К митохондриальным энцефаломиопатиям, манифестирующим в раннем возрасте с грубыми прогрессирующими неврологическими нарушениями, относится подострая некротизирующая энцефаломиелопатия, или синдром Ли (Leigh syndrome), описанная профессором Денисом Арчибальдом Ли в 1951 г. в результате посмертного исследования 7-месячного мальчика с прогрессирующими неврологическими симптомами [1].

Синдром Ли представляет собой редкую наследственную патологию — встречаемость составляет ориентировочно один случай на 34–36 тысяч новорожденных, которая в равной степени поражает как мальчиков, так и девочек, представляя собой с точки зрения этиологии генетически чрезвычайно гетерогенное заболевание — его причиной становятся дефекты множества генов, расположенных как на аутосомах и Х-хромосоме, так и в митохондриальной ДНК.

Известно, что самым частым биохимическим дефектом при этом синдроме являются нарушения аминокислотной последовательности белков, которые участвуют в сборке субъединиц IV комплекса электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) внутренней мембраны митохондрий — цитохромоксидазы (cytochrome c oxidase, COX), катализирующей перенос электронов в ЭТЦ от цитохрома c к молекулярному кислороду с образованием воды и, таким образом, играющей ключевую роль в митохондриальном окислительном фосфорилировании.

Наиболее часто встречаются мутации в гене белка SURF1 (Sea Urchin Retroposon Family1), встроенного во внутреннюю мембрану митохондрии и играющего решающую роль в сборке СОХ-комплекса [2]. В норме предшественник SURF1 с молекулярным весом 35 КДа импортируется в митохондрии, где образуется его зрелая форма (30 КДа). При этом практически все мутации (более 60) в гене SURF1 приводят к биосинтезу белка, укороченного уже на стадии предшественника, и повреждениям СОХкомплекса, дестабилизированного дефектным SURF1. Около 50% мутаций в гене SURF1 составляют миссенс-, нонсенс-мутации и небольшие делеции, а наиболее частыми являются делеция 10 нуклеотидов со вставкой двух нуклеотидов (311-321del10insAT) в 4-м экзоне и делеция двух нуклеотидов (845delCT) в 9-м экзоне гена [3, 4].

Установлено, что хотя в большинстве случаев синдром Ли, связанный с SURF1, протекает типично, приводя к ранней смертности до 10 лет, примерно в 10% случаев наблюдается манифестация более мягких симптомов на фоне большей продолжительности жизни [5]. Во всех случаях дебют заболевания приходится на младенческий возраст и характеризуется нарушением питания, связанным с началом поражения центральной нервной системы, гипотонией и плохой координацией сосания и глотания, с последующим дальнейшим регрессом уже состоявшегося психомоторного развития [6]. Как считает ряд исследователей, гастропарез и замедленное опорожнение желудка, а также гастроэзофагеальный рефлюкс при синдроме Ли, обсуловленные мутациями в гене SURF1, скорее всего, также обусловлены нервномышечной и митохондриальной дисфункцией, вызванной нарушениями работы ЭТЦ при дефиците цитохромоксидазы [7]. Типичными проявлениями развивающегося заболевания также являются такие нарушения, как нейропатия, атаксия, офтальмоплегия и гипертрихоз [8].

Для исследования молекулярных механизмов и возможности терапии синдрома Ли были созданы мышиные модели, дефицитные по гену SURF1(–/–). Модели демонстрируют значительное снижение массы тела при рождении, которое выправляется к месяцу жизни, с манифестацией умеренной задержки моторного развития на фоне дефектной сборки и дефицита ряда критических субъединиц COX, включая митохондриальнокодируемую MT-CO1 [9]. Несмотря на описанные нарушения, испытуемые мыши имеют продолжительность жизни, аналогичную дикому типу и было высказано предположение, что потеря такого фактора сборки COX, как Surf1, у мышей приводит к компенсаторным реакциям, включающим активацию митохондриального биогенеза и Nrf2-зависимого сигнального каскада, способствующим купированию проявлений патологического фенотипа [10]. Кроме того, для данной модели было показано, что терапия, проводимая с помощью аденовирусного вектора AAV серотипа 9 (AAV9) для лечения синдрома Ли, связанного с SURF1, при которой мышам вводили кодоноптимизированный ген человеческого SURF1 (hSURF1opt) (AAV9/hSURF1v1) приводит к восстановлению не только функции SURF1, но и активности комплекса IV, а также коррекции вызванного физической нагрузкой лактатного ацидоза без признаков токсичности для мышей дикого типа [11, 12].

В данной работе мы использовали сходный подход с целью изучения возможностей генотерапии синдрома Ли на модели подкожных фибробластов пациентов с мутацией в гене SURF1 при трансфекции аденовирусной конструкцией с кодон-оптимизированным геном человеческого SURF1.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены три пациента с генетически подтвержденным диагнозом синдром Ли и типичными для заболевания клиническими проявлениями. Критерии включения в исследование: генетически подтвержденный диагноз синдрома Ли с часто встречающимися мутациями в гене SURF1 (табл. 1); возраст манифестации заболевания — до 3 лет; наличие информированного согласия законного представителя пациента. Критерии исключения: наличие другого генетически обусловленного заболевания, в том числе синдромальной формы патологии. Два пациента рождены доношенными, в удовлетворительном состоянии при рождении (оценка по Апгар 8/9 баллов), с нормальными к сроку гестации массой тела и длиной, один пациент рожден на сроке 30 недель. У всех пациентов с первых месяцев жизни отмечалось отставание в психомоторном развитии. В динамике состояние пациентов прогрессивно ухудшалось, отмечалась утрата моторных и психоречевых навыков, у первых двух пациентов имели место метаболические кризы — ацетонемическое состояние в виде рвот, отказа от еды, слабости, вялости. Тяжелые бульбарные нарушения привели к необходимости установки гастростомы первому и второму пациентам, трахеостомы третьему пациенту и необходимости в респираторной поддержке у первого (НИВЛ). Всем пациентам диагноз установлен в возрасте старше 1,5 лет. По данным МРТ выявлены характерные для заболевания изменения вещества головного мозга: у первого пациента в возрасте 2 лет МР-признаки билатеральных симметричных структурных изменений черной субстанции, красных ядер, по ходу проводящих путей в продолговатом мозге и в средних ножках мозжечка, у второго пациента (1 год 4 месяца) отмечалось двустороннее симметричное повышение интенсивности сигнала базальных ядер, кортико-спинальных трактов и стволовых структур, у третьего пациента  (1 год 2 месяца) имело место повышение интенсивности сигнала нижних отделов ствола головного мозга (мост, продолговатый мозг) без вовлечения базальных ганглиев. Диагноз подтвержден молекулярно-генетическими методами исследования (табл. 1).

На момент исследования в неврологическом статусе у всех пациентов отмечалось нарушение координации и фиксации взора, ротаторный нистагм с вертикальным компонентом, плавающие движения глазных яблок, бульбарно-псевдобульбарный синдром, диффузная общая туловищная и конечностная гипотония/атония на фоне смешанного тетрапареза, снижение сухожильнопериостальных рефлексов, полинейропатический синдром с дистальной гипотрофией мышц конечностей, миогенные контрактуры в крупных суставах.

Группа контроля была набрана среди здоровых детей (3–13 лет) с невыявленными мутациями в гене SURF1 и с отсутствием какой-либо симптоматики, обращавшихся в детское поликлиническое отделение НЦАГиП им. В. И. Кулакова в рамках планового обследования педиатром.

Получение образцов крови

Цельную кровь, обработанную ЭДТА, в течение 15–60 мин после внутривенного забора у пациентов обрабатывали лизирующим буфером на основе хлорида аммония и калия (AbiLyse ACK Lysing Buffer, США) по методике, описанной производителем с целью последующего получения проб для вестерн-блот анализа.

Культивирование фибробластов

Первичные клеточные культуры подкожных фибробластов были любезно предоставлены из коллекции РНИМУ им. Пирогова и с третьего пассажа клетки культивировали на полной питательной среде следующего состава: DMEM («ПанЭко», Россия): F12 («ПанЭко», Россия), в соотношении 1 : 1, c добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (PenStrep, GIBCO, США) и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, GIBCO, США) при 37 °С в атмосфере 5% CO₂. По достижении 60% конфлюэнтности, клетки пересевали в соотношении 1/3 с помощью 0,05% трипсина /ЭДТА («ПанЭко», Россия) на культуральные флаконы. Активность трипсина подавляли добавлением соответствующего количества свежей питательной среды. На каждом пассаже количество клеток определяли с помощью камеры Горяева («МИНИМЕД», Россия). Морфологию клеток оценивали с помощью светового инвертированного микроскопа NIKON ECLIPSE TS100 (JAPAN).

Получение генетической конструкции в ААV-векторе, несущей ген SURF1 

Для выделения тотальной РНК использовали коммерческий набор RNA-solo («Евроген», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Образцы ткани гомогенизировали и лизировали реагентом ExtractRNA («Евроген», Россия) с последующей экстракцией и очисткой РНК. Концентрацию и чистоту полученной РНК оценивали спектрофотометрически, проверку целостности РНК и отсутствия деградации проводили методом электрофореза в 2%-м агарозном геле. Визуализацию результатов осуществляли с использованием гель-документирующей системы GenoSens 2250 Touch (Clinx). Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице выделенной РНК с использованием набора реагентов на основе обратной транскриптазы Magnus («Евроген», Россия).

Для амплификации полной кодирующей последовательности гена SURF1 были разработаны специфические праймеры, содержащие на 5ˈ-концах дополнительные нуклеотидные последовательности, комплементарные концевым участкам линеаризованной плазмиды pAAV-CAG, для последующей сборки методом TLTC. Праймеры имели следующую структуру. Прямой праймер SURF1-dir: 5ˈ-tgtccaggcggccgccATGGCGGCG GTGGCT-3ˈ и обратный праймер SURF1-rev: 5ˈ-aggcacagt cgaggcagatctTCACACACCAGGTGTCCCAC-3ˈ (строчные буквы — гомологичные вектору последовательности, а прописные — участки, комплементарные началу и концу открытой рамки считывания гена SURF1). Температура отжига праймеров и специфичность были рассчитаны с помощью программы Primer3. Амплификацию гена SURF1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Протокол амплификации включал начальную денатурацию при 95 °C 5 мин, 30 циклов (денатурация при 95 °C — 30 с, отжиг при 62 °C — 30 с, элонгация при 72 °C — 1 мин) и финальную элонгацию при 72 °C 5 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 1%-м агарозном геле.

Плазмидный вектор pAAV-CAG подготавливали для клонирования с помощью ПЦР-амплификации с праймерами Vec-dir (AGATCTGCCTCGACTGTGCCT) и Vec-rev (GGCGGCCGCCTGGACA) и полимеразой Kapa (Rosche), что обеспечивало получение линейной молекулы с концевыми последовательностями, гомологичными амплифицированному гену SURF1. Сборку рекомбинантной плазмиды осуществляли методом T5 экзонуклеазнозависимой сборки, смешивая очищенный ПЦР-продукт гена SURF1 и линеаризованный вектор с добавлением T5 экзонуклеазы и инкубируя смесь на льду 5 мин. Два микролитра реакционной смеси использовали для трансформации химически компетентных клеток E. coli штамма XL-Blue («Евроген», Россия) по стандартной методике [13].

Плазмидную ДНК выделяли из культур минипрепаративным методом с набором Plasmid Miniprep 2.0 («Евроген», Россия). Первичный скрининг положительных клонов проводили с помощью ПЦР со специфичными для SURF1 праймерами. Корректность полученной рекомбинантной конструкции дополнительно подтверждали рестрикционным анализом эндонуклеазой PstI в буфере Orange («Сибэнзим», Россия) с последующим анализом профиля рестрикции методом электрофореза в агарозном геле.

Оценка цитотоксического действия вируса

Цитотоксическое действие вируса оценивали с помощью МТТ-теста жизнеспособности клеток кожи пациентов без мутации Surf1. Клеточную культуру четвертого пассажа высевали в 96-луночные прозрачные плоскодонные планшеты (Greiner Bio-One, Aвстрия) в концентрации 1 × 10⁵ кл./лунка. Через 24 ч культивирования при 37 °С и 5% СО₂ клетки обрабатывали различными концентрациями вируса — 10¹³, 10¹², 10¹⁰, 10⁸ вирусных частиц на 1 мл культуральной среды. В контрольные лунки вместо вирусных частиц вносили среду культивирования в адекватных количествах. После добавления вирусных частиц клетки инкубировали 24 ч при вышеописанных условиях и по окончании инкубации в каждую лунку микропланшета добавляли по 20 мкл раствора, содержащего 4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ, Santa Cruz) в концентрации 5 мг/мл. Через 4 ч среду с реагентом МТТ удаляли и для солюбилизации кристаллов формазана в лунки вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера ELISA при 570 нм. Анализ проводили трижды для расчета среднего значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) и стандартного отклонения.

Электрофорез и вестерн-блот-анализ содержания целевых белков в лизатах клеток цельной крови и фибробластов

Для анализа относительного содержания исследуемых белков в лизатах клеток цельной крови и фибробластов кожи с/без заражения вирусной конструкцией образцы разделяли методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) [15]. Мембраны инкубировали со специфичными первичными антителами (anti-Surf1 (Abcam; ab110256, 1: 1000), anti-MTCO1 (Abcam; ab14705, 1 : 1000) с последующей инкубацией со вторичными антивидовыми HRP-связанными антителами. Сигналы анализировали с помощью реакции усиленной хемилюминесценции с использованием набора Novex™ ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit (INVITROGEN, США) в соответствии с инструкциями производителя. Нормализовали сигнал от белков интереса на содержание общего белка, определенное по интенсивности окрашивания при помощи красителя Понсо (0,5% в 1%-й уксусной кислоте).

Оценка уровня экспрессии целевых генов в лизатах фибробластов после трансфекции

Экспрессию генов оценивали методом обратной транскрипции (ОТ) в реальном времени с использованием ПЦР с применением специфических для транскриптов праймеров (табл. 1). Выделение и анализ чистоты РНК проводили, как описано выше. Для проведения ОТ к 0,5 мкг тотальной РНК добавляли 2 мкл 20 мкМ случайного гексапраймера и инкубировали 2 мин при 70 °С. Затем пробирку переносили в лед, добавляли 4 мкл 5× ОТ-буфера, 2 мкл 10 мМ смеси dNTP, 2 мкл 20 мМ DTT, 1 мкл обратной транскриптазы MMLV (50 ед/мкл) («Евроген», Россия). Смесь инкубировали 40 мин при 40 °C и останавливали реакцию прогреванием в течение 10 мин при 70 °C. Последующую ПЦР в реальном времени проводили по схеме: 50 нг кДНК матрицы, по 0,4 мкл прямого и обратного праймера (100 пмоль), 2 мкл 5хqPCRmixHS SYBR. Контроль амплификации проводили с помощью электрофореза в 3%-м агарозном геле. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы QGENE (2-ΔCt метод). Нормировку экспрессии каждого целевого гена проводили на ген глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (GAPDH). В ходе работы были подобраны праймеры, специфичные к транскриптам соответствующих генов (табл. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Относительное содержание белков SURF1 и MTCO1 в клетках венозной крови 20 пациентов детского возраста (3–11 лет) без митохондриальных патологий (группа «контроль») было определено при помощи вестерн-блотанализа, данные для референсных значений представлены на рис. 1. Показано, что относительное содержание исследуемых белков снижено у пациентов с мутациями в гене SURF1 по сравнению с контрольной группой.

Для определения безопасности генотерапевтического воздействия по результатам исследования зависимости жизнеспособности клеток от количества внесенных вирусных частиц было рассчитано, что доза в 104 на клетку является оптимальной (рис. 2). Далее к фибробластам, полученным из кожи пациента с мутацией в гене SURF1, и к контрольным фибробластам был добавлен аденовирусный конструкт c нормальным аналогом гена SURF1 в подобранной оптимальной дозе, не приводящей к ухудшению жизнеспособности клеток в МТТ-тесте.

Экспрессию генов SURF1 и MTCO1 в лизатах фибробластов после заражения клеток AAV9-SURF1 оценивали при помощи количественной ПЦР. Во-первых, нами было выявлено, что в фибробластах, полученных от пациентов без мутаций в гене SURF1 значительно выше уровень экспрессии этого гена по сравнению с фибробластами больных с синдромом Ли и мутациями в гене SURF1 (рис. 3, левая панель). При этом оказалось, что уровень экспрессии гена MTCO1 достоверно не отличается от такового для фибробластов больных и участников контрольной группы (рис. 3, правая панель). Во-вторых, уровень экспрессии гена SURF1 достоверно растет в фибробластах от пациентов с мутациями и достоверно не отличается от уровня экспрессии этого гена под действием генотерапевтического конструкта в контрольных фибробластах. Аналогичную картину мы наблюдали для гена MTCO1 — достоверный рост под действием трансфекции в больных фибробластах по сравнению с уровнем до трансфекции. Любопытно, что уровень экспрессии гена MTCO1 после трансфекции кратно выше исходного как для больных, так и для здоровых клеток (рис. 3).

При анализе содержания целевых белков после воздействия генотерапевтического конструкта нами были выявлены существенные различия между контрольными клетками и подкожными фибробластами пациента с мутацией SURF1. Методом вестерн-блот-анализа мы оценили изменения в относительном количестве исследуемых белков и показали, что через 24 ч после внесения вируса в культуральную среду как для клеток дикого типа, так и для мутантов по гену SURF1 наблюдается достоверное увеличение уровня белка (p < 0,05), но для фибробластов от пациентов с мутацией это увеличение более выражено (рис. 4, левая панель). Показано также, что исходный уровень белка SURF1 в клетках дикого типа значительно выше, чем в мутантных клетках. Что касается белка MTCO1, исходно значительно более представленного в клетках дикого типа, увеличения его экспресии под действием вируса не наблюдается в контрольных фибробластах, в то время как для клеток пациентов с мутацией SURF1, уровень MTCO1 достоверно возрастал через 24 ч после добавления вируса к клеткам (рис. 4, правая панель) и даже превышает уровень белка в клетках дикого типа (p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В рамках общепринятой концепции о том, что белок SURF1 играет критическую роль в сборке голофермента цитохромоксидазы (ЦО), с механистической точки зрения, можно предположить, что потеря белка SURF1 влияет на активность ЦО посредством стабилизации структуры мультибелкового комплекса в митохондриальной мембране [15]. При манифестации синдрома Ли у пациентов с мутациями в гене SURF1 обычно сохраняется не более 20% активности ЦО, в то время как для модельных животных с нокаутом по этому гену остается не менее 50% активности фермента, что и приводит к такой значительной (до 30%) разнице между фенотипами пациентов с синдромом Ли и мышами с дефицитом белка SURF1 [12]. Однако, хотя использование таких моделей не кажется перспективным ввиду наблюдающихся фенотипических различий, применение генотерапии при помощи вектора на базе AAV9-SURF1 все же привело к значительному росту активности цитохромоксидазы в головном мозге, мышцах и печени SURF1-дефицитных мышей [12], что дает основания предполагать возможность увеличения активности этого фермента и улучшения состояния у пациентов с синдромом Ли, обусловленным аналогичными мутациями в гене SURF1.

В нашей модели, где сравнивали эффект трансфекции при помощи AAV9-SURF1 фибробластов пациентов с клинически выставленным синдромом Ли и фибробластов здоровых детей, мы ставили задачу определить уровень экспрессии не только белка SURF1, но и MT-CO1, который обычно используют в качестве маркера уровня содержания и нативной структуры всей цитохромоксидазы. В нашей работе мы наблюдали синхронный подъем уровня экспрессии как генов, так и белков Surf1 и MT-CO1

в фибробластах больных. Ранее наблюдавшиеся исследователями тенденции улучшения состояния модельных животных при аналогичных изменениях в ответ на генотерапию позволяют предположить возможность увеличения активности цитохромоксидазы в клеточных моделях. Измерение активности этого фермента в ответ на трансфекцию клеток первичных культур пациентов с синдромом Ли представляется важным этапом доклинических исследований предлагаемого препарата на базе аденовирусной конструкции. Предложенный подход исследования эффективности генотерапии на клетках пациентов лишен недостатков мышиной модели, где для выявления эффекта, по мнению исследователей, необходимо создание более тяжелого фенотипа ввиду отсутствия поведенческих дефектов и нейромоторных нарушений. Ранее было показано, что у имеющихся модельных животных манифестация заболевания в легкой форме обусловлена активацией компенсаторных механизмов у выживших особей при естественной селекции, в отличие от человека, где врачебная помощь приводит к выживанию даже при манифестации тяжелой формы заболевания [10].

ВЫВОДЫ

Полученная конструкция AAV9-hSURF1 позволяет осуществить безопасную трансфекцию в дозе, уже через 24 ч приводящую к возможности регистрации достоверного кратного увеличения экспрессии как генов, так и белков SURF1 и MTCO1 в клетках пациентов с синдромом Ли с исходно низким содержанием этих белков по сравнению с клетками здоровых людей.