Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR — ключевой регулятор роста клеток, его дисрегуляция вовлечена в онкогенез. Существующие способы оценки активности mTOR имеют недостатки дизайна. Целью работы было разработать и провести валидацию новой мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ-тест-системы для относительного количественного анализа экспрессии гена mTOR с нормализацией на гены RPLP0 и TBP. Праймеры и зонды сконструированы in silico. Валидацию проводили на клеточной линии стромальных клеток костного мозга человека SCP-1. Специфичность оценивали в 10 сепарированных и 10 мультиплексных постановках. Аналитическую чувствительность и эффективность определяли по 27 техническим повторам с использованием протокола без элонгации. Специфичность амплификации оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле, а количественный анализ выполняли в режиме реального времени по каналам флуоресценции FAM (mTOR), HEX (RPLP0) и ROX (TBP). Тест показал 100%-ю специфичность. Стабильная детекция достигалась при 125 тыс. клеток/мл. Эффективность амплификации составила 73–81%. Вариация экспрессии mTOR, нормализованной на RPLP0, составила от –21,5 до 26,4%, по TBP от –14,3 до 19%. Нормализация на среднее геометрическое двух генов обеспечила лучшую воспроизводимость от –9 до 23,4%. Разработанный тест отличается высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью, что делает его надежным инструментом для последующих клинических исследований.