечивает транслокацию растущей полипептидной цепи в просвет ЭПР [8, 9]. После прохождения через мембрану ЭПР сигнальный пептид расщепляется сигнальной пептидазой.

Отсутствие SP в полипептидных тяжелых и легких цепях рекомбинантного иммуноглобулина удержит антитело в цитозоле, однако с большой долей вероятности приведет к неправильному фолдингу и потере иммуноглобулином его функциональности [10, 11].

Селективные связывающие свойства с сохранением функциональности могут быть реализованы в более компактных форматах антител (28 кДа), таких как одноцепочечные вариабельные фрагменты (single chain variable fragments, scFv). Функциональные исследования продемонстрировали, что scFv способны правильно сворачиваться и собираться в цитозоле, даже несмотря на то, что шапероны, которые обычно помогают в этом процессе, локализованы исключительно в ЭПР, а восстановительная среда цитозоля не способствует образованию дисульфидных связей [12].

Цель данного исследования заключалась в разработке и оценке противовирусной активности синтетических мРНК, кодирующих высокоаффинные scFv-фрагменты антител против вируса гриппа. В качестве мишеней были выбраны два ключевых вирусных белка: поверхностный гемагглютинин и внутренний нуклеопротеин. При дизайне мРНК использовалась стратегия, предусматривающая либо секрецию scFv-фрагментов для нейтрализации вирусных частиц, либо их накопление в цитоплазме для подавления репликации вируса внутри инфицированной клетки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструирование scFv-фрагментов антител

Получение экспрессионных конструкций, кодирующих scFv-фрагменты антител FI6 и 2/3, было выполнено нами ранее [13]. Для получения экзогенных мРНК фрагменты ДНК, кодирующие scFv нужной длины, были амплифицированы с использованием соответствующих праймеров («Евроген»; Россия) и вставлены методом рестрикции по сайтам BstPA I/Bmt I («Сибэнзим»; Россия) с последующим лигированием в векторную систему pIVTS3, которая была разработана в ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России на основе вектора pIVT (NovoPro Bioscience; Китай). Вектор pIVTS3 содержит T7-промоторную область, 5′- и 3′-UTR, а также poly(dA/dT)-последовательность. Лигазные смеси были использованы для трансфекции компетентных клеток E. coli (штамм NEB Stable; NEB; Великобритания) с последующим высевом их на селективную (содержащую 100 мкг/мл ампициллина) агаризованную среду. Сформировавшиеся суточные колонии были проверены методом ОТ-ПЦР. Плазмиды со вставками нужного размера были накоплены в жидкой среде LB и очищены с использованием набора Plasmid Miniprep 2.0 («Евроген»; Россия). Последовательности разработанных плазмидных конструкций для получения экзогенных мРНК методом in vitro транскрипции были подтверждены методом секвенирования по Сэнгеру компанией «Евроген» (Россия).

In vitro транскрипция (IVT)

Препараты экзогенных мРНК были получены с использованием «Набора для синтеза мРНК in vitro (с ΨTP, m5CTP и m7GmAmG)» («Биолабмикс»; Россия). В качестве матрицы использовали 1 мкг плазмиды, предварительно линеаризованной по сайту Ahl I («Сибэнзим»; Россия). Реакцию проводили строго в соответствии с инструкцией к набору. После проведения реакции в смесь вносили 2 ед. TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific; США) и инкубировали еще 30 мин при 37 °C для расщепления двухцепочечной плазмидной ДНК. Полученный препарат мРНК очищали из реакционной смеси методом переосаждения в хлориде лития. Концентрацию полученных экзогенных мРНК измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 и флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США).

Электрофорез в агарозном геле

Плазмидную ДНК (в том числе линеаризованную) анализировали методом электрофореза в 0,8%-м агарозном геле в 1× TAE-буфере, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Образцы ДНК смешивали с 6× буфером для нанесения и загружали в лунки геля.

Для анализа целостности и качества мРНК использовали электрофорез в денатурирующем 1%-м агарозном геле. Подготовка образцов заключалась в смешивании 200–500 нг мРНК с Gel Loading Buffer II (Invitrogen; США) и термической денатурации (70 °C, 5 мин) перед внесением в гель, содержащий бромистый этидий. Разделение проводили в буфере MOPS при комнатной температуре.

Изображения гелей регистрировали с использованием системы визуализации Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad; США).

Трансфекция клеточных культур экзогенными мРНК

В работе использовали перевиваемые клеточные линии: A549 (карцинома легкого человека) из коллекции ATCC (American Type Culture Collection; США; #CCL-185) и MDCK (клетки почки собаки) из коллекции IRR (International Reagent Resource; США; #FR58). Клетки A549 культивировали на питательной среде F12K (Gibco; США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, SC (Gibco; США); MDCK — на среде альфа-МЕМ («Биолот»; Россия) с добавлением SC до 5%. Ведение культур и все эксперименты проводили без добавления антибиотиков.

Для трансфекции экзогенными мРНК использовали суточный 90–100% монослой клеток, ростовую среду непосредственно перед внесением мРНК заменяли на бессывороточную. Трансфекцию клеток проводили с использованием коммерческого трансфекционного реагента GenJector-U («Молекта»; Россия) согласно инструкции производителя. В лунки 96-луночного планшета липоплексы (комплексы РНК/трансфекционный агент) вносили в объеме 10 мкл, содержащем по 100 нг мРНК и 0,3 мкл трансфекционного реагента. В зависимости от задач эксперимента инкубацию клеток с липоплексами проводили в течение 2–48 ч при 37 °C и 5% СО₂.

Окраска эукариотических клеток для флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентное окрашивание проводили через 24 ч после трансфекции экзогенными мРНК эукариотических клеток, рассеянных в лунки стеклянной слайд-камеры Lab-Tek II (Nunc; США). Для этого монослой клеток промывали DPBS, фиксировали 4%-м раствором параформальдегида в течение 10 мин и пермеабилизовали 0,1%-м раствором Triton X-100 (Sigma-Aldrich; США). Блокирование осуществляли раствором 1%-го бычьего сывороточного альбумина на DPBS в течение ночи при 4 °C. Окраску ядер проводили раствором DAPI (AppliChem; США), актинового цитоскелета — раствором фаллоидина, ковалентно связанного с родамином (Thermo Fisher Scientific; США). Для визуализации scFv-фрагментов антител использовали первичные мышиные моноклональные антитела PentaHis (Qiagen; США) к последовательности 6×His-tag в разведении 1 к 1000 и вторичные антитела Goat anti-Mouse, меченные флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488, в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Микроскопию клеток проводили с использованием системы визуализации клеток Cytell последовательно по каналам Blue, Green и Orange (GE Healthcare; США).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Измерение уровня scFv-фрагментов антител в клеточной среде проводили методом ИФА. В качестве лиганда для сорбции использовали вирусный концентрат, разведенный в буфере PBS до концентрации 2 мкг/мл (штаммы вирусов гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm) и B/Phuket/3073/13 (Yamagata)). Растворы лигандов в объеме 100 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета Microlon High Binding (Greiner Bio-One; Германия) и инкубировали при температуре 4 °C в течение ночи (12–18 ч). После этого проводили трехкратную отмывку планшетов буфером PBST (PBS с добавлением Tween 20 до 0,05%) с использованием автоматического промывателя планшетов ELx405 (BioTek; США). Далее сорбирующую поверхность лунок блокировали 5%-м раствором сухого обезжиренного молока Blotting-Grade Blocker (Bio-Rad; США) в PBST (далее «блокирующий реагент») в термошейкере MB100-4A (Allsheng, Китай) при температуре 37 °C в течение 1 ч, по 200 мкл в лунку, и проводили отмывку. Затем в лунки микропланшета вносили тестируемые культуральные жидкости (КЖ) в объеме 100 мкл, разведенные один к двум на блокирующем реагенте, инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 ч и проводили отмывку. Связавшиеся с антигеном scFv-фрагменты детектировали с использованием антител к последовательности 6×Histag, конъюгированных с пероксидазой хрена, His17-HRP (Hytest; Россия), разведенных 1 к 2000 на блокирующем реагенте, при температуре 37 °C в течение 1 ч по 100 мкл в лунку. Далее проводили отмывку и проявляли пероксидазную реакцию добавлением в каждую лунку по 100 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) («Хема»; Россия). После остановки цветной реакции добавлением в каждую лунку по 100 мкл 2Н H₂SO₄ измеряли оптическую плотность при длинах волн 450 нм (OD₄₅₀) ^{и 620 нм (OD}₆₂₀) на микропланшетном спектрофотометре Multiskan SkyHigh (Thermo Fisher Scientific; США). Статистический анализ первичных данных проводили в программных пакетах Microsoft Office Exсel 2010 (США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad Software; США).

Вестерн-блоттинг

Для сбора клеточных лизатов MDCK использовали экстракционный буфер, содержащий два компонента — Extraction Buffer 5× PTR и Extraction Enhancer Buffer 50× (Abcam; США). По 50 мкл приготовленного охлажденного 1× экстракционного буфера добавляли в лунки к монослою отмытых DPBS клеток, планшет инкубировали в течение 30 мин на льду и собирали содержимое лунок в пробирки. Образцы осветляли в течение 30 мин при 4 °C и 13 800 g на центрифуге 5415R (Eppendorf; Германия). Полученный осветленный супернатант смешивали с денатурирующим буфером Лэммли, прогревали в течение 10 мин при 95 °C, вносили в лунки предзалитого геля Any kD Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gel (Bio-Rad; США) и разделяли в денатурирующих условиях. Далее для переноса геля на мембрану использовали систему полусухого блоттинга Trans-Blot Turbo Transfer System и наборы для блоттинга Trans-Blot Turbo Mini 0.2 µm Nitrocellulose Transfer Packs, содержащие нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм (Bio-Rad; США). Мембраны после переноса инкубировали в блокирующем реагенте в течение ночи при 4 °C, затем в течение 2 ч при 37 °C с первичными антителами Penta-His (Qiagen; США) к последовательности 6×His-tag, разведенными 1 к 2000 на блокирующем реагенте. После этого мембрану отмывали в PBST и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C со вторичными антителами Goat anti-Mouse, конъюгированными с пероксидазой хрена, GAM-HRP (Bio-Rad; США), разведенными 1 к 2000 на блокирующем реагенте. Проявку белков осуществляли с использованием субстрата для хемилюминесцентной детекции вестерн-блоттинга Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad; США), регистрацию результатов проводили на системе визуализации ChemiDoc MP (Bio-Rad; США). В качестве отрицательного контроля использовали лизат клеток, трансфицированных мРНК, которая кодировала тяжелую цепь иммуноглобулина к нерелевантному антигену.

Противовирусные эксперименты

Для оценки противовирусного действия экзогенных мРНК, кодирующих scFv-фрагменты антител, была использована лечебно-профилактическая схема. Для этого суточный монослой клеток MDCK промывали стерильным раствором DPBS (для удаления компонентов сыворотки, ингибирующей репродукцию вируса), а затем в лунки вносили по 100 мкл свежей среды альфа-МЕМ («Биолот»; Россия), содержащей по 10 мкл липоплексов, которые были приготовлены с использованием коммерческого трансфекционного реагента GenJector-U («Молекта»; Россия) согласно инструкции производителя. На 1 лунку 96-луночного планшета (примерно 5 × 10⁴ клеток) приходилось по 100 нг мРНК и 0,3 мкл трансфекционного реагента. Далее клетки инкубировали 6 ч при температуре 37 °С и 5% СО₂.

Инфицирование проводили методом контакта клеток с 50 мкл вируссодержащей среды в течение 1 ч при температуре 37 °С и 5% СО₂. В работе использовали эталонные штаммы вирусов гриппа человека из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева» Минздрава России: A/California/07/09 (H1N1pdm), A/Cambodia/ e0826360/2020 (H3N2), B/Phuket/3073/13 (Yamagata) и B/Malaysia/2506/2004 (Victoria) с исходными инфекционными титрами 6 × 10⁸ TCID₅₀/мл; 3,16 × 10⁷ TCID₅₀/мл; 3,16 × 10⁶ TCID₅₀/мл и 1,0 × 10⁸ TCID₅₀/мл соответственно.

Для инфицирования использовали разведения вирусов 1 к 1000, что соответствовало множественности заражения от 0,1 до 1 MOI.

После инкубации вируссодержащую жидкость удаляли и на клетки наслаивали исходную трансфекционную среду, содержащую липоплексы. После инфицирования клетки инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °С и 5% СО₂. Далее проводили детекцию вирусных частиц: в КЖ с использованием реакции гемагглютинации по стандартной методике [14], в клетках — методом внутриклеточного ИФА (In-Cell ELISA).

Внутриклеточный ИФА

Оценку содержания вирусных частиц в клетках проводили методом внутриклеточного ИФА, следуя описанному выше протоколу ИФА с небольшими изменениями. Если коротко, то 96-луночные планшеты с зараженными клетками фиксировали 80%-м ацетоном в DPBS по 50 мкл в лунку в течение 30 мин при температуре 4 °C. После промывки PBST лунки инкубировали в блокирующем реагенте при температуре 37 °C в течение 1 ч, по 200 мкл в лунку, и проводили отмывку. Затем в лунки микропланшета вносили первичные мышиные моноклональные антитела против нуклеопротеина вирусов гриппа А и В [15], разведенные до концентрации 0,5 мкг/мл на блокирующем реагенте, по 100 мкл в лунку, инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 ч и проводили отмывку. Связавшиеся с вирусными частицами антитела детектировали с использованием вторичных антител Goat anti-Mouse, конъюгированных с пероксидазой хрена, GAM-HRP (Bio-Rad; США), разведенных 1 к 2000 на блокирующем реагенте, по 100 мкл в лунку при температуре 37 °C в течение 1 ч и проводили отмывку. Проявку и учет результатов осуществляли аналогично описанному выше методу ИФА.

Статистическая обработка результатов

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software; США) с использованием одношагового анализа ANOVA с тестом Холма–Шидака для множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Конструирование и получение экзогенных мРНК, кодирующих scFv-фрагменты антител

В качестве объектов исследования были выбраны антигенраспознающие участки антител в формате scFv, разработанные нами ранее [13]. В частности, один из них, а именно scFv-FI6 — специфически выявляет стеблевой участок гемагглютинина (HA), консенсусный для вирусов гриппа А (ВГА) обеих филогенетических групп [16], второй, scFv-2/3 — специфично связывает нуклеопротеины (NP) вирусов гриппа В (ВГB) обеих генетических линий [17].

scFv содержали вариабельные домены исходных полноразмерных рекомбинантных антител в направлении от фрагмента легкой цепи к тяжелой, соединенные линкером, состоящим из четырех тандемных копий G₄S. Для секреции во внеклеточное пространство N-конец каждого scFv-фрагмента содержал сигнальный пептид (SP) из соответствующей легкой цепи исходного антитела (их обозначили как scFv-SP). В качестве SP были использованы следующие аминокислотные последовательности: MKSQTQVLVFLLLCVSGAHG — для scFv-FI6-SP и MDFQVQIFSFLLISASVIISRG — для scFv-2/3-SP. Для накопления внутри клетки каждый из scFv-фрагментов был также сконструирован в виде полипептида без SP (scFv-WO). Открытая рамка считывания (ORF) таких scFv-фрагментов начиналась со стартового кодона ATG, кодирующего метионин, после которого встык начиналась последовательность, кодирующая вариабельный домен легкой цепи. scFv-SP и scFv-WO отличались только наличием или отсутствием SP на N-конце. Все рекомбинантные scFv-фрагменты антител были снабжены С-концевыми гексагистидиновыми метками для последующей детекции (рис. 1A, Б). На основе разработанного дизайна последовательностей были получены плазмидные конструкции, содержащие T7-промоторный участок для получения мРНК методом in vitro транскрипции (IVT).

Технология мРНК была использована для трансляции внутриклеточных scFv-фрагментов антител в неиммунных клетках эукариот. мРНК была получена методом IVT и состояла из пяти стандартных элементов: на 5′-конце оптимизированный аналог кэп-структуры m7GmAmG (CleanCap; TriLink BioTechnologies; США), далее 5′-нетранслируемая область (UTR), потом ORF scFv, 3′UTR и поли(А)-хвост, кодируемый встроенной в плазмиду poly(dA/dT)-последовательностью (рис. 1В). Для снижения иммуногенности и повышения стабильности мРНК содержала модифицированные нуклеотиды, такие как псевдоуридин (ΨTP) и 5‐метилцитидин (m5CTP).

Полученные и очищенные препараты: четыре мРНК, кодирующие scFv-фрагменты антител FI6 и 2/3 против ВГА и ВГВ, с SP и без него, а также еще одна мРНК, используемая далее в экспериментах в качестве отрицательного контроля и кодирующая тяжелую цепь иммуноглобулина к нерелевантному антигену — были охарактеризованы спектрофотометрически и электрофоретически в агарозном геле (рис. 1Г). Было показано, что длины мРНК соответствовали расчетным, а чистота и целостность полученных мРНК были достаточными для эффективной трансляции целевых белков.

Функциональные свойства scFv-фрагментов антител, кодируемых экзогенными мРНК

Мы оценили трансляционную активность полученных экзогенных мРНК, кодирующих scFv-фрагменты антител, в эукариотических клеточных линиях MDCK и A549. Для этого через 24 ч после трансфекции мРНК отбирали КЖ, а клетки подвергали лизису и оценивали в лизатах уровень белков с гистидиновой меткой методом вестернблоттинга.

Через 24 ч после трансфекции клеток MDCK мРНК, кодирующей scFv-SP, в КЖ с использованием антител к последовательности 6×His-tag нам удалось достоверно детектировать белки ожидаемой молекулярной массы (~28 кДа), соответствующие мономерным scFv-фрагментам антител (рис. 2А). Детекция scFv-продуктов в клеточных лизатах была затруднена: как в случае scFv-SP, так и scFv-WO, были выявлены неспецифические высокомолекулярные полосы (~55 кДа), присутствующие и в отрицательном контроле. Ферментативная амплификация сигнала и значительное увеличение времени выдержки позволили выявить внутри клетки продукцию scFv-SP (рис. 2А, дорожка 3), но не scFv-WO (рис. 2А, дорожка 4). Таким образом, трансфекция мРНК, кодирующей scFv-SP, приводила через 24 ч к секреции зрелых scFv-фрагментов в мономерной форме, которые обнаруживались как в КЖ, так и в клеточных лизатах.

Предполагая, что внутриклеточные scFv-фрагменты антител могут быть нестабильны, а период их полувыведения может достигать всего нескольких часов, мы исследовали их продукцию в клеточных лизатах в динамике: через 2, 4, 6, 8 и 12 ч после трансфекции клеток экзогенными мРНК. Было показано, что пик трансляции для обоих scFv (как с сигналом секреции, так и без него) наблюдался через 6 ч после трансфекции мРНК (рис. 2Б). При этом периоды полувыведения внутриклеточных scFv существенно различались в зависимости от наличия или отсутствия SP. Так, антитела scFv-SP были выявлены в клетках уже через 2 ч после трансфекции, далее наблюдали возрастание их продукции к 6 ч и резкое снижение к 12 ч. В случае scFv-WO белок обнаруживался в клетках на минимально детектируемом уровне через 4 ч после трансфекции, его количество достигало пика к 6 ч, а через 8 ч снижалось до предела детекции метода.

Далее мы оценили динамику накопления фрагментов scFv-SP в КЖ от клеток A549, трансфицированных соответствующими экзогенными мРНК (рис. 2В). Для этого был проведен ИФА, в котором в качестве захватывающих лигандов выступали вирусные концентраты, представляющие собой очищенные инактивированные вирусы гриппа А и B. Детекцию проводили с использованием антител к последовательности 6×His-tag, конъюгированных с пероксидазой хрена. Концентрации scFv-фрагментов антител были оценены по калибровочной кривой, построенной с использованием рекомбинантных препаратов scFv, очищенных нами ранее [13].

Согласно полученным нами результатам уже через 2 ч после трансфекции клеток A549 мРНК, кодирующими scFv-SP, в КЖ выявлялись функциональные scFvфрагменты антител на аналитически детектируемом уровне. Далее в течение суток происходил равномерный прирост уровня scFv, и к 24 ч концентрация как scFv-FI6-SP, так и scFv-2/3-SP достигала примерно 200 нг/мл. Насыщение и выход на «плато» уровня белкового продукта, кодируемого экзогенной мРНК, происходило примерно через 24 ч после трансфекции, содержание белков в КЖ определялось на протяжении всего срока наблюдений (48 ч).

Для оценки внутриклеточной локализации белков, кодируемых scFv-SP и scFv-WO, была проведена иммунофлуоресцентная окраска клеток A549, трансфицированных соответствующими экзогенными мРНК (рис. 2Г). Иммуноцитохимический анализ показал, что scFv-FI6-WO и scFv-2/3-WO были диффузно распределены по цитоплазме клеток и не имели четкой локализации. Напротив, для scFv-FI6-SP и scFv-2/3-SP была характерна четкая локализация в перинуклеарной области, что с большой долей вероятности отражает их накопление преимущественно в ЭПР (который не окрашивали).

На заключительном этапе исследования мы оценили противовирусные свойства полученных экзогенных мРНК в отношении вирусов гриппа А и B. В качестве отрицательного контроля была использована мРНК, кодирующая тяжелую цепь иммуноглобулина к нерелевантному антигену (NC-RNA).

Эксперименты были проведены по лечебнопрофилактической схеме с контактом вирусов в течение 1 ч. Согласно полученным нами результатам три мРНК, кодирующие scFv-FI6-SP, scFv-2/3-SP и scFv-2/3-WO, проявляли противовирусное действие в отношении ВГА (рис. 3А). При этом в случае штамма H1N1pdm наибольшим противовирусным эффектом обладала мРНК scFv-FI6-SP, предварительная трансфекция которой до заражения приводила к снижению вирусной нагрузки примерно в 10 раз относительно контроля. В случае штамма H3N2 подобной тенденции не наблюдалось: противовирусное действие всех трех мРНК было сопоставимо и приводило к снижению вирусной нагрузки до 60–70% относительно контроля. Примечательно, что мРНК scFv-FI6-WO, специфично связывающая HA ВГА, не оказывала никакого эффекта на репродукцию ВГА.

В отношении ВГВ обе мРНК, кодирующие scFv-2/3 (как с SP, так и без него), проявляли противовирусное действие — их предварительная трансфекция до заражения приводила к снижению вирусной нагрузки до 50–70% относительно контроля. В целом, паттерны противовирусной активности мРНК в отношении штаммов ВГB Ямагатской и Викторианской линии были сопоставимы. Важно отметить, что изначально ни исходное полноразмерное моноклональное антитело 2/3 [17], ни полученный на его основе белковый фрагмент scFv2/3 не обладали нейтрализующим действием в отношении ВГВ [13].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Современная пассивная иммунотерапия с использованием нейтрализующих моноклональных антител может обеспечить широкую защиту от инфекций, вызываемых вирусами гриппа [16, 18, 19]. Существующие на сегодняшний день терапевтические иммуноглобулины направлены к поверхностным антигенам вируса гриппа — гемагглютинину и нейраминидазе. Вместе с тем, использование антител к белкам-мишеням, обладающим высокой скоростью изменчивости, несет в себе значительные риски [20, 21]. В связи с этим выбор в качестве мишеней других вирусных антигенов, обладающих большей консервативностью, представляется весьма перспективным.

Целью нашего исследования была оценка потенциала применения внутриклеточных терапевтических антител, нацеленных на две различных мишени вируса гриппа: поверхностный гемагглютинин, уязвимый для нейтрализующих антител, и внутренний белок нуклеопротеин, недоступный для блокирования в составе зрелого вириона. Попытки введения моноклональных антител в цитозоль живых клеток и исследования их функциональных свойств предпринимаются с 70-х годов прошлого столетия [22–24]. Однако лишь в последнее десятилетие, с развитием технологий на основе мРНК, позволяющих эффективно экспрессировать антитела непосредственно внутри клетки, появилась реальная возможность применения внутриклеточных антител в качестве терапевтического средства.

Известно, что полноразмерные иммуноглобулины наряду с антигенсвязывающей областью содержат Fc-домен, обладающий эффекторными функциями, обеспечивающими взаимодействие антитела c клетками иммунной системы [25, 26]. Очевидно, что для специфичного связывания антитела с мишенью внутри клетки такая функция является избыточной. Поэтому для оценки внутриклеточного действия нами был выбран формат scFv-фрагмента антитела [27, 28], содержащий только его вариабельные домены. Кроме того, для каждого из антител (scFv-FI6, направленного против HA ВГА, и scFv-2/3, направленного против NP ВГВ) мы разработали два типа конструкций. Первая конструкция содержала последовательность SP, обеспечивающего транслокацию полипептидной цепи в просвет ЭПР, далее в аппарат Гольджи и секрецию белка во внеклеточное пространство. Вторая конструкция не содержала SP и каких-либо других сигнальных последовательностей, таких как сигнал ядерной локализации, сигнал локализации в ЭПР и др. [8, 9]. По нашим предположениям, белковый продукт, транслируемый с такой экзогенной мРНК, должен оставаться в цитозоле и эффективно взаимодействовать там с белками-мишенями, подавляя репродукцию вируса.

Нам удалось выявить различия в распределении полученных scFv-фрагментов антител внутри клетки. scFv-SP главным образом были сосредоточены в областях с сильно изогнутыми гладкими мембранами, типичными для пограничной области ЭПР/Гольджи. Напротив, scFv-WO не имели четкой локализации и были диффузно распределены по цитоплазме. Вероятно, после трансляции они оставались в цитозоле и не вовлекались в везикулярный транспорт.

Следует отметить, что при анализе клеточных лизатов методом вестерн-блоттинга через 24 ч после трансфекции мРНК, кодирующей scFv-WO, в отличие от scFv-SP, нам не удалось обнаружить белки, соответствующие мономерным scFv-фрагментам антител (~28 кДа). В то же время в КЖ после трансфекции как мРНК scFv-FI6-SP, так и scFv-2/3-SP мы достоверно выявили белки ожидаемой молекулярной массы.

Далее мы показали, что внутриклеточные scFvфрагменты антител обладают быстрым периодом полувыведения. Фактически продукты мРНК, кодирующей scFv-WO, обнаруживались лишь в течение 4 ч, что свидетельствует о быстрой деградации этих белков, по-видимому, посредством убиквитин-протеасомной системы. Многочисленные исследования показывают, что цитозольные scFv-фрагменты часто демонстрируют низкую стабильность, склонны к образованию димеров и деградации [29]. Это связано с неоптимальными для фолдинга антител условиями в цитозоле: низким pH, отсутствием шаперонов и восстановительной средой, которая препятствует формированию стабилизирующих дисульфидных связей [11, 12, 30]. Таким образом, эффективность применения внутриклеточных scFvфрагментов в цитозоле может быть существенно снижена из-за сложностей с фолдингом в неоптимальных условиях, что препятствует образованию стабильной функциональной конформации [31]. Интересно отметить, что внутриклеточная продукция scFv-фрагментов антител, содержащих сигнал секреции, инициировалась раньше и была более продолжительна.

Следующим этапом работы стала оценка противовирусной активности сконструированных и полученных нами экзогенных мРНК, кодирующих scFv-фрагменты антител, на клеточной модели гриппозной инфекции. Известно, что экзогенные мРНК способны неспецифически подавлять репродукцию вируса за счет собственной иммуногенности и активации клеточных сенсоров нуклеиновых кислот [32, 33]. В связи с этим в качестве негативного контроля неспецифических эффектов мы использовали мРНК, кодирующую тяжелую цепь иммуноглобулина против нерелевантного антигена (с SP), полученную и очищенную так же, как исследуемые препараты.

Нами было показано, что из двух конструкций, кодирующих цитозольный и секретируемый белок scFv-FI6 (специфично связывающий HA ВГА), противовирусным действием обладала только мРНК, кодирующая scFv-FI6-SP. Лечебно-профилактическое применение такой мРНК снижало вирусную нагрузку при заражении H1N1pdm почти в 10 раз по сравнению с препаратом сравнения.

Противовирусный эффект scFv-FI6-WO нами выявлен не был. По-видимому, использование внутриклеточных антител более эффективно, когда их мишенью служат белки того же секреторного пути. Показано, что внутриклеточное человеческое антитело в формате scFv против HA, экспрессируемое с плазмидной ДНК, подавляло репродукцию вируса гриппа H5N1 in vitro. При этом in vivo его эффективность значительно возрастала в комбинации с внеклеточным IgG1, содержащим идентичные вариабельные домены [34].

Для scFv-2/3, направленного против NP ВГB и не обладающего нейтрализующими свойствами [13], результаты оценки противовирусной активности оказались неожиданными. Обе формы белка — как цитозольная, так и секретируемая — при лечебно-профилактическом применении проявляли противовирусные свойства, снижая вирусную нагрузку ВГВ в среднем в 2 раза по сравнению с контролем. Трансфекция экзогенных мРНК, кодирующих scFv-2/3, также приводила к подавлению репродукции ВГА. Поскольку исходное полноразмерное моноклональное антитело 2/3 не обладает нейтрализующей активностью [17], идентификация его эпитопа на молекуле NP ВГB затруднена. Можно предположить, что данный эпитоп высококонсервативен у вирусов гриппа А и B. Таким образом, экспрессия экзогенных мРНК, кодирующих scFv-2/3, приводила к снижению репродукции как ВГB, так и ВГА в среднем на 50% относительно контроля.

Следует отметить, что описано использование внутриклеточных антител против NP ВГА, подавляющих репродукцию вируса за счет блокирования взаимодействия NP с белками PB1 и PB2 вирусной полимеразы, которая играет критически важную роль в транскрипции и репликации вируса [35]. В другой работе описаны однодоменные антитела ламы против различных эпитопов NP ВГА, которые ингибировали репликацию вируса, блокируя ядерный импорт его рибонуклеопротеиновых комплексов, ответственных за ядерный транспорт, транскрипцию, репликацию и упаковку вирусного генома в новые вирионы [36]. Важно подчеркнуть, что в обоих исследованиях экспрессию внутриклеточных антител осуществляли не с помощью экзогенных мРНК, а путем трансфекции клеток плазмидными конструкциями, кодирующими эти антитела.

Наше исследование показало, что эффективность структурно различных внутриклеточных scFv-фрагментов антител зависит от пути внутриклеточного транспорта их вирусных белков-мишеней. Полученные нами данные позволяют предположить, что ингибирование функций некоторых вирусных белков возможно только при воздействии на них в строго определенных клеточных компартментах.

Таким образом, использование экзогенных мРНК, кодирующих высокоаффинные scFv-фрагменты антител против консервативных внутриклеточных вирусных белков (в частности, нуклеопротеина вируса гриппа), представляет собой перспективную стратегию подавления репродукции вируса. Главное преимущество этого подхода — нацеливание на внутренние вирусные белки, в том числе внутриклеточные комплексы репликации-транскрипции вируса, которые значительно более консервативны и в меньшей степени подвержены антигенному дрейфу, чем поверхностные гликопротеины [37].

ВЫВОДЫ

В представленной работе: 1) сконструированы scFvфрагменты антител к гемагглютинину вируса гриппа А и нуклеопротеину вируса гриппа В; 2) получены экзогенные мРНК, кодирующие эти scFv-фрагменты антител в двух формах — цитозольной и секретируемой; 3) подтверждена эффективная трансляция белковых продуктов scFv при трансфекции экзогенных мРНК в эукариотические клеточные системы; 4) показаны диффузное внутриклеточное распределение цитозольных форм и преимущественная локализация в эндоплазматическом ретикулуме секретируемых форм scFv-фрагментов антител; 5) показано противовирусное действие экзогенных мРНК, кодирующих scFv-фрагменты антител, в отношении вирусов гриппа А и В.